研究卵巢切除小鼠模型中子宫对妊娠建立的贡献的方法

摘要

怀孕的建立是一个动态的过程，涉及复杂的胚胎和子宫串扰。母体子宫环境对这些过程的确切贡献仍然是一个活跃的研究领域。在这里，提供了详细的协议来帮助设计 体内 动物模型来解决这些研究问题。

摘要

为了确定怀孕，一个可行的囊胚必须成功地与接受性子宫内膜（子宫内膜）相互作用，以促进植入和胎盘形成，并使持续妊娠成为可能。胚胎缺陷引起的妊娠成功的局限性是众所周知的，并且随着 体外 受精（IVF）和辅助生殖技术的兴起，近几十年来已在很大程度上克服了这些限制。然而，到目前为止，该领域尚未克服子宫内膜接受不足造成的限制，从而导致试管婴儿成功率停滞不前。卵巢和子宫内膜功能紧密交织在一起，因为卵巢产生的激素负责子宫内膜的月经周期性。因此，当使用啮齿动物怀孕模型时，很难确定观察到的结果是由于卵巢或子宫缺陷。为了克服这个问题，开发了一种具有胚胎移植或人工蜕膜化的卵巢切除小鼠模型，以允许研究子宫对怀孕的特异性贡献。本文将提供有关如何进行卵巢切除术的说明，并提供有关提供外源性激素的各种技术的见解，以支持健康供体胚胎移植后成功的人工蜕膜化或怀孕。这些技术包括皮下注射、缓释微丸和渗透微型泵。将讨论每种方法的主要优点和缺点，使研究人员能够为其特定的研究问题选择最佳的研究设计。

引言

近几十年来，随着辅助生殖技术的使用越来越多，许多受孕障碍已被克服，尽管存在生育问题，但仍允许许多夫妇组建家庭¹。卵母细胞或精子缺陷通常可以通过 体外 受精或卵胞浆内单精子注射来绕过;然而，与子宫和子宫内膜容受性有关的问题仍然是生殖潜力难以捉摸的"黑匣子"²。

当高质量的胚胎成功地与感受性子宫内膜（子宫内膜）相互作用时，就建立了怀孕。在任何给定的月经周期中成功怀孕的机会都很低，约为 30%^3，4。在成功的妊娠中，只有50%-60%的人在妊娠20周后提前，植入失败是75%未达到20周的妊娠的原因³。尽管这些数字可以追溯到1990年代后期，但该领域尚未克服子宫内膜接受能力不足造成的限制。这导致近年来试管婴儿成功率停滞不前 - 有时甚至下降 - 5^，6。

患有不明原因不孕症的女性通常有一个移位的接受窗口，或者由于未知原因无法实现接受。最近，开发了子宫内膜容受性阵列，该阵列评估了数百个基因的表达，目的是根据个体的^{接受性窗口}调整胚胎移植的时间7，^8，9。然而，该领域仍然缺乏对植入过程完成后出现的妊娠并发症的发病机制的理解。

女性生殖系统是高度动态的，并受到严格的荷尔蒙控制。下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴控制黄体生成素和卵泡刺激素的释放，它们调节卵巢周期的各个方面，包括卵泡成熟以及雌激素和孕激素活性。反过来，子宫月经周期由雌激素和黄体酮^10，11调节。因此，研究子宫生物学机制因卵巢的影响而变得复杂。例如，在研究癌症疗法如何影响子宫时，很难区分观察到的任何子宫表型（例如妊娠丢失或月经不合时宜）是对子宫的直接侮辱还是卵巢损伤的间接影响。

为了全面了解生育能力，必须表征子宫对怀孕的贡献。重要的是，这种理解必须超越卵巢控制下的子宫功能。这不能在人类身上研究;因此，经常使用动物模型。因此，卵巢切除术（OVX）通常用于使研究人员能够通过外源性提供激素来调节啮齿动物发情周期（类似于月经周期）。此外，OVX允许独立于卵巢影响¹²研究子宫反应。然而，如果在OVX后没有立即提供激素，就会出现更年期表型，这需要研究人员仔细考虑。

OVX经常用于啮齿动物模型¹³，^14，15，^16，17，并且在经过充分训练后相对容易执行。方法取决于是单独切除卵巢还是切除卵巢和输卵管，以及动物的年龄（成年，循环动物的卵巢较大，表面有可见的黄体，这意味着它们的卵巢更容易可视化）。同样，存在许多激素补充方法，包括皮下注射¹⁴，缓释微丸15，渗透压微型泵¹⁸和卵巢移植。

在本文中，提供了有关如何进行卵巢切除术和准备三种激素补充剂的详细说明，包括皮下注射、缓释丸和渗透迷你泵。为受益于OVX的实验终点提供了两种详细的方案，然后是外源性激素补充（胚胎移植和人工蜕膜化）。本文讨论了每种方法的优缺点，目的是指导研究人员如何进行研究以隔离对子宫的影响，特别是在怀孕和生育研究领域。

研究方案

所有动物都被饲养在温度控制，高屏障设施（莫纳什大学动物研究实验室）中，免费提供食物和水，并进行12小时的明暗循环。所有程序均根据莫纳什动物研究平台伦理委员会（#21908，17971）的批准执行，并按照国家卫生和医学研究委员会动物护理和使用业务守则执行。

1. 手术准备

1. 在121°C的硬/干货循环中高压灭菌手术所需的所有手术器械，纱布和纸巾，保持时间为30分钟，干燥时间为30分钟。
2. 为手术工作区布置无菌工作台垫并准备镇痛药。
   1. 将卡洛芬在无菌盐水中稀释至 1 mg/ml，将布比卡因在无菌盐水中稀释至 0.5% （w/v） 溶液。
   2. 将 3.5 mL 美洛昔康加入 400 mL 笼式水瓶中。
3. 预热恢复笼的加热垫，并设置加热灯以间接照射恢复的动物。
4. 确保穿戴所有适当的个人防护用品，包括发网、口罩、防护服和手套。
5. 练习良好的无菌技术，包括定期用乙醇喷洒手套，并在处理动物或手术工具之前让它们蒸发，以避免乙醇污染。

2. 进行卵巢切除术

1. 使用含有异氟醚的气体麻醉机，以5%异氟醚预填充诱导盒3-5分钟，流速设置为4L / min。
2. 将鼠标放在感应盒内，一旦失去知觉，将其移动到鼻锥上，并将流速降低到 0.4 L/min，异氟烷蒸发器设置为 ~2.5%。
   注意:用于其余程序的异氟醚的百分比根据小鼠品系，年龄和暴露于治疗（例如化疗）而变化，应根据对每只动物呼吸模式的密切评估进行调整。呼吸模式应保持为常规腹式呼吸。快速的胸腔呼吸可能表明尚未到达或维持深部手术平面;在这种情况下，根据需要调整异氟醚蒸发器的百分比。
3. 通过挤压管子并轻轻轻拍眼睛来大量涂抹眼睛润滑剂。
4. 在脊柱驼背处和下方剃除一小块（2 厘米 x 2 厘米）区域。
5. 从 1 mg/mL 的稀释溶液中皮下注射 5 mg/kg 卡洛芬。
6. 通过捏住鼠标的后脚趾来用脚趾捏反射测试麻醉深度。如果没有脚趾捏伤反应，动物处于深部手术平面，手术可以继续。
7. 将贝塔定涂在手术区域，并用手术布（一块切出 2 厘米 x 2 厘米窗口的纱布）覆盖。
8. 使用鼠齿镊子，向上拉背部驼背处的皮肤，并做一个~5毫米的纵向切口。
   注意:在动物背部的这个高度处的皮肤切口最适合手术夹子放置，以减少动物取下夹子并需要夹子维修的机会。
9. 使用钝钳，继续钝化地解剖皮肤，远离下面的肌肉层，向下移动到一侧朝向肾脏。
10. 通过肌肉壁直观地识别肾脏、卵巢和卵巢脂肪垫。
    注意:肾脏会呈现深红色，脂肪垫会呈现亮白色，如果可见，卵巢会看起来像脂肪垫内的一个小粉红色点。
11. 使用镊子，抓住并抬起肌肉层。用锋利的手术剪刀做一个~0.5-1厘米的切口。继续用镊子握住肌肉壁，从剪刀换成钝钳，将卵巢脂肪垫拉过切口。
12. 使用弯曲的持针器，夹在子宫角远端的卵巢和输卵管下方。
    注意:或者，可以单独切除卵巢，保持输卵管完好无损。然而，需要解剖显微镜来准确观察卵巢和输卵管之间的区别。
13. 用剪刀或手术刀取出卵巢。继续钳夹30秒以避免出血过多。
14. 取下夹子，必要时用无菌纱布轻拍。
15. 要关闭肌肉壁切口，请使用镊子抬起切口的顶部，使切口自然地拉在一起。
16. 使用丝线缝合线（尺寸 3-0）用外科医生的结闭合肌肉壁切口。
17. 使用不带针头的 1 mL 注射器局部涂抹两至三滴布比卡因，并在另一侧重复步骤 2.9-2.17。
18. 要闭合皮肤切口，请用纱布轻拍多余的布比卡因，然后将皮肤的两侧按压在一起。
19. 使用一到两个 7 毫米的手术夹，为肿胀留出空间作为愈合过程的一部分。
20. 将鼠标移动到恢复笼中，并密切监视15分钟。
    注意:动物应该很快醒来;请务必密切监测呼吸，以确保胸部呼吸模式正常。

3.激素制备:皮下注射

1. 制成 1 mg/mL 的雌二醇储备溶液。
   1. 称取 0.001 g （1 mg） 雌二醇粉末到 1.5 mL 无菌管中。
   2. 向管中加入 1 mL 100% 乙醇，涡旋几秒钟。
      注意:乙醇将保持透明，并带有可见的雌二醇粉末斑点。
   3. 用薄膜包裹管子以防止任何乙醇蒸发。
   4. 用铝箔包裹管子，并将其放在摇臂上过夜，以完全溶解雌二醇粉末。
   5. 将该 1 mg/mL 储备液在芝麻油中稀释至所需的最终浓度。
      注意:在人工蜕膜化之前，启动需要 100 ng 的剂量 3 天，给予黄体酮时需要额外的低剂量 25 ng。这是为了对抗控制黄体酮受体表达的反馈回路。对于胚胎移植，需要在胚胎移植前的第1天和第3天在第4天进行两剂100ng。在胚胎移植时，还需要25ng的低剂量。
   6. 将所需量的油中雌二醇吸入 1 mL 注射器中，然后连接 26 G 针尖。
   7. 以所需的频率皮下注射适当剂量（在肚子或侧腹;100 ng/100 μL 或 25 ng/100 μL 用于在胚胎移植或人工蜕膜化之前或在胚胎移植时启动）。
      注意:油非常粘稠，因此请务必缓慢注入并暂停几秒钟，然后再取出针头。这将最大限度地减少从注射部位泄漏的油量。
2. 制作 200 mg/mL 黄体酮储备溶液。
   1. 称取 0.4 g（400 mg）黄体酮粉放入 5 mL 无菌管中。
   2. 向管中加入 2 mL 的 100% 乙醇，涡旋几秒钟。
      注意:乙醇将变成白色。
   3. 重复步骤 3.1.3-3.1.4。
   4. 将 200 mg/mL 的芝麻油原液稀释至所需的最终浓度。
      注意:每天需要2毫克的剂量来支持胚胎移植。
   5. 按照步骤3.1.6-3.1.7皮下注射适当剂量（例如，每天2mg / 100μL以支持怀孕）。

4.激素制备:缓释丸

1. 在层流或II类生物安全罩的表面上铺设箔片。
2. 将所有设备（手套，培养皿，1mL注射器，细镊子）放入罩中，并打开UV20分钟。
   注意:请勿在引擎盖内使用密封剂打开紫外线，因为它会凝固。
3. 用100%乙醇清洗硅橡胶管，并在引擎盖中风干。干燥后，沿着管子标记~1厘米的长度，并用手术刀切割。
4. 从注射器中取出柱塞，并挤入~200μL密封剂。更换柱塞，并从注射器中挤出少量密封剂。
5. 在管子的一端涂抹少量密封剂，然后用戴手套的手指将其抚平。
6. 在引擎盖内的紫外线下干燥过夜或干燥 20-30 分钟。
7. 将适量的黄体酮倒入无菌培养皿中。用镊子将颗粒舀入黄体酮粉末中以填充颗粒。
   1. 在罩表面上轻敲颗粒的密封端，将黄体酮冷凝下来。或者，使用灭菌镊子的末端将黄体酮塞下来。留出足够的空间来容纳更多的密封剂。
8. 用密封剂密封开口端，如步骤3.4-3.5中所述。
9. 将含有黄体酮颗粒的培养皿包裹在箔纸中以保护其免受光照。
10. 通过在37°C下在1%木炭剥离的FCS（cs-FCS:PBS）中孵育，在皮下插入之前激活颗粒至少72小时。
    注意:颗粒可以提前用单个密封端散装制作。但是，每次都应使用新鲜的黄体酮来填充它们。确保预制颗粒在填充黄体酮之前经过紫外线消毒。颗粒将分泌~500μg/天，持续6-10天，这足以支持人工蜕膜化和胚胎移植程序，尽管可能需要额外的低剂量雌激素注射以维持黄体酮受体活性超过4-5天。超过 10 天后，可能需要更换黄体酮颗粒。

5.激素制备:渗透迷你泵

1. 在水溶液中制备所需浓度的黄体酮，并选择合适的小型渗透泵型号（参见 材料表）。
   注意:对于第7节（实验程序:胚胎移植），需要交付2毫克/天，持续12天。因此，将28mg黄体酮溶解在每只动物~100μL无菌水中（按照制造商的特定体积说明）。可能需要连续稀释。对于第8节（实验程序:人工蜕膜化），需要每天输送500μg，持续3天。因此，将 1，500 μg 黄体酮溶解在每只动物 ~100 μL 无菌水中。准备额外的溶液以解决灌装过程中损失的体积。
2. 在II类生物安全罩内设置设备（手套，低绒湿巾，培养皿，无菌盐水，1 mL注射器，小型称重船，箔纸和精确到0.01 g的秤），然后打开紫外线20分钟。
3. 将激素溶液吸入 1 mL 注射器中，然后连接无菌填充管，小心确保没有气泡。
4. 在无菌称重舟内称量泵及其流量调节器。
5. 将填充管插入泵顶部的开口，直到它不能再进一步。
6. 保持泵直立，缓慢推动注射器的柱塞以填充管子。
   注意:应避免快速填充，因为这会将气泡引入泵中。
7. 当溶液从泵顶部溢出时，轻轻取出填充管，然后用无菌低绒擦拭擦拭多余的溶液。
8. 将流量调节器插入泵顶部的开口，直到它不能再进一步。完全进入后，用力将泵和流量调节器压在一起。
9. 在流量调节器就位的情况下称量填充的泵。
   注意:从步骤5.3和步骤5.8获得的重量差将给出上样溶液的净重（即，增加0.1g= 100μL添加的溶液）。
10. 将填充的泵放入装有无菌盐水的无菌培养皿中。
11. 一旦所有泵都装满，将培养皿包裹在箔纸中，并将其放入37°C培养箱中以启动至少4-6小时（或直到准备使用）。

6.外科手术:插入皮下激素颗粒和微型泵

1. 按照第1节（手术准备）准备该区域。
2. 按照步骤2.1-2.3麻醉动物。
3. 在颈部的肚子处刮一小块区域（~1 厘米 x 1 厘米）。
4. 从 1 mg/mL 的稀释溶液中在腿侧皮下注射 5 mg/kg 卡洛芬。
5. 测试脚趾捏反射。如果没有反射，动物处于深外科平面，手术可以开始。
6. 将甜菜碱涂抹在手术区域，并用手术布（一块切出2厘米x 2厘米窗户的纱布）覆盖。
7. 使用鼠齿镊子，向上拉颈部肋部的皮肤（真正的肮脏和背部的驼背之间的中间），并做一个~5毫米的纵向切口。
8. 使用钝钳，钝性钝钳向下解剖皮肤，远离下面的肌肉层。
   注意:对于渗透迷你泵插入，沿动物的一侧创建一个口袋，以便泵不会限制动物的运动或向上压在切口部位。
9. 一旦为激素颗粒或微型泵留出足够的空间，使用无菌镊子拾取颗粒或微型泵，并将其插入用钝性解剖制成的皮下袋中。
10. 要关闭皮肤切口，请确保颗粒或迷你泵足够远地进入口袋，以便手术夹不会损坏它。
11. 按照步骤2.17局部应用布比卡因。
12. 用一个手术夹闭合伤口。将鼠标移动到恢复笼中，并密切监视15分钟。由于这是一个简短的过程，动物应该在几分钟内走动。

7. 实验程序:胚胎移植

1. 对于卵巢切除的动物，在胚胎移植前3天通过皮下注射100ng / 100μL雌二醇（步骤3.1）进行激素-prime。
2. 在胚胎移植前一天，用皮下注射2mg / 100μL醋酸甲羟孕酮（步骤3.2）对动物进行激素灌注。
3. 按照第1节（手术准备）准备该区域。
4. 按照步骤2.1-2.3麻醉动物。
5. 按照步骤2.4-2.10开始该过程。
6. 在解剖显微镜下，用26 G针尖创建一个宫内注射点。
7. 将五个囊胚移入M2介质滴液中，然后将其转移到子宫角中。
8. 要关闭肌肉壁切口，请使用镊子抬起切口的顶部，使切口自然地拉在一起。
9. 使用丝线缝合，用外科医生的结闭合肌肉壁部位。局部滴注布比卡因。
10. 在另一侧重复步骤7.5-7.8。
11. 要闭合皮肤切口，请用纱布轻拍多余的布比卡因，然后将皮肤的两侧按压在一起。
12. 使用一到两个手术夹，为肿胀留出空间作为愈合过程的一部分。
    注意:如果动物被卵巢切除，胚胎移植时需要外源性激素。皮下注射黄体酮（2mg）或插入皮下孕酮颗粒或渗透迷你泵。为了对抗过量的黄体酮，在胚胎移植时需要皮下注射低剂量（25ng / 100μL）雌激素。
13. 小心地将鼠标带到恢复笼中，并密切监视15分钟。
    注意:动物应该很快醒来;请务必密切监测呼吸，以确保胸部呼吸模式正常。

8.实验程序:人工蜕膜化

1. 在第1天，第2天和第3天，按照人工蜕膜化前8天的第3节（激素制备:皮下注射）对动物进行激素灌注。
2. 在第7天，第8天和第9天，按照人工蜕膜化前2天的第3节（激素制备:皮下注射）对动物进行激素灌注。
   注意:在人工蜕膜化程序之前，最后一次注射必须至少3小时（最多4小时）。
3. 激素主要动物皮下黄体酮沉淀或微型渗透泵（500μg/天），根据第4节，第5节和第8节，在人工蜕膜化前2天。
4. 按照第1节（手术准备）准备该区域。
5. 按照步骤2.1-2.2麻醉动物。
6. 用脚趾捏反射测试麻醉深度。如果没有脚趾捏伤反应，动物处于深部手术平面，手术可以继续。
7. 将鼠标置于俯卧位，抬起尾巴，然后慢慢将直径为6毫米的窥器插入阴道。
8. 在将动物的鼻子保持在麻醉鼻锥中的同时，将动物的下半身放在非惯用手的第一和第二手指之间。用拇指轻轻向上推尾巴，以保持阴道口清晰可见。
9. 使用非手术胚胎移植尖端（连接到 20 μL 移液器）将 20 μL 芝麻油转移到一个子宫角中。
   1. 保持移液器与阴道开口水平，将尖端插入阴道并通过子宫颈插入子宫角。一旦尖端进入子宫角，轻轻地将尖端按压在子宫内膜表面（如果使用上面的处理技术，这种运动会感觉到第二根手指），然后慢慢排出油。
      注意:保持移液器柱塞向下，等待 10 秒以确保所有油都已分散，并在按住柱塞的同时慢慢取出转移尖端。
10. 从阴道中取出窥器。
11. 小心地将鼠标带到恢复笼中，并密切监视15分钟。
    注意:动物应该很快醒来。密切监测他们的呼吸，以确保正常的胸腔呼吸模式。
12. 限制动物的处理，并在手术后将它们保持在安静的环境中96小时。
    注意:响亮的噪音或明暗周期的突然变化会影响手术的成功。在组织解剖时，蜕膜化的成功程度可以用子宫重量与体重的比率来衡量。人工蜕膜化程序的成功率为 80%。因此，排除未能蜕膜化的动物，并在为实验选择样本量时将其考虑在内。

9. 外科手术:术后恢复、监测和夹子修复

1. 让动物在一夜之间恢复半开半关的加热垫，然后再将它们放回家笼。
2. 手术后5天每天监测动物，密切注意伤口部位是否有感染迹象。
3. 如有必要，执行剪辑修复。
   1. 按照第1节（手术准备）准备该区域。
   2. 按照步骤2.1-2.3麻醉动物。
   3. 如果现有剪辑仍然存在，请使用剪辑去除器删除该剪辑。
   4. 按照步骤2.19-2.21应用新的手术夹。
4. 按照步骤9.3.1-9.3.3在手术后7天或当动物下一次麻醉时（例如胚胎移植，人工蜕膜化程序或手术后的皮下注射）取出手术夹。

结果

本协议论文描述了一个特征良好的人工蜕膜化模型（图1A）。在这里，年轻的成年雌性小鼠（8周龄）接受了第1节和第2节所述的手术卵巢切除术。然后将小鼠休息2周，以确保内源性卵巢激素消散，然后再用外源性激素支持，如第3-7节和第9节所述。通过阴道内注射芝麻油诱导人工蜕膜化，然后将动物休息直至组织收集，如第9节所述。在这项研究中，在C57BL6 / J...

讨论

本文提供了有关如何进行 OVX 的分步说明，并为专注于了解子宫对怀孕和生育能力的贡献的研究提供外源性激素。在这些方法的两个实验应用中提供了两个详细的方案，包括进行胚胎移植和人工诱导蜕膜化。

虽然最初执行OVX可能具有挑战性 - 特别是对于刚接触啮齿动物模型的研究人员 - 但一旦经过适当的训练和实践，这是一个相对简单的过程。手术中的关键步骤包括在麻醉下...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ALZET 1002 mini osmotic pumps	BioScientific	1002	Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure - Embryo transfer).
ALZET 1003D mini osmotic pumps	BioScientific	1003D	Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure - Artificial decidualization).
ALZET Reflex 7 mm clips	BioScientific	0009971	Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip applicator	BioScientific	0009974	Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip remover	BioScientific	0009976	Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
Bupivicaine injection	Pfizer	NA	Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline
Estradiol	Sigma	E8875
Meloxicam	Ilium	NA	Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 400 mL cage water bottle, or as your institution's vet prescribes.
Michel clips	Daniels	NS-000242
Multi purpose sealant	Dow Corning	732
Non-surgical embryo transfer (NSET) device	ParaTechs	60010	Contains 6 mm speculum. Single use only.
Progesterone	Sigma	P0130	Soluble in ethanol. Use for  section 3 (Hormone preparation - subcutaneous injection) and  section 4 (Hormone preparation - slow-release pellets)
Progesterone	Sigma	P7556	Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation - osmotic mini pumps)
Refresh eye ointment	Allergan	NA	42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin
Rimadyl Carprofen	Zoetis	NA	Stock 50 mg/mL. Use at 1 mg/ml (for 5 mg/kg dose)
Rubber tubing	Dow Corning	508-008	Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ±  0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm.
Sesame oil	Sigma	S3547
Sofsilk Silk sutures size 3-0	Covidien	GS-832