Métodos para estudiar las contribuciones uterinas al establecimiento del embarazo en un modelo de ratón ovariectomizado

Resumen

El establecimiento del embarazo es un proceso dinámico que involucra diafonía compleja entre embriones y úteros. Las contribuciones precisas del entorno uterino materno a estos procesos siguen siendo un área activa de investigación. Aquí, se proporcionan protocolos detallados para ayudar en el diseño de modelos animales in vivo para abordar estas preguntas de investigación.

Resumen

Para que se establezca el embarazo, un blastocisto viable debe interactuar con éxito con un revestimiento uterino receptivo (endometrio) para facilitar la implantación y la formación de placenta y permitir el embarazo continuo. Las limitaciones para el éxito del embarazo causadas por defectos embrionarios son bien conocidas y se han superado en gran medida en las últimas décadas con el aumento de la fertilización in vitro (FIV) y las tecnologías de reproducción asistida. Hasta ahora, sin embargo, el campo no ha superado las limitaciones causadas por un endometrio inadecuadamente receptivo, lo que resulta en un estancamiento de las tasas de éxito de la FIV. Las funciones ováricas y endometriales están estrechamente entrelazadas, ya que las hormonas producidas por el ovario son responsables de la ciclicidad menstrual del endometrio. Como tal, cuando se utilizan modelos de embarazo con roedores, puede ser difícil determinar si un resultado observado se debe a un déficit ovárico o uterino. Para superar esto, se desarrolló un modelo de ratón ovariectomizado con transferencia embrionaria o decidualización artificial para permitir el estudio de las contribuciones específicas uterinas al embarazo. Este artículo proporcionará instrucciones sobre cómo realizar la ovariectomía y ofrecerá información sobre diversas técnicas para suministrar hormonas exógenas para apoyar la decidualización artificial exitosa o el embarazo después de la transferencia de embriones de donantes sanos. Estas técnicas incluyen inyección subcutánea, pellets de liberación lenta y mini bombas osmóticas. Se discutirán las ventajas y desventajas clave de cada método, lo que permitirá a los investigadores elegir el mejor diseño de estudio para su pregunta de investigación específica.

Introducción

Con el creciente uso de tecnologías de reproducción asistida en las últimas décadas, se han superado muchas barreras para la concepción, lo que permite a muchas parejas formar familias a pesar de los problemas de fertilidad¹. Los déficits de ovocitos o espermatozoides a menudo se pueden evitar mediante fertilización in vitro o inyección intracitoplasmática de espermatozoides; Sin embargo, las cuestiones relacionadas con el útero y la receptividad endometrial siguen siendo una elusiva "caja negra" de potencial reproductivo².

El embarazo se establece cuando un embrión de alta calidad interactúa con éxito con un endometrio receptivo (revestimiento uterino). Las posibilidades de éxito del embarazo en cualquier ciclo menstrual son bajas, alrededor del 30%^3,4. De las que tienen éxito, solo el 50%-60% avanzan más allá de las 20 semanas de gestación, siendo el fracaso de la implantación responsable del 75% de los embarazos que no llegan a las 20 semanas³. A pesar de estas cifras que se remontan a finales de la década de 1990, el campo aún no ha superado las limitaciones causadas por un endometrio inadecuadamente receptivo. Esto ha resultado en un estancamiento - y a veces disminución - de las tasas de éxito de FIV en los últimos años ^5,6.

Las mujeres con infertilidad inexplicable a menudo tienen una ventana desplazada de receptividad o no pueden lograr la receptividad por razones desconocidas. Recientemente, se desarrolló la matriz de receptividad endometrial, que evalúa la expresión de cientos de genes con el propósito de adaptar el momento de la transferencia embrionaria a la ventana de receptividad de un individuo ^7,8,9. Sin embargo, el campo todavía carece de una comprensión de la patogénesis de las complicaciones del embarazo que se manifiestan después de que se completa el proceso de implantación.

El sistema reproductor femenino es altamente dinámico y está bajo un estricto control hormonal. El eje hipotalámico-pituitario-gonadal (HPG) controla la liberación de la hormona luteinizante y la hormona foliculoestimulante, que regulan aspectos del ciclo ovárico, incluida la maduración del folículo y la actividad del estrógeno y la progesterona. A su vez, el ciclo menstrual uterino está regulado por estrógenos y progesterona^10,11. Por lo tanto, el estudio de los mecanismos biológicos uterinos se complica por la influencia ovárica. Por ejemplo, cuando se estudia cómo las terapias contra el cáncer pueden afectar el útero, puede ser difícil distinguir si cualquier fenotipo uterino observado (como la pérdida del embarazo o la aciclicidad menstrual) es el resultado de un insulto directo al útero o un efecto consecuente del daño a los ovarios.

Para comprender de manera integral la fertilidad, se deben caracterizar las contribuciones uterinas al embarazo. Es importante destacar que esta comprensión debe extenderse más allá de la función uterina bajo control ovárico. Esto no se puede estudiar en humanos; Por lo tanto, a menudo se emplean modelos animales. Como tal, la ovariectomía (OVX) se usa comúnmente para permitir a los investigadores regular los ciclos estrales de roedores (análogos al ciclo menstrual) mediante el suministro de hormonas exógenas. Además, el OVX permite estudiar las respuestas uterinas independientemente de la influencia ovárica¹². Sin embargo, si las hormonas no se suministran inmediatamente después de OVX, se producirá un fenotipo de menopausia, que debe ser considerado cuidadosamente por los investigadores.

OVX se utiliza con frecuencia en modelos de roedores 13,14,15,16,17 y es relativamente fácil de realizar después de un entrenamiento adecuado. Los métodos varían dependiendo de si se extirpa el ovario solo o el ovario y el oviducto, así como dependiendo de la edad del animal (los animales adultos en ciclo tienen ovarios más grandes con un cuerpo lúteo visible en su superficie, lo que significa que sus ovarios son más fáciles de visualizar). Del mismo modo, existen muchos métodos de suplementación hormonal, incluidas las inyecciones subcutáneas¹⁴, los gránulos de liberación lenta 15, las mini bombas osmóticas¹⁸ y el injerto de ovario.

En este artículo, se proporcionan instrucciones detalladas sobre cómo realizar la ovariectomía y preparar tres tipos de suplementos hormonales, incluidas las inyecciones subcutáneas, los gránulos de liberación lenta y las mini bombas osmóticas. Se proporcionan dos protocolos detallados para los criterios de valoración experimentales que se benefician de OVX seguido de la suplementación con hormonas exógenas (transferencia de embriones y decidualización artificial). Este artículo discute las fortalezas y debilidades de cada enfoque con el objetivo de guiar a los investigadores sobre cómo realizar estudios para aislar los impactos en el útero, específicamente en los campos de investigación del embarazo y la fertilidad.

Protocolo

Todos los animales fueron alojados en instalaciones de alta barrera con temperatura controlada (Laboratorio de Investigación Animal de la Universidad de Monash) con acceso gratuito a alimentos y agua y un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con la aprobación del comité de ética de la Plataforma de Investigación Animal de Monash (# 21908, 17971) y se realizaron de acuerdo con el Código de Práctica del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud para el cuidado y uso de animales.

1. Preparación quirúrgica

1. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos, gasas y toallas de papel necesarios para los procedimientos en un ciclo de mercancías duras/secas a 121 °C con un tiempo de retención de 30 min y un tiempo de secado de 30 min.
2. Coloque una almohadilla de banco estéril para el espacio de trabajo quirúrgico y prepare analgésicos.
   1. Diluir el carprofeno en solución salina estéril a 1 mg/ml y diluir la bupivacaína en solución salina estéril a una solución salina al 0,5% (p/v).
   2. Agregue 3.5 ml de meloxicam a una botella de agua de jaula de 400 ml.
3. Precaliente la(s) almohadilla(s) térmica(s) para las jaulas de recuperación, y configure lámparas de calor para hacer brillar la luz indirecta sobre los animales en recuperación.
4. Asegúrese de usar todo el EPP adecuado, incluida una red para el cabello, una máscara facial, una bata y guantes.
5. Practique una buena técnica estéril, incluyendo rociar regularmente los guantes con etanol y dejar que se evaporen antes de manipular el animal o las herramientas quirúrgicas para evitar la contaminación por etanol.

2. Realización de la ovariectomía

1. Usando una máquina de anestesia de gas con isoflurano, llene previamente la caja de inducción durante 3-5 min con isoflurano al 5% con el caudal establecido en 4 L / min.
2. Coloca el ratón dentro de la caja de inducción y, una vez inconsciente, muévelo al cono de la nariz y reduce el caudal a 0,4 L/min, con el vaporizador de isoflurano ajustado a ~2,5%.
   NOTA: El porcentaje de isoflurano utilizado para el resto del procedimiento varía según la cepa del ratón, la edad y la exposición a los tratamientos (por ejemplo, quimioterapia) y debe ajustarse en función de una evaluación detallada de los patrones de respiración de cada animal individual. Los patrones de respiración deben permanecer como respiraciones abdominales regulares. Las respiraciones torácicas rápidas pueden indicar que no se ha alcanzado o mantenido un plano quirúrgico profundo; En este caso, ajusta el porcentaje del vaporizador de isoflurano según sea necesario.
3. Aplique lubricante para los ojos generosamente apretando el tubo y frotando suavemente el ojo.
4. Afeite un área pequeña (2 cm x 2 cm) en y debajo de la corazonada de la columna vertebral.
5. Administrar 5 mg/kg de carprofeno de una solución diluida de 1 mg/ml por vía subcutánea en el cuello.
6. Pruebe la profundidad de la anestesia con el reflejo de pellizco del dedo del pie pellizcando el dedo posterior del ratón. Si no hay reacción de pellizco del dedo del pie, el animal está en el plano quirúrgico profundo y el procedimiento puede continuar.
7. Aplique betadine en el área quirúrgica y cúbralo con un paño quirúrgico (una gasa con una ventana de 2 cm x 2 cm recortada).
8. Usando pinzas con dientes de rata, tire de la piel por la corazonada de la espalda hacia arriba y haga una incisión longitudinal de ~ 5 mm.
   NOTA: Una incisión en la piel a esta altura en la espalda del animal es mejor para la colocación quirúrgica del clip para reducir la posibilidad de que el animal retire los clips y requiera reparaciones del clip.
9. Usando fórceps romos, proceda a diseccionar la piel de la capa muscular subyacente, moviéndose hacia abajo y hacia un lado hacia el riñón.
10. Identifique visualmente el riñón, el ovario y la almohadilla de grasa ovárica a través de la pared muscular.
    NOTA: El riñón aparecerá de un color rojo oscuro, la almohadilla de grasa aparecerá de color blanco brillante y, si es visible, el ovario se verá como un pequeño punto rosado dentro de la almohadilla de grasa.
11. Con fórceps, agarre y levante la capa muscular. Haga una incisión de ~0.5-1 cm con tijeras quirúrgicas afiladas. Continúe sosteniendo la pared muscular con fórceps y cambie de tijeras a pinzas romas para tirar de la almohadilla de grasa ovárica a través de la incisión.
12. Con un soporte de aguja curva, sujete debajo del ovario y oviducto en el extremo distal del cuerno uterino.
    NOTA: Alternativamente, el ovario solo se puede extirpar, dejando el oviducto intacto. Sin embargo, se requiere un microscopio de disección para visualizar con precisión la distinción entre el ovario y el oviducto.
13. Retire el ovario con tijeras o un bisturí. Continúe sujetando durante 30 s para evitar el sangrado excesivo.
14. Retire la abrazadera y aplíquela con una gasa estéril si es necesario.
15. Para cerrar la incisión de la pared muscular, use fórceps para levantar la parte superior de la incisión de modo que la incisión se junte naturalmente.
16. Use suturas de seda (tamaño 3-0) para cerrar la incisión de la pared muscular con el nudo de un cirujano.
17. Aplique de dos a tres gotas de bupivacaína tópicamente usando una jeringa de 1 ml sin una aguja conectada, y repita los pasos 2.9-2.17 en el otro lado.
18. Para cerrar la incisión en la piel, use una gasa para secar el área del exceso de bupivacaína y presione los dos lados de la piel juntos.
19. Aplique uno o dos clips quirúrgicos de 7 mm, dejando espacio para la hinchazón como parte del proceso de curación.
20. Mueva el ratón a una jaula de recuperación y vigile de cerca durante 15 minutos.
    NOTA: Los animales deben despertarse rápidamente; Asegúrese de controlar la respiración de cerca para detectar patrones normales de respiración torácica.

3. Preparación hormonal: Inyección subcutánea

1. Hacer una solución madre de estradiol de 1 mg/ml.
   1. Pesar 0,001 g (1 mg) de estradiol en polvo en un tubo estéril de 1,5 ml.
   2. Agregue 1 ml de etanol al 100% al tubo y haga vórtice durante unos segundos.
      NOTA: El etanol permanecerá claro con manchas visibles de polvo de estradiol.
   3. Envuelva el tubo con una película para evitar cualquier evaporación de etanol.
   4. Envuelva el tubo en papel de aluminio y colóquelo en un balancín durante la noche para disolver completamente el polvo de estradiol.
   5. Diluir este stock de 1 mg/ml en aceite de sésamo a la concentración final deseada.
      NOTA: Se requieren dosis de 100 ng durante 3 días para el cebado antes de la decidualización artificial, y se requieren dosis bajas adicionales de 25 ng cuando se administra progesterona. Esto es para combatir el bucle de retroalimentación que controla la expresión del receptor de progesterona. Para la transferencia de embriones, se requieren dos dosis de 100 ng el día 1 y el día 3 antes de la transferencia de embriones el día 4. En el momento de la transferencia de embriones, también se requiere una dosis baja de 25 ng.
   6. Extraiga la cantidad requerida de estradiol en aceite en una jeringa de 1 ml y luego coloque una punta de aguja de 26 G.
   7. Inyectar la dosis apropiada por vía subcutánea (ya sea en el pelaje o en el flanco; 100 ng/100 μL o 25 ng/100 μL para el cebado antes de la transferencia embrionaria o la decidualización artificial o en el momento de la transferencia embrionaria) con la frecuencia requerida.
      NOTA: El aceite es muy viscoso, así que asegúrese de inyectar lentamente y hacer una pausa durante unos segundos antes de retirar la aguja. Esto minimizará la cantidad de aceite que se escapa del sitio de inyección.
2. Haga una solución madre de 200 mg/ml de progesterona.
   1. Pesar 0,4 g (400 mg) de polvo de progesterona en un tubo estéril de 5 ml.
   2. Agregue 2 ml de etanol al 100% al tubo y vórtice durante unos segundos.
      NOTA: El etanol se volverá de color blanco.
   3. Repita los pasos 3.1.3-3.1.4.
   4. Diluir el stock de 200 mg/ml en aceite de sésamo a la concentración final deseada.
      NOTA: Se requieren dosis de 2 mg diarios para apoyar la transferencia de embriones.
   5. Inyecte la dosis adecuada (p. ej., 2 mg/100 μL diarios para apoyar el embarazo) por vía subcutánea como en los pasos 3.1.6-3.1.7.

4. Preparación hormonal: gránulos de liberación lenta

1. Coloque una lámina sobre la superficie de una campana de bioseguridad de flujo laminar o clase II.
2. Coloque todo el equipo (guantes, placas de Petri, jeringas de 1 ml, pinzas finas) en la capucha y encienda la UV durante 20 minutos.
   NOTA: No encienda el UV con el sellador dentro de la campana como se fijará.
3. Lave el tubo silástico en etanol al 100% y deje que se seque al aire en la campana. Una vez seco, marque ~1 cm de longitud a lo largo del tubo y corte con un bisturí.
4. Retire el émbolo de una jeringa y exprima ~200 μL de sellador. Reemplace el émbolo y presione una pequeña cantidad de sellador de la jeringa.
5. Aplique una pequeña cantidad de sellador en un extremo del tubo y alise con un dedo enguantado.
6. Dejar secar durante la noche o durante 20-30 minutos en luz UV dentro de la campana.
7. Vierta una cantidad adecuada de progesterona en una placa de Petri esterilizada. Con pinzas, coloque los gránulos en el polvo de progesterona para llenar el gránulo.
   1. Golpee el extremo sellado del pellet en la superficie de la campana para condensar la progesterona. Alternativamente, use el extremo de los fórceps esterilizados para rellenar la progesterona. Deje suficiente espacio para más sellador.
8. Selle el extremo abierto con sellador, como se describe en los pasos 3.4-3.5.
9. Envuelva la placa de Petri que contiene los gránulos de progesterona en papel de aluminio para protegerla de la luz.
10. Activar los pellets durante un mínimo de 72 h antes de la inserción subcutánea incubando en FCS con extracción de carbón al 1% (cs-FCS: PBS) a 37 °C.
    NOTA: Los pellets se pueden hacer a granel con un solo extremo sellado por adelantado. Sin embargo, se debe usar progesterona fresca para llenarlos cada vez. Asegúrese de que los gránulos prefabricados estén esterilizados con UV antes de llenarlos con progesterona. Los gránulos secretarán ~ 500 μg / día durante 6-10 días, lo cual es suficiente apoyo para los procedimientos de decidualización artificial y transferencia de embriones, aunque puede ser necesaria una inyección adicional de estrógeno en dosis bajas para mantener la actividad del receptor de progesterona más allá de 4-5 días. Más allá de los 10 días, se puede requerir un pellet de progesterona de reemplazo.

5. Preparación hormonal: mini bombas osmóticas

1. Prepare la progesterona a la concentración deseada en una solución acuosa y seleccione el modelo apropiado de mini bomba osmótica (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Para la sección 7 (procedimiento experimental: transferencia embrionaria), se requiere la entrega de 2 mg/día durante 12 días. Por lo tanto, disuelva 28 mg de progesterona en ~ 100 μL de agua estéril por animal (siga las instrucciones del fabricante para el volumen específico). Es posible que se requieran diluciones seriadas. Para la sección 8 (procedimiento experimental: decidualización artificial), se requiere la administración de 500 μg por día durante 3 días. Por lo tanto, disuelva 1,500 μg de progesterona en ~ 100 μL de agua estéril por animal. Prepare una solución adicional para tener en cuenta el volumen perdido durante el procedimiento de llenado.
2. Coloque el equipo (guantes, toallitas con pelusa baja, placas de Petri, solución salina estéril, jeringas de 1 ml, botes pequeños, papel de aluminio y básculas con una precisión de 0,01 g) dentro de una campana de bioseguridad de clase II y luego encienda la UV durante 20 minutos.
3. Extraiga la solución hormonal en una jeringa de 1 ml y luego coloque un tubo de llenado estéril, asegurándose cuidadosamente de que no haya burbujas de aire.
4. Pese la bomba y su moderador de flujo dentro de un bote de pesaje estéril.
5. Inserte el tubo de llenado a través de la abertura en la parte superior de la bomba hasta que no pueda ir más allá.
6. Sosteniendo la bomba en posición vertical, empuje lentamente el émbolo de la jeringa para llenar el tubo.
   NOTA: Se debe evitar el llenado rápido, ya que esto puede introducir burbujas de aire en la bomba.
7. Cuando la solución se desborde de la parte superior de la bomba, retire suavemente el tubo de llenado y limpie el exceso de solución con una toallita estéril con pelusa baja.
8. Inserte el moderador de flujo a través de la abertura en la parte superior de la bomba hasta que no pueda ir más allá. Una vez que esté completamente dentro, presione firmemente la bomba y el moderador de flujo juntos.
9. Pese la bomba llena con el moderador de flujo en su lugar.
   NOTA: La diferencia de peso obtenida de los pasos 5.3 y 5.8 dará el peso neto de la solución cargada (es decir, un aumento de 0,1 g = 100 μL de solución añadida).
10. Coloque la bomba llena en una placa de Petri estéril llena de solución salina estéril.
11. Una vez que todas las bombas estén llenas, envuelva la placa de Petri en papel de aluminio y colóquela dentro de una incubadora a 37 ° C para cebar durante al menos 4-6 h (o hasta que esté lista para usar).

6. Procedimiento quirúrgico: Inserción de pellets de hormonas subcutáneas y mini bombas

1. Preparar el área según la sección 1 (preparación quirúrgica).
2. Anestesiar a los animales según los pasos 2.1-2.3.
3. Afeite un área pequeña en el cuello (~1 cm x 1 cm).
4. Administrar 5 mg/kg de carprofeno de una solución diluida de 1 mg/ml por vía subcutánea en el flanco de la pierna.
5. Prueba del reflejo de pellizco del dedo del pie. Si no hay reflejo, el animal está en el plano quirúrgico profundo y el procedimiento puede comenzar.
6. Aplique betadine en el área quirúrgica y cúbrala con una cortina quirúrgica (una gasa con una ventana de 2 cm x 2 cm recortada).
7. Usando pinzas con dientes de rata, tire de la piel en el cuello (a medio camino entre el verdadero scruff y la corazonada de la espalda) hacia arriba, y haga una incisión longitudinal de ~ 5 mm.
8. Usando fórceps romos, disecciona la piel de la capa muscular subyacente en una dirección hacia abajo.
   NOTA: Para la inserción de una mini bomba osmótica, cree un bolsillo a lo largo de un lado del animal para que la bomba no restrinja el movimiento del animal ni presione contra el sitio de la incisión.
9. Una vez que se haya hecho suficiente espacio para la hormona pellet o mini bomba, use pinzas estériles para recoger la bolita o mini bomba, e insértela en el bolsillo subcutáneo hecho con disección contundente.
10. Para cerrar la incisión en la piel, asegúrese de que el pellet o la mini bomba estén lo suficientemente lejos en el bolsillo para que los clips quirúrgicos no la dañen.
11. Aplique bupivacaína tópicamente según el paso 2.17.
12. Cierre la herida con un clip quirúrgico. Mueva el ratón a una jaula de recuperación y vigile de cerca durante 15 minutos. Como este es un procedimiento corto, los animales deben ser ambulatorios en cuestión de minutos.

7. Procedimiento experimental: Transferencia de embriones

1. Para animales ovariectomizados, la hormona prima 3 días antes de la transferencia embrionaria mediante una inyección subcutánea de 100 ng/100 μL de estradiol (paso 3.1).
2. Un día antes de la transferencia embrionaria, preparar a los animales con una inyección subcutánea de 2 mg/100 μL de acetato de medroxiprogesterona (paso 3.2).
3. Preparar el área según la sección 1 (preparación quirúrgica).
4. Anestesiar a los animales según los pasos 2.1-2.3.
5. Comience el procedimiento según los pasos 2.4-2.10.
6. Bajo un microscopio de disección, cree un punto de inyección intrauterino con una punta de aguja de 26 G.
7. Pipetear cinco blastocistos en una gota de medios M2 y luego transferirlos al cuerno uterino.
8. Para cerrar la incisión de la pared muscular, levante la parte superior de la incisión con fórceps para que la incisión se junte naturalmente.
9. Usando suturas de seda, cierre el sitio de la pared muscular con el nudo de un cirujano. Aplique gotas de bupivacaína tópicamente.
10. Repita los pasos 7.5-7.8 en el otro lado.
11. Para cerrar la incisión en la piel, use una gasa para secar el área del exceso de bupivacaína y presione los dos lados de la piel juntos.
12. Aplique uno o dos clips quirúrgicos, dejando espacio para la hinchazón como parte del proceso de curación.
    NOTA: Si los animales son ovariectomizados, se requieren hormonas exógenas en el momento de la transferencia de embriones. Inyecte progesterona por vía subcutánea (2 mg) o inserte un pellet de progesterona subcutánea o una mini bomba osmótica. Para combatir el exceso de progesterona, se requiere una inyección subcutánea de estrógeno en dosis bajas (25 ng / 100 μL) en el momento de la transferencia de embriones.
13. Lleve cuidadosamente el ratón a una jaula de recuperación y vigile de cerca durante 15 minutos.
    NOTA: Los animales deben despertarse rápidamente; Asegúrese de controlar la respiración de cerca para detectar patrones normales de respiración torácica.

8. Procedimiento experimental: decidualización artificial

1. Preparar a los animales con 100 ng/100 μL de estradiol el día 1, día 2 y día 3, según la sección 3 (preparación hormonal: inyección subcutánea) 8 días antes de la decidualización artificial.
2. Preparar a los animales con 5 ng/100 μL de estradiol el día 7, día 8 y día 9, según la sección 3 (preparación hormonal: inyección subcutánea) 2 días antes de la decidualización artificial.
   NOTA: La inyección final debe ocurrir un mínimo de 3 h (y un máximo de 4 h) antes del procedimiento de decidualización artificial.
3. Animales con hormonas preparadas con un pellet de progesterona subcutánea o una mini bomba osmótica (500 μg/día), según la sección 4, sección 5 y sección 8, 2 días antes de la decidualización artificial.
4. Preparar el área según la sección 1 (preparación quirúrgica).
5. Anestesiar a los animales según los pasos 2.1-2.2.
6. Pruebe la profundidad de la anestesia con el reflejo de pellizco del dedo del pie. Si no hay reacción de pellizco del dedo del pie, el animal está en el plano quirúrgico profundo y el procedimiento puede continuar.
7. Coloque el ratón en posición prona, levante la cola e inserte lentamente un espéculo de 6 mm de diámetro en la vagina.
8. Mientras mantiene la nariz del animal en el cono de la nariz anestésica, coloque la parte inferior del cuerpo del animal entre el primer y el segundo dedo de la mano no dominante. Use el pulgar para empujar suavemente la cola hacia arriba para mantener la abertura vaginal a la vista.
9. Transfiera 20 μL de aceite de sésamo a un cuerno uterino utilizando una punta de transferencia de embriones no quirúrgica (unida a una pipeta de 20 μL).
   1. Manteniendo la pipeta nivelada con la abertura vaginal, inserte la punta en la vagina y a través del cuello uterino en el cuerno uterino. Una vez que la punta esté en el cuerno uterino, presione suavemente la punta contra la superficie endometrial (si usa la técnica de manipulación anterior, este movimiento se sentirá contra el segundo dedo) y expulse lentamente el aceite.
      NOTA: Mantenga presionado el émbolo de la pipeta, espere 10 s para asegurarse de que todo el aceite se haya dispersado y retire lentamente la punta de transferencia mientras mantiene presionado el émbolo.
10. Retire el espéculo de la vagina.
11. Lleve con cuidado el ratón a la jaula de recuperación y vigile de cerca durante 15 minutos.
    NOTA: Los animales deben despertarse rápidamente. Controle su respiración de cerca para detectar patrones normales de respiración torácica.
12. Limite el manejo de los animales y manténgalos en un ambiente tranquilo durante 96 h después del procedimiento.
    NOTA: Los ruidos fuertes o los cambios bruscos en su ciclo de luz y oscuridad afectarán el éxito del procedimiento. En el momento de la disección de tejidos, el grado de éxito de la decidualización se puede medir como una relación entre el peso uterino y el peso corporal. El procedimiento de decidualización artificial tiene una tasa de éxito del 80%. Por lo tanto, excluya a los animales que no logran descifrar y tenga esto en cuenta al seleccionar los tamaños de muestra para los experimentos.

9. Procedimiento quirúrgico: recuperación postquirúrgica, monitoreo y reparaciones de clips

1. Permita que los animales recuperen las almohadillas térmicas medio encendidas y medio apagadas durante la noche antes de devolverlas a la jaula de su hogar.
2. Controle a los animales diariamente durante 5 días después de la cirugía, prestando mucha atención al sitio de la herida para detectar signos de infección.
3. Realice la reparación del clip si es necesario.
   1. Preparar el área según la sección 1 (preparación quirúrgica).
   2. Anestesiar a los animales según los pasos 2.1-2.3.
   3. Extraiga el clip existente con un removedor de clip si el clip todavía está presente.
   4. Aplique un nuevo clip quirúrgico, según los pasos 2.19-2.21.
4. Retire los clips quirúrgicos 7 días después de la cirugía según los pasos 9.3.1-9.3.3 o cuando el animal esté bajo anestesia (como para una transferencia de embriones, el procedimiento de decidualización artificial o una inyección subcutánea después de la cirugía).

Resultados

En este documento de protocolo se describe un modelo bien caracterizado de decidualización artificial (Figura 1A). Aquí, ratones hembra adultos jóvenes (8 semanas de edad) se sometieron a ovariectomía quirúrgica como se describe en la sección 1 y la sección 2. Luego, los ratones descansaron durante 2 semanas para asegurarse de que las hormonas ováricas endógenas se disiparan antes de ser apoyadas con hormonas exógenas como se describe en las secciones 3-7 y se...

Discusión

Este artículo proporciona instrucciones paso a paso sobre cómo realizar OVX y proporcionar hormonas exógenas para estudios centrados en la comprensión de las contribuciones uterinas al embarazo y la fertilidad. Se proporcionan dos protocolos detallados sobre dos aplicaciones experimentales de estos métodos, incluida la realización de la transferencia de embriones y la inducción de la decidualización artificial.

Si bien realizar OVX puede ser un desafío inicialmente, especialmente para...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ALZET 1002 mini osmotic pumps	BioScientific	1002	Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure - Embryo transfer).
ALZET 1003D mini osmotic pumps	BioScientific	1003D	Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure - Artificial decidualization).
ALZET Reflex 7 mm clips	BioScientific	0009971	Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip applicator	BioScientific	0009974	Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip remover	BioScientific	0009976	Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
Bupivicaine injection	Pfizer	NA	Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline
Estradiol	Sigma	E8875
Meloxicam	Ilium	NA	Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 400 mL cage water bottle, or as your institution's vet prescribes.
Michel clips	Daniels	NS-000242
Multi purpose sealant	Dow Corning	732
Non-surgical embryo transfer (NSET) device	ParaTechs	60010	Contains 6 mm speculum. Single use only.
Progesterone	Sigma	P0130	Soluble in ethanol. Use for  section 3 (Hormone preparation - subcutaneous injection) and  section 4 (Hormone preparation - slow-release pellets)
Progesterone	Sigma	P7556	Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation - osmotic mini pumps)
Refresh eye ointment	Allergan	NA	42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin
Rimadyl Carprofen	Zoetis	NA	Stock 50 mg/mL. Use at 1 mg/ml (for 5 mg/kg dose)
Rubber tubing	Dow Corning	508-008	Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ±  0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm.
Sesame oil	Sigma	S3547
Sofsilk Silk sutures size 3-0	Covidien	GS-832