Méthodes d’étude des contributions utérines à l’établissement de la grossesse dans un modèle murin ovariectomisé

Résumé

L’établissement de la grossesse est un processus dynamique impliquant une diaphonie embryonnaire et utérine complexe. Les contributions précises de l’environnement utérin maternel à ces processus restent un domaine de recherche actif. Ici, des protocoles détaillés sont fournis pour aider à concevoir des modèles animaux in vivo pour répondre à ces questions de recherche.

Résumé

Pour qu’une grossesse soit établie, un blastocyste viable doit interagir avec succès avec une muqueuse utérine réceptive (endomètre) pour faciliter l’implantation et la formation de placenta et permettre la poursuite de la grossesse. Les limites au succès de la grossesse causées par des anomalies embryonnaires sont bien connues et ont été largement surmontées au cours des dernières décennies avec l’essor de la fécondation in vitro (FIV) et des technologies de procréation assistée. Jusqu’à présent, cependant, le domaine n’a pas surmonté les limitations causées par un endomètre insuffisamment réceptif, ce qui entraîne une stagnation des taux de réussite de la FIV. Les fonctions ovarienne et endométriale sont étroitement liées, car les hormones produites par l’ovaire sont responsables de la cyclicité menstruelle de l’endomètre. En tant que tel, lors de l’utilisation de modèles de grossesse chez les rongeurs, il peut être difficile de déterminer si un résultat observé est dû à un déficit ovarien ou utérin. Pour surmonter cela, un modèle murin ovariectomisé a été développé avec transfert d’embryons ou décidualisation artificielle pour permettre l’étude des contributions spécifiques utérines à la grossesse. Cet article fournira des instructions sur la façon d’effectuer une ovariectomie et offrira un aperçu de diverses techniques pour fournir des hormones exogènes afin de soutenir une décidualisation artificielle ou une grossesse réussie après le transfert d’embryons de donneurs sains. Ces techniques comprennent l’injection sous-cutanée, les pastilles à libération lente et les mini-pompes osmotiques. Les principaux avantages et inconvénients de chaque méthode seront discutés, ce qui permettra aux chercheurs de choisir le meilleur plan d’étude pour leur question de recherche spécifique.

Introduction

Avec l’utilisation croissante des technologies de procréation assistée au cours des dernières décennies, de nombreux obstacles à la conception ont été surmontés, permettant à de nombreux couples de fonder une famille malgré les problèmes de fertilité¹. Les déficits ovocytaires ou spermatozoïdes peuvent souvent être contournés par fécondation in vitro ou injection intracytoplasmique de spermatozoïdes; Cependant, les problèmes liés à la réceptivité de l’utérus et de l’endomètre restent une « boîte noire » insaisissable du potentiel reproducteur².

La grossesse est établie lorsqu’un embryon de haute qualité interagit avec succès avec un endomètre réceptif (muqueuse utérine). Les chances de réussite de la grossesse dans un cycle menstruel donné sont faibles, à environ 30%^3,4. Parmi celles qui réussissent, seulement 50% à 60% avancent au-delà de 20 semaines de gestation, l’échec de l’implantation étant responsable de 75% des grossesses qui n’atteignent pas 20 semaines³. Malgré ces chiffres datant de la fin des années 1990, le domaine n’a pas encore surmonté les limites causées par un endomètre insuffisamment réceptif. Cela a entraîné une stagnation - et parfois une baisse - des taux de réussite de la FIV au cours des dernières années ^5,6.

Les femmes souffrant d’infertilité inexpliquée ont souvent une fenêtre de réceptivité déplacée ou sont incapables d’atteindre la réceptivité pour des raisons inconnues. Récemment, le réseau de réceptivité de l’endomètre a été développé, qui évalue l’expression de centaines de gènes dans le but d’adapter le moment du transfert d’embryons à la fenêtre de réceptivité d’un individu ^7,8,9. Cependant, le domaine manque encore de compréhension de la pathogenèse des complications de la grossesse qui se manifestent après la fin du processus d’implantation.

Le système reproducteur féminin est très dynamique et sous contrôle hormonal étroit. L’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique (HPG) contrôle la libération de l’hormone lutéinisante et de l’hormone folliculo-stimulante, qui régulent les aspects du cycle ovarien, y compris la maturation des follicules et l’activité des œstrogènes et de la progestérone. À son tour, le cycle menstruel utérin est régulé par les œstrogènes et la progestérone^10,11. Ainsi, l’étude des mécanismes biologiques utérins est compliquée par l’influence ovarienne. Par exemple, lorsque l’on étudie l’impact des thérapies anticancéreuses sur l’utérus, il peut être difficile de distinguer si un phénotype utérin observé (comme une perte de grossesse ou une acyclique menstruelle) est le résultat d’une insulte directe à l’utérus ou d’un effet consécutif de dommages aux ovaires.

Pour bien comprendre la fertilité, les contributions utérines à la grossesse doivent être caractérisées. Il est important de noter que cette compréhension doit s’étendre au-delà de la fonction utérine sous contrôle ovarien. Cela ne peut pas être étudié chez l’homme; Par conséquent, des modèles animaux sont souvent utilisés. En tant que telle, l’ovariectomie (OVX) est couramment utilisée pour permettre aux chercheurs de réguler les cycles œstraux des rongeurs (analogues au cycle menstruel) en fournissant des hormones exogènes. De plus, OVX permet d’étudier les réponses utérines indépendamment de l’influence ovarienne¹². Cependant, si les hormones ne sont pas immédiatement fournies après OVX, un phénotype de ménopause finira par apparaître, ce qui doit être soigneusement examiné par les chercheurs.

OVX est fréquemment utilisé dans les modèles de rongeurs 13,14,15,16,17 et est relativement facile à réaliser après un entraînement adéquat. Les méthodes varient selon que l’ovaire seul ou l’ovaire et l’oviducte sont enlevés, ainsi que selon l’âge de l’animal (adultes, les animaux cyclistes ont des ovaires plus gros avec un corps jaune visible à leur surface, ce qui signifie que leurs ovaires sont plus faciles à visualiser). De même, de nombreuses méthodes de supplémentation hormonale existent, notamment les injections sous-cutanées¹⁴, les pastilles à libération lente 15, les minipompes osmotiques¹⁸ et la greffe ovarienne.

Dans cet article, des instructions détaillées sont fournies sur la façon d’effectuer une ovariectomie et de préparer trois types de supplémentation hormonale, y compris les injections sous-cutanées, les granulés à libération lente et les mini-pompes osmotiques. Deux protocoles détaillés sont fournis pour les critères expérimentaux qui bénéficient d’OVX suivi d’une supplémentation en hormones exogènes (transfert d’embryons et décidualisation artificielle). Cet article traite des forces et des faiblesses de chaque approche dans le but de guider les chercheurs sur la façon de mener des études pour isoler les impacts sur l’utérus, en particulier dans les domaines de la grossesse et de la fertilité.

Protocole

Tous les animaux ont été logés dans des installations à haute barrière à température contrôlée (laboratoire de recherche animale de l’Université Monash) avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau et un cycle lumière-obscurité de 12 heures. Toutes les procédures ont été effectuées conformément à l’approbation du comité d’éthique de la plate-forme de recherche animale Monash (# 21908, 17971) et conformément au code de pratique du Conseil national de la santé et de la recherche médicale pour le soin et l’utilisation des animaux.

1. Préparation chirurgicale

1. Autoclaver tous les instruments chirurgicaux, gaze et essuie-tout nécessaires aux procédures sur un cycle de marchandises dures/sèches à 121 °C avec un temps de maintien de 30 min et un temps de séchage de 30 min.
2. Disposez un banc de paillasse stérile pour l’espace de travail chirurgical et préparez des analgésiques.
   1. Diluer le carprofène dans une solution saline stérile à 1 mg/ml et diluer la bupivacaïne dans une solution saline stérile à une solution à 0,5 % (p/v).
   2. Ajouter 3,5 mL de méloxicam dans une bouteille d’eau de cage de 400 mL.
3. Préchauffez le(s) coussin(s) chauffant(s) pour les cages de récupération et installez des lampes chauffantes pour éclairer indirectement les animaux en convalescence.
4. Assurez-vous que tout l’EPI approprié est porté, y compris un filet à cheveux, un masque facial, une blouse et des gants.
5. Pratiquez une bonne technique stérile, notamment en pulvérisant régulièrement les gants avec de l’éthanol et en les laissant s’évaporer avant de manipuler l’animal ou les outils chirurgicaux pour éviter la contamination par l’éthanol.

2. Réalisation d’une ovariectomie

1. À l’aide d’une machine d’anesthésie gazeuse à l’isoflurane, préremplir la boîte d’induction pendant 3 à 5 min à 5 % d’isoflurane avec un débit réglé à 4 L/min.
2. Placez la souris à l’intérieur du boîtier d’induction et, une fois inconsciente, déplacez-la vers le cône de nez et réduisez le débit à 0,4 L / min, avec le vaporisateur d’isoflurane réglé sur ~2,5%.
   REMARQUE : Le pourcentage d’isoflurane utilisé pour le reste de l’intervention varie en fonction de la souche de souris, de l’âge et de l’exposition aux traitements (p. ex. chimiothérapie) et doit être ajusté en fonction d’une évaluation minutieuse des habitudes respiratoires de chaque animal. Les schémas respiratoires doivent rester comme des respirations abdominales régulières. Des respirations thoraciques rapides peuvent indiquer qu’un plan chirurgical profond n’a pas été atteint ou maintenu; Dans ce cas, réglez le pourcentage du vaporisateur d’isoflurane si nécessaire.
3. Appliquez généreusement le lubrifiant pour les yeux en pressant le tube et en tamponnant doucement l’œil.
4. Rasez une petite zone (2 cm x 2 cm) au niveau et au-dessous de l’inclinaison de la colonne vertébrale.
5. Administrer 5 mg/kg de carprofène à partir d’une solution diluée de 1 mg/mL par voie sous-cutanée au niveau de la peau du cou.
6. Testez la profondeur de l’anesthésie avec le réflexe de pincement des orteils en pinçant l’orteil arrière de la souris. S’il n’y a pas de réaction de pincement des orteils, l’animal est dans le plan chirurgical profond et la procédure peut continuer.
7. Appliquez de la bétadine sur la zone chirurgicale et couvrez d’un champ chirurgical (une gaze avec une fenêtre découpée de 2 cm x 2 cm).
8. À l’aide d’une pince à dents de rat, tirez la peau à la bosse du dos vers le haut et faites une incision longitudinale de ~5 mm.
   REMARQUE : Une incision cutanée à cette hauteur sur le dos de l’animal est préférable pour la mise en place d’une pince chirurgicale afin de réduire le risque que l’animal retire les clips et nécessite des réparations de clip.
9. À l’aide d’une pince émoussée, procéder à la dissection émoussée de la peau loin de la couche musculaire sous-jacente, en descendant et d’un côté vers le rein.
10. Identifiez visuellement le coussinet adipeux des reins, des ovaires et des ovaires à travers la paroi musculaire.
    REMARQUE: Le rein apparaîtra d’une couleur rouge foncé, le coussinet adipeux apparaîtra blanc brillant et, s’il est visible, l’ovaire ressemblera à un petit point rose dans le coussinet adipeux.
11. À l’aide de forceps, saisissez et soulevez la couche musculaire. Faites une incision de ~0,5-1 cm avec des ciseaux chirurgicaux tranchants. Continuez à tenir la paroi musculaire avec une pince et passez des ciseaux aux pinces contondantes pour tirer le coussinet adipeux ovarien à travers l’incision.
12. À l’aide d’un porte-aiguille incurvé, serrez sous l’ovaire et l’oviducte à l’extrémité distale de la corne utérine.
    REMARQUE: Alternativement, l’ovaire seul peut être enlevé, laissant l’oviducte intact. Cependant, un microscope à dissection est nécessaire pour visualiser avec précision la distinction entre l’ovaire et l’oviducte.
13. Retirez l’ovaire avec des ciseaux ou un scalpel. Continuez à serrer pendant 30 s pour éviter les saignements excessifs.
14. Retirez la pince et tamponnez-la avec de la gaze stérile si nécessaire.
15. Pour fermer l’incision de la paroi musculaire, utilisez une pince pour soulever le haut de l’incision afin que l’incision se rapproche naturellement.
16. Utilisez des sutures en soie (taille 3-0) pour fermer l’incision de la paroi musculaire avec un nœud de chirurgien.
17. Appliquez deux à trois gouttes de bupivacaïne par voie topique à l’aide d’une seringue de 1 ml sans aiguille et répétez les étapes 2.9-2.17 de l’autre côté.
18. Pour fermer l’incision cutanée, utilisez de la gaze pour tamponner la zone sèche de l’excès de bupivacaïne et pressez les deux côtés de la peau ensemble.
19. Appliquez un à deux clips chirurgicaux de 7 mm, laissant de l’espace pour l’enflure dans le cadre du processus de guérison.
20. Déplacez la souris vers une cage de récupération et surveillez étroitement pendant 15 minutes.
    REMARQUE: Les animaux doivent se réveiller rapidement; Assurez-vous de surveiller de près la respiration pour les habitudes respiratoires thoraciques normales.

3. Préparation hormonale: injection sous-cutanée

1. Préparer une solution mère d’œstradiol à 1 mg/mL.
   1. Peser 0,001 g (1 mg) de poudre d’œstradiol dans un tube stérile de 1,5 mL.
   2. Ajouter 1 mL d’éthanol à 100 % dans le tube et vortex pendant quelques secondes.
      NOTE: L’éthanol restera clair avec des taches visibles de poudre d’œstradiol.
   3. Enveloppez le tube avec un film pour empêcher toute évaporation d’éthanol.
   4. Enveloppez le tube dans du papier d’aluminium et placez-le sur une bascule pendant la nuit pour dissoudre complètement la poudre d’œstradiol.
   5. Diluer ce stock de 1 mg/mL dans de l’huile de sésame jusqu’à la concentration finale désirée.
      NOTE: Des doses de 100 ng pendant 3 jours sont nécessaires pour l’amorçage avant la décidualisation artificielle, et de faibles doses supplémentaires de 25 ng sont nécessaires lorsque la progestérone est administrée. Il s’agit de lutter contre la boucle de rétroaction contrôlant l’expression du récepteur de la progestérone. Pour le transfert d’embryons, deux doses de 100 ng le jour 1 et le jour 3 avant le transfert d’embryons le jour 4 sont nécessaires. Au moment du transfert d’embryons, une faible dose de 25 ng est également nécessaire.
   6. Aspirez la quantité requise d’œstradiol dans l’huile dans une seringue de 1 mL, puis fixez un embout d’aiguille de 26 G.
   7. Injecter la dose appropriée par voie sous-cutanée (soit au niveau de la peau ou du flanc; 100 ng/100 μL ou 25 ng/100 μL pour l’amorçage avant le transfert d’embryons ou la décidualisation artificielle ou au moment du transfert d’embryons) à la fréquence requise.
      REMARQUE: L’huile est très visqueuse, alors assurez-vous d’injecter lentement et de faire une pause de quelques secondes avant de retirer l’aiguille. Cela minimisera la quantité d’huile qui s’échappe du site d’injection.
2. Faire une solution mère de 200 mg/mL de progestérone.
   1. Peser 0,4 g (400 mg) de poudre de progestérone dans un tube stérile de 5 mL.
   2. Ajouter 2 mL d’éthanol à 100 % dans le tube et vortex pendant quelques secondes.
      REMARQUE: L’éthanol deviendra de couleur blanche.
   3. Répétez les étapes 3.1.3-3.1.4.
   4. Diluer le bouillon de 200 mg/mL dans l’huile de sésame jusqu’à la concentration finale désirée.
      REMARQUE: Des doses de 2 mg par jour sont nécessaires pour soutenir le transfert d’embryons.
   5. Injecter la dose appropriée (p. ex. 2 mg/100 μL par jour pour soutenir la grossesse) par voie sous-cutanée comme aux étapes 3.1.6 à 3.1.7.

4. Préparation hormonale : granulés à libération lente

1. Poser une feuille sur la surface d’une hotte de biosécurité à écoulement laminaire ou de classe II.
2. Placez tout le matériel (gants, boîtes de Petri, seringues de 1 mL, pinces fines) dans la hotte et allumez les UV pendant 20 min.
   REMARQUE: N’allumez pas l’UV avec le scellant à l’intérieur de la hotte car il se fixera.
3. Lavez le tube silastique dans de l’éthanol à 100 % et laissez-le sécher à l’air libre dans la hotte. Une fois sec, marquez ~1 cm de longueur le long du tube et coupez avec un scalpel.
4. Retirez le piston d’une seringue et insérez ~200 μL de scellant. Replacez le piston et retirez une petite quantité de scellant de la seringue.
5. Appliquez une petite quantité de scellant à une extrémité du tube et lissez-le avec un doigt ganté.
6. Laisser sécher pendant la nuit ou pendant 20-30 minutes à la lumière UV à l’intérieur de la hotte.
7. Versez une quantité appropriée de progestérone dans une boîte de Petri stérilisée. À l’aide d’une pince, versez des pastilles dans la poudre de progestérone pour remplir la pastille.
   1. Tapotez l’extrémité scellée de la pastille sur la surface du capot pour condenser la progestérone. Alternativement, utilisez l’extrémité des forceps stérilisés pour bourrer la progestérone. Laissez suffisamment d’espace pour plus de scellant.
8. Scellez l’extrémité ouverte avec du scellant, comme décrit aux étapes 3.4 à 3.5.
9. Enveloppez la boîte de Petri contenant les granulés de progestérone dans du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière.
10. Activer les pastilles pendant au moins 72 h avant l’insertion sous-cutanée en les incubant dans du FCS dénudé à 1 % (cs-FCS: PBS) à 37 °C.
    REMARQUE: Les granulés peuvent être fabriqués en vrac avec une seule extrémité scellée à l’avance. Cependant, de la progestérone fraîche doit être utilisée pour les remplir à chaque fois. Assurez-vous que les granulés préfabriqués sont stérilisés aux UV avant de les remplir de progestérone. Les pastilles sécrèteront ~ 500 μg / jour pendant 6-10 jours, ce qui est un soutien suffisant pour la décidualisation artificielle et les procédures de transfert d’embryons, bien qu’une injection supplémentaire d’œstrogènes à faible dose puisse être nécessaire pour maintenir l’activité du récepteur de la progestérone au-delà de 4-5 jours. Au-delà de 10 jours, une pastille de progestérone de remplacement peut être nécessaire.

5. Préparation hormonale: mini-pompes osmotiques

1. Préparer la progestérone à la concentration désirée dans une solution aqueuse et choisir le modèle de mini-pompe osmotique approprié (voir le tableau des matériaux).
   NOTE: Pour la section 7 (procédure expérimentale: transfert d’embryons), l’administration de 2 mg / jour pendant 12 jours est requise. Par conséquent, dissoudre 28 mg de progestérone dans ~100 μL d’eau stérile par animal (suivez les instructions du fabricant pour le volume spécifique). Des dilutions en série peuvent être nécessaires. Pour la section 8 (procédure expérimentale: décidualisation artificielle), l’administration de 500 μg par jour pendant 3 jours est requise. Par conséquent, dissoudre 1 500 μg de progestérone dans ~100 μL d’eau stérile par animal. Préparez une solution supplémentaire pour tenir compte du volume perdu pendant la procédure de remplissage.
2. Installez l’équipement (gants, lingettes à faible peluche, boîtes de Petri, solution saline stérile, seringues de 1 mL, petits bateaux de pesée, papier d’aluminium et balances d’une précision de 0,01 g) dans une cagoule de biosécurité de classe II, puis allumez les UV pendant 20 minutes.
3. Aspirez la solution hormonale dans une seringue de 1 mL, puis fixez un tube de remplissage stérile, en veillant soigneusement à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air.
4. Pesez la pompe et son modérateur de débit dans un bateau de pesage stérile.
5. Insérez le tube de remplissage par l’ouverture située en haut de la pompe jusqu’à ce qu’il ne puisse plus aller plus loin.
6. En tenant la pompe à la verticale, poussez lentement le piston de la seringue pour remplir le tube.
   REMARQUE: Le remplissage rapide doit être évité car cela peut introduire des bulles d’air dans la pompe.
7. Lorsque la solution déborde du haut de la pompe, retirez délicatement le tube de remplissage et essuyez l’excès de solution avec une lingette stérile à faible peluche.
8. Insérez le modérateur de débit par l’ouverture située en haut de la pompe jusqu’à ce qu’il ne puisse plus aller plus loin. Une fois complètement enfoncé, appuyez fermement sur la pompe et le modérateur de débit ensemble.
9. Pesez la pompe remplie avec le modérateur de débit en place.
   REMARQUE : La différence de poids obtenue à l’étape 5.3 et à l’étape 5.8 donnera le poids net de la solution chargée (c.-à-d. une augmentation de 0,1 g = 100 μL de solution ajoutée).
10. Placez la pompe remplie dans une boîte de Petri stérile remplie de solution saline stérile.
11. Une fois toutes les pompes remplies, enveloppez la boîte de Petri dans du papier d’aluminium et placez-la dans un incubateur à 37 °C pour amorcer pendant au moins 4 à 6 h (ou jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi).

6. Intervention chirurgicale: Insertion de pastilles d’hormones sous-cutanées et de mini-pompes

1. Préparez la zone conformément à la section 1 (préparation chirurgicale).
2. Anesthésiez les animaux conformément aux étapes 2.1-2.3.
3. Rasez une petite zone au niveau de la peau du cou (~1 cm x 1 cm).
4. Administrer 5 mg/kg de carprofène à partir d’une solution diluée de 1 mg/mL par voie sous-cutanée dans le flanc de la jambe.
5. Testez le réflexe de pincement des orteils. S’il n’y a pas de réflexe, l’animal est dans le plan chirurgical profond et la procédure peut commencer.
6. Appliquez de la bétadine sur la zone chirurgicale et couvrez-la d’un champ chirurgical (une gaze avec une fenêtre de 2 cm x 2 cm découpée).
7. À l’aide d’une pince à dents de rat, tirez la peau au niveau de la peau du cou (à mi-chemin entre la vraie peau et l’intuition du dos) vers le haut et faites une incision longitudinale de ~5 mm.
8. À l’aide d’une pince émoussée, disséquer la peau loin de la couche musculaire sous-jacente vers le bas.
   REMARQUE: Pour l’insertion osmotique de la mini-pompe, créez une poche le long d’un côté de l’animal afin que la pompe ne limite pas le mouvement de l’animal ou ne appuie pas contre le site d’incision.
9. Une fois que suffisamment d’espace a été fait pour la pastille d’hormone ou la mini-pompe, utilisez des pinces stériles pour ramasser la pastille ou la mini-pompe et insérez-la dans la poche sous-cutanée réalisée par dissection contondante.
10. Pour fermer l’incision cutanée, assurez-vous que la pastille ou la mini-pompe est suffisamment loin dans la poche pour que les clips chirurgicaux ne l’endommagent pas.
11. Appliquer localement la bupivacaïne conformément à l’étape 2.17.
12. Fermez la plaie avec un clip chirurgical. Déplacez la souris vers une cage de récupération et surveillez étroitement pendant 15 minutes. Comme il s’agit d’une procédure courte, les animaux devraient être ambulatoires en quelques minutes.

7. Procédure expérimentale : Transfert d’embryons

1. Pour les animaux ovariectomisés, amorcer l’hormone 3 jours avant le transfert embryonnaire par injection sous-cutanée de 100 ng/100 μL d’œstradiol (étape 3.1).
2. Un jour avant le transfert d’embryons, amorcer les hormones avec une injection sous-cutanée de 2 mg/100 μL d’acétate de médroxyprogestérone (étape 3.2).
3. Préparez la zone conformément à la section 1 (préparation chirurgicale).
4. Anesthésiez les animaux conformément aux étapes 2.1-2.3.
5. Commencez la procédure conformément aux étapes 2.4-2.10.
6. Sous un microscope à dissection, créez un point d’injection intra-utérin avec une pointe d’aiguille de 26 G.
7. Pipeter cinq blastocystes dans une goutte de milieu M2, puis les transférer dans la corne utérine.
8. Pour fermer l’incision de la paroi musculaire, soulevez le haut de l’incision à l’aide d’une pince afin que l’incision se rapproche naturellement.
9. À l’aide de sutures en soie, fermez le site de la paroi musculaire avec un nœud de chirurgien. Appliquer des gouttes de bupivacaïne par voie topique.
10. Répétez les étapes 7.5-7.8 de l’autre côté.
11. Pour fermer l’incision cutanée, utilisez de la gaze pour tamponner la zone sèche de l’excès de bupivacaïne et pressez les deux côtés de la peau ensemble.
12. Appliquez un à deux clips chirurgicaux, laissant de l’espace pour l’enflure dans le cadre du processus de guérison.
    NOTE: Si les animaux sont ovariectomisés, des hormones exogènes sont nécessaires au moment du transfert d’embryons. Injectez de la progestérone par voie sous-cutanée (2 mg) ou insérez une pastille de progestérone sous-cutanée ou une mini-pompe osmotique. Pour lutter contre l’excès de progestérone, une injection sous-cutanée d’œstrogène à faible dose (25 ng / 100 μL) est nécessaire au moment du transfert d’embryons.
13. Transportez soigneusement la souris dans une cage de récupération et surveillez de près pendant 15 minutes.
    REMARQUE: Les animaux doivent se réveiller rapidement; Assurez-vous de surveiller de près la respiration pour les habitudes respiratoires thoraciques normales.

8. Procédure expérimentale : décidualisation artificielle

1. Hormone amorce les animaux avec 100 ng/100 μL d’estradiol le jour 1, le jour 2 et le jour 3, conformément à la section 3 (préparation hormonale: injection sous-cutanée) 8 jours avant la décidualisation artificielle.
2. Hormone amorce les animaux avec 5 ng/100 μL d’estradiol aux jours 7, 8 et 9, conformément à la section 3 (préparation hormonale : injection sous-cutanée) 2 jours avant la décidualisation artificielle.
   NOTE: L’injection finale doit avoir lieu au moins 3 heures (et au maximum 4 heures) avant la procédure de décidualisation artificielle.
3. Animaux à taux hormonal de première qualité munis d’une pastille de progestérone sous-cutanée ou d’une mini-pompe osmotique (500 μg/jour), conformément aux sections 4, 5 et 8, 2 jours avant la décidualisation artificielle.
4. Préparez la zone conformément à la section 1 (préparation chirurgicale).
5. Anesthésiez les animaux conformément aux étapes 2.1-2.2.
6. Testez la profondeur de l’anesthésie avec le réflexe de pincement des orteils. S’il n’y a pas de réaction de pincement des orteils, l’animal est dans le plan chirurgical profond et la procédure peut continuer.
7. Placez la souris en position couchée, soulevez la queue et insérez lentement un spéculum de 6 mm de diamètre dans le vagin.
8. Tout en gardant le nez de l’animal dans le cône nasal anesthésique, placez le bas du corps de l’animal entre le premier et le deuxième doigt de la main non dominante. Utilisez le pouce pour pousser doucement la queue vers le haut pour garder l’ouverture vaginale en vue.
9. Transférer 20 μL d’huile de sésame dans une corne utérine à l’aide d’une pointe de transfert d’embryons non chirurgicale (fixée à une pipette de 20 μL).
   1. En gardant la pipette au niveau de l’ouverture vaginale, insérez la pointe dans le vagin et à travers le col de l’utérus dans la corne utérine. Une fois que la pointe est dans la corne utérine, appuyez doucement sur la pointe contre la surface de l’endomètre (si vous utilisez la technique de manipulation ci-dessus, ce mouvement sera ressenti contre le deuxième doigt) et expulsez lentement l’huile.
      REMARQUE: Gardez le piston de la pipette enfoncé, attendez 10 secondes pour vous assurer que toute l’huile s’est dispersée et retirez lentement l’embout de transfert tout en maintenant le piston enfoncé.
10. Retirez le spéculum du vagin.
11. Transportez soigneusement la souris vers la cage de récupération et surveillez de près pendant 15 minutes.
    REMARQUE: Les animaux doivent se réveiller rapidement. Surveillez de près leur respiration pour les habitudes respiratoires thoraciques normales.
12. Limitez la manipulation des animaux et gardez-les dans un environnement calme pendant 96 heures après l’intervention.
    REMARQUE: Des bruits forts ou des changements brusques à leur cycle de lumière et d’obscurité auront un impact sur le succès de la procédure. Au moment de la dissection tissulaire, l’étendue du succès de la décidualisation peut être mesurée en fonction du rapport entre le poids utérin et le poids corporel. La procédure de décidualisation artificielle a un taux de réussite de 80%. Par conséquent, excluez les animaux qui ne décident pas et tenez-en compte lors de la sélection de la taille des échantillons pour les expériences.

9. Procédure chirurgicale : récupération post-chirurgicale, surveillance et réparation des clips

1. Laissez les animaux récupérer les coussins chauffants à moitié sur et à moitié enlevés pendant la nuit avant de les ramener dans leur cage familiale.
2. Surveillez les animaux quotidiennement pendant 5 jours après la chirurgie, en accordant une attention particulière au site de la plaie pour détecter tout signe d’infection.
3. Effectuez une réparation du clip si nécessaire.
   1. Préparez la zone conformément à la section 1 (préparation chirurgicale).
   2. Anesthésiez les animaux conformément aux étapes 2.1-2.3.
   3. Retirez le clip existant à l’aide d’un dissolvant de clip si le clip est toujours présent.
   4. Appliquez un nouveau clip chirurgical, conformément aux étapes 2.19-2.21.
4. Retirez les clips chirurgicaux 7 jours après la chirurgie conformément aux étapes 9.3.1 à 9.3.3 ou lorsque l’animal est sous anesthésie (comme pour un transfert d’embryons, la procédure de décidualisation artificielle ou une injection sous-cutanée après la chirurgie).

Résultats

Un modèle bien caractérisé de décidualisation artificielle est décrit dans ce document de protocole (figure 1A). Ici, les jeunes souris femelles adultes (âgées de 8 semaines) ont subi une ovariectomie chirurgicale comme décrit aux rubriques 1 et 2. Les souris ont ensuite été reposées pendant 2 semaines pour s’assurer que les hormones ovariennes endogènes se dissipaient avant d’être soutenues par des hormones exogènes comme décrit dans les sections 3-7...

Discussion

Cet article fournit des instructions étape par étape sur la façon d’effectuer OVX et de fournir des hormones exogènes pour les études axées sur la compréhension des contributions utérines à la grossesse et à la fertilité. Deux protocoles détaillés sont fournis sur deux applications expérimentales de ces méthodes, y compris la réalisation du transfert d’embryons et l’induction artificielle de la décidualisation.

Bien que la réalisation d’OVX puisse être difficile au d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
ALZET 1002 mini osmotic pumps	BioScientific	1002	Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure - Embryo transfer).
ALZET 1003D mini osmotic pumps	BioScientific	1003D	Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure - Artificial decidualization).
ALZET Reflex 7 mm clips	BioScientific	0009971	Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip applicator	BioScientific	0009974	Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip remover	BioScientific	0009976	Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
Bupivicaine injection	Pfizer	NA	Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline
Estradiol	Sigma	E8875
Meloxicam	Ilium	NA	Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 400 mL cage water bottle, or as your institution's vet prescribes.
Michel clips	Daniels	NS-000242
Multi purpose sealant	Dow Corning	732
Non-surgical embryo transfer (NSET) device	ParaTechs	60010	Contains 6 mm speculum. Single use only.
Progesterone	Sigma	P0130	Soluble in ethanol. Use for  section 3 (Hormone preparation - subcutaneous injection) and  section 4 (Hormone preparation - slow-release pellets)
Progesterone	Sigma	P7556	Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation - osmotic mini pumps)
Refresh eye ointment	Allergan	NA	42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin
Rimadyl Carprofen	Zoetis	NA	Stock 50 mg/mL. Use at 1 mg/ml (for 5 mg/kg dose)
Rubber tubing	Dow Corning	508-008	Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ±  0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm.
Sesame oil	Sigma	S3547
Sofsilk Silk sutures size 3-0	Covidien	GS-832