卵巣摘出マウスモデルにおける妊娠確立への子宮寄与の研究方法

要約

妊娠の確立は、複雑な胚と子宮のクロストークを含む動的なプロセスです。これらの過程に対する母体の子宮環境の正確な寄与は、依然として活発な研究分野である。ここでは、これらの研究課題に対処するための in vivo 動物モデルの設計を支援するための詳細なプロトコルが提供されています。

要約

妊娠が確立されるためには、生存可能な胚盤胞が受容性子宮内膜(子宮内膜)とうまく相互作用して、着床と胎盤形成を促進し、継続的な妊娠を可能にする必要があります。胚の欠陥によって引き起こされる妊娠の成功の限界はよく知られており、 体外 受精(IVF)と生殖補助医療技術の台頭により、ここ数十年で大部分が克服されました。しかし、この分野はまだ、受容性が不十分な子宮内膜によって引き起こされる制限を克服していないため、体外受精の成功率が停滞しています。卵巣によって産生されるホルモンが子宮内膜の月経周期性に関与しているため、卵巣と子宮内膜の機能は密接に絡み合っています。そのため、妊娠のげっ歯類モデルを使用する場合、観察された結果が卵巣または子宮の欠損によるものであるかどうかを確認するのは難しい場合があります。これを克服するために、妊娠への子宮特異的寄与の研究を可能にするために、胚移植または人工脱落膜化を伴う卵巣摘出マウスモデルが開発されました。この記事では、卵巣摘出術の実施方法について説明し、健康なドナーからの胚移植後の人工脱落膜化または妊娠の成功をサポートするための外因性ホルモンを供給するためのさまざまな技術に関する洞察を提供します。これらの技術には、皮下注射、徐放性ペレット、および浸透圧ミニポンプが含まれます。各方法の主な長所と短所について説明し、研究者が特定の研究課題に最適な研究デザインを選択できるようにします。

概要

ここ数十年で生殖補助医療の使用が増えるにつれ、受胎に対する多くの障壁が克服され、不妊の問題にもかかわらず多くのカップルが家族を始めることができました¹。卵母細胞または精子の欠損は、 体外 受精または細胞質内精子注入を使用してバイパスできることがよくあります。しかし、子宮と子宮内膜受容性に関連する問題は、生殖能力のとらえどころのない「ブラックボックス」のままです²。

妊娠は、高品質の胚が受容性子宮内膜(子宮内膜)とうまく相互作用したときに確立されます。特定の月経周期で妊娠が成功する可能性は低く、約30%^です3,4。成功したもののうち、妊娠20週を過ぎて前進するのは50%〜60%のみであり、着床の失敗は20週に達しない妊娠の75%の原因です³。これらの数字は1990年代後半にさかのぼりますが、この分野は、受容性が不十分な子宮内膜によって引き起こされる制限をまだ克服していません。その結果、近年、体外受精の成功率が停滞し、時には低下しています^5,6。

原因不明の不妊症の女性は、多くの場合、受容性の窓がずれているか、未知の理由で受容性を達成できません。最近、子宮内膜受容性アレイが開発され、胚移植のタイミングを個人の受容性のウィンドウに合わせて調整する目的で、数百の遺伝子の発現を評価します^7,8,9。しかし、この分野は、着床プロセスが完了した後に現れる妊娠合併症の病因についてまだ理解されていません。

女性の生殖器系は非常に動的で、厳密なホルモン管理下にあります。視床下部-下垂体-性腺(HPG)軸は、卵胞の成熟やエストロゲンとプロゲステロンの活性など、卵巣周期の側面を調節する黄体形成ホルモンと卵胞刺激ホルモンの放出を制御します。次に、子宮月経周期はエストロゲンとプロゲステロンによって調節されています^10,11。したがって、子宮の生物学的メカニズムの研究は卵巣の影響によって複雑になります。たとえば、がん治療が子宮にどのように影響するかを研究する場合、観察された子宮表現型(妊娠喪失や月経非周期性など)が子宮への直接の侮辱の結果なのか、卵巣の損傷による結果的な影響なのかを区別するのは難しい場合があります。

生殖能力を包括的に理解するためには、妊娠への子宮の寄与を特徴付けなければなりません。重要なことに、この理解は卵巣の制御下にある子宮機能を超えて拡張されなければなりません。これは人間では研究できません。したがって、動物モデルがしばしば採用される。そのため、卵巣摘出術(OVX)は、研究者がホルモンを外因的に供給することにより、げっ歯類の発情周期(月経周期に類似)を調節できるようにするために一般的に使用されています。さらに、OVXは、卵巣の影響とは無関係に子宮反応を研究することを可能にします¹²。ただし、OVX後にホルモンがすぐに供給されない場合、更年期障害の表現型が発生するため、研究者は慎重に検討する必要があります。

OVXはげっ歯類モデル13,14,15,16,17で頻繁に利用され、適切な訓練後に比較的容易に実施できる。方法は、卵巣のみを取り除くか、卵巣と卵管を切除するか、および動物の年齢によって異なります(成体、サイクリング動物は、表面に黄体が見える大きな卵巣を持っているため、卵巣が視覚化しやすいことを意味します)。同様に、皮下注射¹⁴、徐放性ペレット15、浸透圧ミニポンプ¹⁸、および卵巣移植を含むホルモン補充の多くの方法が存在する。

この記事では、卵巣摘出術を行い、皮下注射、徐放性ペレット、浸透圧ミニポンプを含む3種類のホルモン補給を準備する方法について詳しく説明します。OVXとそれに続く外因性ホルモン補給(胚移植および人工脱落膜化)の恩恵を受ける実験エンドポイントには、2つの詳細なプロトコルが提供されています。この記事では、特に妊娠と生殖能力の研究分野で、子宮への影響を分離するための研究を実行する方法について研究者を導くことを目的として、各アプローチの長所と短所について説明します。

プロトコル

すべての動物は、温度管理された高バリア施設(モナッシュ大学動物研究所)に収容され、無料の食料と水へのアクセスと12時間の明暗サイクルがありました。すべての手順は、モナッシュ動物研究プラットフォーム倫理委員会(#21908、17971)の承認に従って実行され、動物の世話と使用に関する国立保健医療研究評議会の行動規範に従って実行されました。

1.外科的準備

1. 処置に必要なすべての手術器具、ガーゼ、ペーパータオルを、121°Cのハード/ドライグッズサイクルで、保持時間30分、乾燥時間30分でオートクレーブします。
2. 手術用ワークスペース用の滅菌ベンチパッドをレイアウトし、鎮痛薬を準備します。
   1. 滅菌生理食塩水中のカルプロフェンを1 mg / mlに希釈し、滅菌生理食塩水中のブピバカインを0.5%(w / v)溶液に希釈します。.
   2. 3.5 mLのメロキシカムを400 mLのケージウォーターボトルに追加します。
3. 回復ケージのヒートパッドを事前に温め、回復中の動物に間接光を当てるようにヒートランプを設置します。
4. ヘアネット、フェイスマスク、ガウン、手袋など、適切なPPEがすべて着用されていることを確認してください。
5. エタノール汚染を避けるために、手袋に定期的にエタノールをスプレーし、動物や手術器具を取り扱う前に手袋を蒸発させるなど、優れた滅菌技術を実践してください。

2.卵巣摘出術の実施

1. イソフルランを含むガス麻酔器を使用して、4 L / minに設定された流量で5%イソフルランで3〜5分間誘導ボックスに事前充填します。
2. マウスを誘導ボックス内に置き、意識を失ったらノーズコーンに移動し、イソフルラン気化器を~2.5%に設定して、流量を0.4 L/minに減らします。
   注:手順の残りの部分に使用されるイソフルランの割合は、マウスの系統、年齢、および治療(化学療法など)への曝露に基づいて異なり、個々の動物の呼吸パターンの綿密な評価に基づいて調整する必要があります。.呼吸パターンは、通常の腹式呼吸のままにする必要があります。急速な胸部呼吸は、深い手術面に到達または維持されていないことを示している可能性があります。この場合、必要に応じてイソフルラン気化器の割合を調整します。
3. チューブを絞って目を軽くたたくことで、目の潤滑剤をたっぷりと塗ります。
4. 背骨の直感とその下の小さな領域(2 cm x 2 cm)を剃ります。
5. 1 mg / mLの希釈溶液から5 mg / kgのカルプロフェンを首筋の皮下に投与します。.
6. マウスの後ろのつま先をつまんで、つま先ピンチ反射で麻酔の深さをテストします。つま先のつまみ反応がない場合、動物は深い手術面にいて、手順は続行できます。
7. 手術部位にベタジンを塗布し、外科用ドレープ(2 cm x 2 cmの窓を切り取ったガーゼ)で覆います。
8. ラットの歯付き鉗子を使用して、背中の猫背の皮膚を上に引き上げ、~5 mmの縦方向の切開を行います。
   注意: 動物の背中のこの高さでの皮膚切開は、動物がクリップを取り外してクリップの修理を必要とする可能性を減らすために、外科的クリップの配置に最適です。
9. 鈍い鉗子を使用して、下にある筋肉層から離れて皮膚を鈍く解剖し、腎臓に向かって片側に移動します。
10. 腎臓、卵巣、卵巣の脂肪パッドを筋肉壁を通して視覚的に識別します。
    注:腎臓は濃い赤色に見え、脂肪パッドは明るい白に見え、目に見える場合、卵巣は脂肪パッド内の小さなピンクの点のように見えます。
11. 鉗子を使用して、筋肉層をつかんで持ち上げます。鋭利な手術用ハサミで~0.5-1cmの切開を行います。鉗子で筋肉壁を保持し続け、はさみから鈍い鉗子に変更して、切開部を通して卵巣脂肪パッドを引っ張ります。
12. 湾曲したニードルホルダーを使用して、子宮角の遠位端にある卵巣と卵管の下に固定します。
    注:あるいは、卵巣だけを切除して、卵管を無傷のままにすることもできます。ただし、卵巣と卵管の区別を正確に視覚化するには、解剖顕微鏡が必要です。
13. ハサミまたはメスで卵巣を取り除きます。過度の出血を避けるために、30秒間クランプし続けます。
14. クランプを取り外し、必要に応じて滅菌ガーゼで軽くたたきます。
15. 筋肉壁切開を閉じるには、鉗子を使用して切開の上部を持ち上げ、切開が自然に一緒に引っ張られるようにします。
16. シルク縫合糸(サイズ3-0)を使用して、外科医の結び目で筋肉壁の切開を閉じます。
17. 針を取り付けずに1 mLシリンジを使用して2〜3滴のブピバカインを局所的に塗布し、反対側で手順2.9〜2.17を繰り返します。
18. 皮膚の切開を閉じるには、ガーゼを使用して余分なブピバカインを軽くたたき、皮膚の両側を一緒に押します。
19. 1〜2個の7 mm外科用クリップを適用し、治癒プロセスの一部として腫れのためのスペースを確保します。
20. マウスをリカバリケージに移動し、15分間注意深く監視します。
    注:動物はすぐに目を覚ます必要があります。正常な胸部の呼吸パターンがないか、呼吸を注意深く監視してください。

3.ホルモン製剤:皮下注射

1. エストラジオールの1 mg / mLストック溶液を作ります。
   1. 0.001 g(1 mg)のエストラジオール粉末を1.5 mL滅菌チューブに計量します。.
   2. 1 mLの100%エタノールをチューブに加え、数秒間ボルテックスします。
      注:エタノールは、エストラジオール粉末の目に見える斑点で透明なままです。
   3. エタノールの蒸発を防ぐために、チューブをフィルムで包みます。
   4. チューブをアルミホイルで包み、ロッカーに一晩置いてエストラジオール粉末を完全に溶かします。
   5. この1 mg / mLストックをゴマ油で目的の最終濃度に希釈します。.
      注:人工脱落膜化前のプライミングには3日間100 ngの用量が必要であり、プロゲステロンを投与する場合はさらに25 ngの低用量が必要です。これは、プロゲステロン受容体の発現を制御するフィードバックループに対抗するためである。胚移植の場合、4日目の胚移植の前に、1日目と3日目に100 ngの2回の投与が必要です。胚移植時には、25ngの低用量も必要とされる。
   6. 必要量のオイル中のエストラジオールを1 mLのシリンジに吸い込み、26 Gの針先を取り付けます。
   7. 適切な用量を必要な頻度で皮下注射します(首筋または脇腹のいずれかに、胚移植または人工脱落膜形成の前または胚移植時にプライミングの場合は100 ng / 100 μLまたは25 ng / 100 μL)。
      注意: オイルは非常に粘性が高いため、針を外す前にゆっくりと注入し、数秒間一時停止してください。これにより、注入部位から漏れるオイルの量が最小限に抑えられます。
2. プロゲステロンの200 mg / mLストック溶液を作ります。
   1. 0.4 g(400 mg)のプロゲステロン粉末を5 mL滅菌チューブに計量します。.
   2. 2 mLの100%エタノールをチューブに加え、数秒間ボルテックスします。
      注:エタノールは白色になります。
   3. 手順3.1.3-3.1.4を繰り返します。
   4. ゴマ油で200 mg / mLストックを目的の最終濃度に希釈します。
      注:胚移植をサポートするには、毎日2 mgの用量が必要です。
   5. 適切な用量(例:.、妊娠をサポートするために毎日2 mg / 100 μL)をステップ3.1.6-3.1.7のように皮下注射します。.

4.ホルモンの準備:徐放性ペレット

1. 層流またはクラスIIバイオセーフティフードの表面にホイルを置きます。
2. すべての機器(手袋、ペトリ皿、1 mLシリンジ、ファイン鉗子)をフードに入れ、UVを20分間オンにします。
   注意: フード内のシーラントでUVをオンにしないでください。
3. シラスティックチューブを100%エタノールで洗浄し、フード内で風乾させます。乾いたら、チューブに沿って~1cmの長さに印を付け、メスで切ります。
4. シリンジからプランジャーを取り外し、~200 μLのシーラントを絞ります。プランジャーを交換し、シリンジから少量のシーラントを押し出します。
5. チューブの一方の端に少量のシーラントを塗布し、手袋をはめた指で滑らかにします。
6. フード内のUV光で一晩または20〜30分間乾燥させます。
7. 滅菌したペトリ皿に適量のプロゲステロンを注ぎます。鉗子を使用して、ペレットをプロゲステロン粉末にすくい取り、ペレットを満たします。
   1. フード表面のペレットの密封された端を軽くたたいて、プロゲステロンを凝縮します。あるいは、滅菌した鉗子の端を使ってプロゲステロンを詰めます。より多くのシーラントのために十分なスペースを確保してください。
8. 手順3.4〜3.5で説明されているように、開口部をシーラントでシールします。
9. プロゲステロンペレットが入っているペトリ皿をホイルで包み、光から保護します。
10. 1%木炭ストリッピングFCS(cs-FCS:PBS)中で37°Cでインキュベートすることにより、皮下挿入の前に最低72時間ペレットを活性化します。
    注:ペレットは、事前に単一の密封された端でバルクで作ることができます。しかし、新鮮なプロゲステロンは毎回それらを満たすために使用されるべきです。プロゲステロンを充填する前に、既製のペレットがUV滅菌されていることを確認してください。ペレットは6〜10日間~500μg/日を分泌し、人工脱落膜化および胚移植手順を十分にサポートしますが、プロゲステロン受容体活性を4〜5日を超えて維持するには、追加の低用量エストロゲン注射が必要になる場合があります。10日を超えると、交換用プロゲステロンペレットが必要になる場合があります。

5.ホルモンの準備:浸透圧ミニポンプ

1. 水溶液中で所望の濃度でプロゲステロンを調製し、適切なミニ浸透圧ポンプモデルを選択する( 材料表参照)。
   注:セクション7(実験手順:胚移植)の場合、2 mg /日を12日間送達する必要があります。したがって、動物あたり28 mgのプロゲステロンを~100 μLの滅菌水に溶解します(特定の容量については、製造元の指示に従ってください)。段階希釈が必要な場合があります。セクション8(実験手順:人工脱落膜化)では、1日あたり500μgを3日間送達する必要があります。したがって、1,500 μgのプロゲステロンを動物あたり~100 μLの滅菌水に溶解します。充填手順中に失われた量を考慮して、追加の溶液を準備してください。
2. クラスIIバイオセーフティフード内に機器(手袋、低糸くずのワイプ、ペトリ皿、滅菌生理食塩水、1 mLシリンジ、小型計量ボート、ホイル、および0.01 gの精度のはかり)をセットアップし、UVを20分間オンにします。
3. ホルモン溶液を1 mLの注射器に吸い込み、気泡がないことを慎重に確認しながら滅菌充填チューブを取り付けます。
4. 滅菌計量ボート内でポンプとその流量減速材の重量を量ります。
5. ポンプ上部の開口部から充填チューブを、それ以上進まなくなるまで挿入します。
6. ポンプを直立させたまま、シリンジのプランジャーをゆっくりと押してチューブを満たします。
   注意: ポンプに気泡を導入する可能性があるため、急速な充填は避けてください。
7. 溶液がポンプの上部から溢れたら、充填チューブをそっと取り外し、滅菌済みの低糸くずワイプで余分な溶液を拭き取ります。
8. ポンプ上部の開口部からフローモデレーターを挿入し、それ以上進めなくなります。完全に入ったら、ポンプとフローモデレーターを一緒にしっかりと押します。
9. フローモデレーターを所定の位置に置いた状態で、充填されたポンプの重量を量ります。
   注:ステップ5.3とステップ5.8から得られた重量の差は、ロードされた溶液の正味重量を示します(つまり、0.1 gの増加= 100 μLの溶液が追加されます)。
10. 充填したポンプを滅菌生理食塩水で満たされた滅菌ペトリ皿に入れます。
11. すべてのポンプが満たされたら、ペトリ皿をホイルで包み、37°Cのインキュベーターに入れて、少なくとも4〜6時間(または使用する準備ができるまで)プライミングします。

6.外科的処置:皮下ホルモンペレットとミニポンプの挿入

1. セクション1(外科的準備)に従って領域を準備します。
2. 手順2.1〜2.3に従って動物に麻酔をかけます。
3. 首筋の小さな領域(~1 cm x 1 cm)を剃ります。
4. 1 mg / mLの希釈溶液から5 mg / kgのカルプロフェンを脚の側面の皮下に投与します。.
5. つま先ピンチ反射をテストします。反射がない場合、動物は深い手術面にあり、手順を開始できます。
6. 手術部位にベタジンを塗布し、外科用ドレープ(2 cm x 2 cmの窓が切り取られたガーゼ)で覆います。
7. ラット歯の鉗子を使用して、首の首筋(真の首筋と背中の猫の中間)の皮膚を上に引き上げ、~5 mmの縦方向の切開を行います。
8. 鈍い鉗子を使用して、下にある筋肉層から下方向に皮膚を鈍く解剖します。
   注意: 浸透圧ミニポンプを挿入するには、ポンプが動物の動きを制限したり、切開部位を押し上げたりしないように、動物の片側に沿ってポケットを作成します。
9. ホルモンペレットまたはミニポンプ用に十分なスペースができたら、滅菌鉗子を使用してペレットまたはミニポンプをピックアップし、鈍的解剖で作られた皮下ポケットに挿入します。
10. 皮膚の切開を閉じるには、ペレットまたはミニポンプがポケットに十分入って、外科用クリップで損傷しないことを確認します。
11. ステップ2.17に従ってブピバカインを局所的に塗布します。
12. 1つの手術用クリップで傷を閉じます。マウスをリカバリケージに移動し、15分間注意深く監視します。これは短い手順であるため、動物は数分以内に歩行可能になるはずです。

7.実験手順:胚移植

1. 卵巣摘出動物の場合、100 ng / 100 μLエストラジオールの皮下注射による胚移植の3日前にホルモンプライム(ステップ3.1)。
2. 胚移植の1日前に、酢酸メドロキシプロゲステロン2 mg / 100 μLの皮下注射で動物にホルモンプライミングを行います(ステップ3.2)。
3. セクション1(外科的準備)に従って領域を準備します。
4. 手順2.1〜2.3に従って動物に麻酔をかけます。
5. 手順2.4〜2.10に従って手順を開始します。
6. 解剖顕微鏡下で、26 Gの針先で子宮内注射ポイントを作成します。
7. 5つの胚盤胞をM2培地滴にピペットで移し、これらを子宮角に移します。
8. 筋肉壁切開を閉じるには、鉗子を使用して切開の上部を持ち上げて、切開が自然に引っ張られるようにします。
9. 絹縫合糸を使用して、外科医の結び目で筋肉壁部位を閉じます。ブピバカインを局所的に滴下する。
10. 反対側で手順7.5〜7.8を繰り返します。
11. 皮膚の切開を閉じるには、ガーゼを使用して余分なブピバカインを軽くたたき、皮膚の両側を一緒に押します。
12. 1〜2個の外科用クリップを適用し、治癒プロセスの一部として腫れのためのスペースを確保します。
    注:動物が卵巣摘出されている場合、胚移植時に外因性ホルモンが必要です。プロゲステロン(2 mg)を皮下注射するか、皮下プロゲステロンペレットまたは浸透圧ミニポンプを挿入します。過剰なプロゲステロンと戦うためには、胚移植時に低用量(25 ng / 100 μL)のエストロゲンの皮下注射が必要です。
13. マウスを回復ケージに慎重に運び、15分間注意深く監視します。
    注:動物はすぐに目を覚ます必要があります。正常な胸部の呼吸パターンがないか、呼吸を注意深く監視してください。

8.実験手順:人工脱落膜化

1. 人工脱子虫化の8日前のセクション3(ホルモン製剤:皮下注射)に従って、1日目、2日目、および3日目に100 ng / 100 μLのエストラジオールで動物をホルモンプライミングします。
2. 人工脱子虫化の2日前のセクション3(ホルモン製剤:皮下注射)に従って、7日目、8日目、および9日目に5 ng / 100 μLエストラジオールで動物をホルモンプライミングします。
   注意: 最終注射は、人工脱落膜化手順の最低3時間(および最大4時間)前に行う必要があります。
3. 人工脱子膜形成の2日前のセクション4、セクション5、およびセクション8に従って、皮下プロゲステロンペレットまたはミニ浸透圧ポンプ(500 μg /日)を備えたホルモンプライム動物。
4. セクション1(外科的準備)に従って領域を準備します。
5. 手順2.1〜2.2に従って動物に麻酔をかけます。
6. つま先ピンチ反射で麻酔の深さをテストします。つま先のつまみ反応がない場合、動物は深い手術面にいて、手順は続行できます。
7. マウスを腹臥位に置き、尾を持ち上げて、直径6 mmの検鏡をゆっくりと膣に挿入します。
8. 動物の鼻を麻酔薬の鼻錐形に保ちながら、利き手でない手の第1指と第2指の間に動物の下半身を置きます。親指を使って尾をそっと上に押し上げ、膣口が見えるようにします。
9. 非外科的胚移植チップ(20μLピペットに取り付けられている)を使用して、20μLのゴマ油を1つの子宮角に移します。
   1. ピペットを膣口と同じ高さに保ちながら、先端を膣に挿入し、子宮頸部を通して子宮角に挿入します。先端が子宮角に入ったら、先端を子宮内膜表面にそっと押し付け(上記の取り扱い技術を使用している場合、この動きは2本目の指に対して感じられます)、ゆっくりとオイルを排出します。
      注意: ピペットプランジャーを押したまま、10秒間待ってすべてのオイルが分散したことを確認し、プランジャーを押したままトランスファーチップをゆっくりと取り外します。
10. 膣から検鏡を取り除きます。
11. マウスを回復ケージに慎重に運び、15分間注意深く監視します。
    注:動物はすぐに目を覚ますはずです。正常な胸部の呼吸パターンがないか、呼吸を注意深く監視します。
12. 動物の取り扱いを制限し、処置後96時間は静かな環境に保管してください。
    注意: 大きな音や明暗のサイクルの急激な変化は、手順の成功に影響を与えます。組織解剖時に、脱落膜形成の成功の程度は、体重に対する子宮重量の比として測定することができる。人工脱落膜化手順の成功率は80%です。したがって、脱落膜化に失敗した動物を除外し、実験のサンプルサイズを選択するときにこれを考慮に入れます。

9.外科的処置:術後の回復、モニタリング、およびクリップの修復

1. 動物を自宅のケージに戻す前に、一晩中ハーフオン、ハーフオフのヒートパッドを回復させます。
2. 手術後5日間毎日動物を監視し、感染の兆候がないか創傷部位に細心の注意を払います。
3. 必要に応じてクリップの修復を実行します。
   1. セクション1(外科的準備)に従って領域を準備します。
   2. 手順2.1〜2.3に従って動物に麻酔をかけます。
   3. クリップがまだ存在する場合は、クリップリムーバーを使用して既存のクリップを削除します。
   4. 手順2.19-2.21に従って、新しい外科用クリップを適用します。
4. 手順7-9.3.1-9.3.3に従って、または動物が次に麻酔下にあるとき(胚移植、人工脱落膜形成手順、手術後の皮下注射など)に手術クリップを取り外します。

結果

人工脱落膜化の十分に特徴付けられたモデルは、このプロトコルペーパーに記載されています(図1A)。ここで、若年成体雌マウス(8週齢)は、セクション1およびセクション2に記載されるように外科的卵巣摘出術を受けた。その後、マウスを2週間休ませて、内因性卵巣ホルモンが消散してから、セクション3〜7およびセクション9に記載されているように外?...

ディスカッション

この記事では、妊娠と出産への子宮の寄与を理解することに焦点を当てた研究のために、OVXを実行し、外因性ホルモンを提供する方法について段階的に説明します。これらの方法の2つの実験的応用について、胚移植の実施および人工的な脱落膜化の誘導を含む2つの詳細なプロトコルが提供されている。

OVXの実行は、特にげっ歯類モデルに不慣れな研究者にとって、最初...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ALZET 1002 mini osmotic pumps	BioScientific	1002	Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure - Embryo transfer).
ALZET 1003D mini osmotic pumps	BioScientific	1003D	Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure - Artificial decidualization).
ALZET Reflex 7 mm clips	BioScientific	0009971	Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip applicator	BioScientific	0009974	Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip remover	BioScientific	0009976	Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
Bupivicaine injection	Pfizer	NA	Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline
Estradiol	Sigma	E8875
Meloxicam	Ilium	NA	Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 400 mL cage water bottle, or as your institution's vet prescribes.
Michel clips	Daniels	NS-000242
Multi purpose sealant	Dow Corning	732
Non-surgical embryo transfer (NSET) device	ParaTechs	60010	Contains 6 mm speculum. Single use only.
Progesterone	Sigma	P0130	Soluble in ethanol. Use for  section 3 (Hormone preparation - subcutaneous injection) and  section 4 (Hormone preparation - slow-release pellets)
Progesterone	Sigma	P7556	Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation - osmotic mini pumps)
Refresh eye ointment	Allergan	NA	42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin
Rimadyl Carprofen	Zoetis	NA	Stock 50 mg/mL. Use at 1 mg/ml (for 5 mg/kg dose)
Rubber tubing	Dow Corning	508-008	Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ±  0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm.
Sesame oil	Sigma	S3547
Sofsilk Silk sutures size 3-0	Covidien	GS-832