التطور السريع لدوائر تحديد حالة الخلية باستخدام النقل المتعدد

Summary

تستغرق الدوائر الجينية المعقدة وقتا طويلا لتصميمها واختبارها وتحسينها. لتسهيل هذه العملية ، يتم نقل خلايا الثدييات بطريقة تسمح باختبار قياسات متكافئة متعددة لمكونات الدائرة في بئر واحد. يحدد هذا البروتوكول خطوات التخطيط التجريبي والنقل وتحليل البيانات.

Abstract

أظهرت الدوائر الوراثية للثدييات القدرة على استشعار وعلاج مجموعة واسعة من الحالات المرضية ، لكن تحسين مستويات مكونات الدائرة لا يزال يمثل تحديا ويتطلب عمالة مكثفة. لتسريع هذه العملية ، طور مختبرنا النقل المتعدد ، وهو امتداد عالي الإنتاجية لنقل الثدييات التقليدي. في poly-transfection ، تقوم كل خلية في السكان المنقولين بشكل أساسي بإجراء تجربة مختلفة ، واختبار سلوك الدائرة بأرقام نسخ مختلفة من الحمض النووي والسماح للمستخدمين بتحليل عدد كبير من القياسات المتكافئة في تفاعل وعاء واحد. حتى الآن ، تم إثبات عمليات النقل المتعددة التي تعمل على تحسين نسب الدوائر المكونة من ثلاثة مكونات في بئر واحد من الخلايا. من حيث المبدأ ، يمكن استخدام نفس الطريقة لتطوير دوائر أكبر. يمكن تطبيق نتائج النقل المتعدد بسهولة للعثور على النسب المثلى من الحمض النووي إلى النقل المشترك للدوائر العابرة أو لاختيار مستويات التعبير لمكونات الدائرة لتوليد خطوط خلايا مستقرة.

هنا ، نوضح استخدام النقل المتعدد لتحسين دائرة مكونة من ثلاثة مكونات. يبدأ البروتوكول بمبادئ التصميم التجريبي ويشرح كيف يبني النقل المتعدد على طرق النقل المشترك التقليدية. بعد ذلك ، يتم إجراء نقل متعدد للخلايا ويتبعه قياس التدفق الخلوي بعد بضعة أيام. أخيرا ، يتم تحليل البيانات عن طريق فحص شرائح بيانات قياس التدفق الخلوي أحادي الخلية التي تتوافق مع مجموعات فرعية من الخلايا ذات نسب مكونات معينة. في المختبر ، تم استخدام poly-transfection لتحسين مصنفات الخلايا ، والتغذية المرتدة وأجهزة التحكم في التغذية الأمامية ، والزخارف ثنائية الاستقرار ، وغيرها الكثير. تعمل هذه الطريقة البسيطة والقوية على تسريع دورات التصميم للدوائر الجينية المعقدة في خلايا الثدييات.

Introduction

تقدم مجال البيولوجيا التركيبية للثدييات بسرعة ، من تطوير أجزاء بسيطة من الإحساس والاستجابة في خطوط الخلايا المستزرعة إلى تحسين الشبكات المعقدة من الجينات لمواجهة تحديات العالم الحقيقي في التشخيص والعلاج¹. هذه الدوائر المتطورة قادرة على استشعار المدخلات البيولوجية من ملفات تعريف microRNA إلى السيتوكينات إلى أدوية الجزيئات الصغيرة ، وتنفيذ دوائر المعالجة المنطقية بما في ذلك الترانزستورات ومرشحات تمرير النطاق ومفاتيح التبديل والمذبذبات. كما أظهروا نتائج واعدة في النماذج الحيوانية لأمراض مثل السرطان والتهاب المفاصل والسكري وغيرها الكثير¹،²،³،^4،5. ومع ذلك ، مع نمو تعقيد الدائرة ، يصبح تحسين مستويات كل مكون من مكوناتها أمرا صعبا بشكل متزايد.

أحد الأنواع المفيدة بشكل خاص من الدوائر الوراثية هو مصنف الخلايا ، والذي يمكن برمجته لاستشعار الحالات الخلوية والاستجابة لها. يعد الإنتاج الانتقائي لمخرجات البروتين أو الحمض النووي الريبي في حالات خلوية محددة أداة قوية لتوجيه وبرمجة تمايز الخلايا والكائنات العضوية ، وتحديد وتدمير الخلايا المريضة و / أو أنواع الخلايا غير المرغوب فيها ، وتنظيم وظيفة الخلايا العلاجية¹،²،³،^4،5. ومع ذلك ، فإن إنشاء دوائر في خلايا الثدييات يمكنها تصنيف حالات الخلايا بدقة من أنواع متعددة من الحمض النووي الريبي الخلوي و / أو أنواع البروتين كان أمرا صعبا للغاية.

تتمثل إحدى الخطوات الأكثر استهلاكا للوقت في تطوير دائرة تصنيف الخلية في تحسين مستويات التعبير النسبية للجينات المكونة الفردية ، مثل أجهزة الاستشعار وعوامل المعالجة ، داخل الدائرة. لتسريع تحسين الدوائر والسماح ببناء دوائر أكثر تطورا ، استخدم العمل الأخير النمذجة الرياضية لدوائر تصنيف الخلايا ومكوناتها للتنبؤ بالتركيبات والطوبولوجيا المثلى ^6,7. في حين أن هذا أظهر نتائج قوية حتى الآن ، فإن التحليل الرياضي محدود بسبب الحاجة إلى توصيف سلوك المدخلات والمخرجات للجينات المكونة في الدائرة بشكل منهجي ، وهو ما يستغرق وقتا طويلا. علاوة على ذلك ، يمكن أن يظهر عدد لا يحصى من المشكلات المعتمدة على السياق في الدوائر الجينية المعقدة ، مما يتسبب في سلوك دائرة كاملة لتحدي التنبؤات بناء على توصيفات الأجزاء الفردية ^8,9.

لتطوير واختبار دوائر الثدييات المعقدة بسرعة أكبر مثل مصنفات حالة الخلية ، طور مختبرنا تقنية تسمى poly-transfection¹⁰ ، وهي تطور لبروتوكولات النقل المشترك للبلازميد. في النقل المشترك ، يتم تعقيد أنواع متعددة من الحمض النووي البلازميد مع كاشف دهني أو بوليمر موجب الشحنة ، ثم يتم تسليمه إلى الخلايا بطريقة مترابطة (الشكل 1 أ). في النقل المتعدد ، يتم تعقيد البلازميدات بشكل منفصل مع الكاشف ، بحيث يتم تسليم الحمض النووي من كل مركب نقل إلى الخلايا بطريقة غير مترابطة (الشكل 1 ب). باستخدام هذه الطريقة ، تتعرض الخلايا داخل السكان المنقولين لمجموعات عديدة من نسب حمولتين أو أكثر من الحمض النووي تحمل مكونات دائرة مختلفة.

لقياس نسب مكونات الدائرة التي يتم تسليمها إلى كل خلية ، يحتوي كل مركب نقل داخل متعدد النقل على مراسل فلوري معبر عنه بشكل أساسي يعمل كوكيل للامتصاص الخلوي للمجمع. يتم استخدام الحمض النووي للحشو الذي لا يحتوي على أي عناصر نشطة داخل خلية الثدييات لضبط الكمية النسبية لمراسل الفلورسنت ومكونات الدائرة التي يتم تسليمها إلى خلية في مجمع نقل واحد ويتم مناقشته بمزيد من التفصيل في المناقشة. مثال على الحمض النووي للحشو المستخدم في مختبر فايس هو البلازميد الذي يحتوي على تسلسل الفاصل ، ولكن لا يوجد مروج ، تسلسل ترميز ، إلخ. يمكن بعد ذلك مقارنة الخلايا ذات النسب المختلفة لمكونات الدائرة لإيجاد النسب المثلى لوظيفة الدائرة الجينية. وهذا بدوره يعطي تنبؤات مفيدة لاختيار المروجين وعناصر الدائرة الأخرى لتحقيق مستويات التعبير الجيني المثلى عند الجمع بين مكونات الدائرة في ناقل واحد للتكامل الجيني (على سبيل المثال ، فيروس lentivirus أو transposon أو منصة الهبوط). وبالتالي ، بدلا من اختيار النسب بين مكونات الدائرة بناء على الحدس أو عبر عملية التجربة والخطأ التي تستغرق وقتا طويلا ، يقوم النقل المتعدد بتقييم مجموعة واسعة من القياسات المتكافئة بين الأجزاء الجينية في تفاعل وعاء واحد.

في مختبرنا ، مكن النقل المتعدد من تحسين العديد من الدوائر الجينية ، بما في ذلك مصنفات الخلايا ، والتغذية المرتدة وأجهزة التحكم في التغذية الأمامية ، والزخارف ثنائية الاستقرار. هذه الطريقة البسيطة والقوية تسرع بشكل كبير دورات التصميم للدوائر الجينية المعقدة في خلايا الثدييات. ومنذ ذلك الحين ، تم استخدام النقل المتعدد لتوصيف العديد من الدوائر الجينية للكشف عن وظائف نقل المدخلات والمخرجات متعددة الأبعاد بدقة^{عالية 10} ، وتحسين طوبولوجيا الدائرة البديلة لتصنيف حالة الخلية¹¹ ، وتسريع مختلف المشاريع^{المنشورة 12،13} والمشاريع الجارية.

هنا نصف ونصور سير العمل لاستخدام النقل المتعدد لتحسين الدائرة الجينية بسرعة (الشكل 2). يوضح البروتوكول كيفية إنشاء بيانات نقل متعدد عالية الجودة وتجنب العديد من الأخطاء الشائعة في بروتوكول النقل المتعدد وتحليل البيانات (الشكل 3). ثم يوضح كيفية استخدام النقل المتعدد لتوصيف مكونات الدائرة البسيطة ، وفي هذه العملية ، قياس نتائج النقل المتعدد مقابل النقل المشترك (الشكل 4). أخيرا ، تظهر نتائج النقل المتعدد تحسين دائرة مصنف السرطان (الشكل 5).

Protocol

ملاحظة: يعمل الجدولان 1 و2 كمرجعين هامين لهذا البروتوكول. يوضح الجدول 1 مقياس الكاشف للتفاعلات ، ويبين الجدول 2 حساب نسبة الحمض النووي لمثال متعدد النقل الموصوف في البروتوكول (النصف العلوي) ولتجربة متابعة محتملة (النصف السفلي).

1. تحضير الخلايا للانتقال

1. تأكد من أن مزرعة خلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK293) متقاربة بنسبة 60٪ -80٪ قبل بدء البروتوكول. للقيام بذلك ، قم بزرع 1 × 10⁶ خلايا في طبق بتري لزراعة الأنسجة 100 مم × 15 مم قبل يومين ، واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂.
   ملاحظة: على الرغم من أن بروتوكولنا يركز على خلايا HEK293 ، فقد يتم استبدال أنواع الخلايا الأخرى.
2. قم بإعداد الوسائط والخلايا لعمليات النقل كما هو موضح أدناه.
   1. قم بتسخين ما لا يقل عن 20 مل من محلول وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع مصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) و 1٪ أحماض أمينية غير أساسية (NEAA ؛ انظر جدول المواد) إلى 37 درجة مئوية. قم بتسخين ما لا يقل عن 2.4 مل من التربسين و 2.4 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) إلى 37 درجة مئوية أيضا. قبل التسخين خفض المصل المتوسط إلى ~ 16 °C.
      ملاحظة: يجب إجراء جميع أعمال زراعة الأنسجة بعناية في خزانة السلامة البيولوجية.
3. أعد تعليق الخلايا في محلول DMEM كما هو موضح أدناه.
   1. نضح والتخلص من وسائل الإعلام الحالية. قم بتوزيع 2 مل من برنامج تلفزيوني على مزرعة الخلايا HEK293 لغسل الخلايا. نضح والتخلص من برنامج تلفزيوني.
   2. وزع 2 مل من التربسين على مزرعة خلايا HEK293. ضع طبق بتري في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق أو حتى تتوقف الخلايا عن الالتصاق بالطبق. أعد الطبق إلى خزانة السلامة الحيوية وقم بتخفيف محلول الخلية عن طريق توزيع 8 مل من محلول DMEM في الطبق.
   3. امزج المحلول عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات. نضح جميع الوسائط ووضعها في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
4. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × غرام لمدة 3 دقائق لتكويتها. نضح الوسائط (مع الحرص على عدم استنشاق الخلايا) والتخلص منها. أعد تعليق الخلايا في 5 مل من محلول DMEM ، واخلطها عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل.
5. قم بتقدير تركيز الخلية الحالي باستخدام عداد خلية آلي (مدرج في جدول المواد). بذر ستة آبار (في هذا المثال) في صفيحة 24 بئرا مع 1 × 10⁵ خلايا (لكثافة بذر تبلغ 50000 خلية / سم²).
6. أضف محلول DMEM حتى 500 ميكرولتر (أضف محلول DMEM إلى الآبار أولا) ، ثم قم بتسمية بئر واحد لكل معالجة على النحو التالي: لا يوجد تحكم في اللون ، وتحكم mKO2 ، وتحكم TagBFP ، وتحكم NeonGreen ، وكل التحكم في الألوان ، و poly-transfection 1. آبار التحكم TagBFP و mKO2 و NeonGreen هي عناصر تحكم أحادية اللون لجميع البروتينات الفلورية المدرجة في النقل المتعدد.

2. أداء نقل

1. تحضير الأنابيب لكل مجموع الحمض النووي. ضع جانبا أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل وقم بتسمية الأنابيب على النحو التالي: لا يوجد تحكم في اللون ، والتحكم في mKO2 ، والتحكم في TagBFP ، والتحكم في NeonGreen ، والتحكم في جميع الألوان ، ومزيج النقل المتعدد 1 ، ومزيج النقل المتعدد 2.
   1. أضف 36 ميكرولتر من وسط المصل المخفض إلى التحكم في عدم التحكم في الألوان ، والتحكم mKO2 ، والتحكم في TagBFP ، والتحكم في NeonGreen ، وجميع أنابيب التحكم في الألوان. أضف 18 ميكرولتر من وسط المصل المختزل إلى كل من أنابيب مزيج البولي نقل 1 ومزيج البولي نقل 2.
      ملاحظة: يفترض أن تكون تركيزات البلازميد 150 نانوغرام / ميكرولتر.
   2. أضف 600 نانوغرام من بلازميد الحشو إلى أنبوب عدم التحكم في اللون. أضف 300 نانوغرام من mKO2 و 300 نانوغرام من بلازميد الحشو إلى أنبوب التحكم في الألوان mKO2. أضف 300 نانوغرام من TagBFP و 300 نانوغرام من بلازميد الحشو إلى أنبوب التحكم في الألوان TagBFP.
   3. أضف 300 نانوغرام من بلازميد NeonGreen التأسيسي و 300 نانوغرام من بلازميد الحشو إلى أنبوب التحكم في اللون NeonGreen. أضف 100 نانوغرام لكل من mKO2 و TagBFP و NeonGreen التأسيسي ، بالإضافة إلى 300 نانوغرام من بلازميد الحشو ، إلى أنبوب التحكم في الألوان بالكامل.
   4. أضف 150 نانوغرام من mKO2 إلى أنبوب مزيج 1 متعدد النقل. أضف 75 نانوغرام من البلازميد NeonGreen المراسل و 75 نانوغرام من بلازميد الحشو إلى أنبوب مزيج 1 متعدد النقل.
   5. أضف 150 نانوغرام من TagBFP إلى أنبوب مزيج 2 متعدد النقل. أضف 75 نانوغرام من بلازميد L7ae و 75 نانوغرام من بلازميد الحشو إلى أنبوب مزيج 2 متعدد النقل.
2. قم بإنشاء المزيج الرئيسي للنقل في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل من خلال الجمع بين 216 ميكرولتر من وسط المصل المختزل مع 9.48 ميكرولتر من كاشف النقل (انظر الجدول 1 لنسب الكاشف ومقياس التفاعل). تخلط جيدا عن طريق سحب الماصة لأعلى ولأسفل ، وتوضع جانبا.
3. أضف 1.58 ميكرولتر من كاشف المحسن إلى كل من عدم التحكم في الألوان والتحكم في اللون الفردي وجميع أنابيب التحكم في الألوان. أضف 79 ميكرولتر من كاشف المحسن إلى كل أنبوب من أنابيب مزيج النقل المتعدد. امزج كل أنبوب على حدة عن طريق سحب الإصبع بقوة.
4. أضف المزيج الرئيسي للنقل إلى كل أنبوب يحتوي على الحمض النووي.
   1. أضف 37.58 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للنقل إلى كل من أنابيب التحكم في اللون بدون والتحكم في اللون الفردي وجميع أنابيب التحكم في الألوان. امزج كل أنبوب على حدة عن طريق سحب الإصبع بقوة.
   2. أضف 18.79 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للنقل إلى كل أنبوب من أنابيب مزيج النقل المتعدد. امزج كل أنبوب على حدة عن طريق سحب الإصبع بقوة.
5. الاستغناء عن خلطات النقل في الآبار.
   1. ماصة 65.97 ميكرولتر من كل مزيج نقل لعدم وجود لون ، لون واحد ، وجميع عناصر التحكم في الألوان في الآبار المقابلة.
   2. ماصة 32.98 ميكرولتر من بولي نقل مزيج 1 في بئر بولي نقل وتدوير اللوحة بسرعة ولكن بلطف في نمط الشكل ثمانية ضيق على طول سطح مستو لتوزيع المجمعات بشكل فعال. بعد ذلك ، تخلط ماصة 32.98 ميكرولتر من poly-transfection 2 في نفس بئر النقل المتعدد وتدور اللوحة بنفس الطريقة.
6. ضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، مع 5٪ CO₂ وبدون اهتزاز ، لمدة 48 ساعة.
   ملاحظة: لزيادة صلاحية الخلية ، يمكن استبدال وسائط الخلية كل 6 ساعات بعد النقل (على الرغم من أن هذا ليس ضروريا دائما ، ومع خلايا HEK293 ومشتقاتها ، يجب على المرء أن يكون حريصا على عدم فصل الخلايا عن اللوحة عند تغيير الوسائط).

الكاشف	مبلغ			القياس
انخفاض وسط المصل لخليط الحمض النووي	36 ميكرولتر لكل أنبوب تحكم ، 18 ميكرولتر لكل أنبوب متعدد النقل			0.05 ميكرولتر انخفاض الحمض النووي المتوسط / نانوغرام في المصل لكل أنبوب ، مع حجم إضافي بنسبة 10-20٪ لحساب السحب
دنا	300-600 نانوغرام لكل أنبوب
ص 3000	1.58 ميكرولتر لكل أنبوب تحكم ، 0.79 ميكرولتر لكل أنبوب متعدد النقل			0.0022 ميكرولتر P3000 / نانوغرام DNA لكل أنبوب ، مع 10-20٪ إضافية
وسط مصل مخفض لمزيج ليبو ماستر	36 ميكرولتر لكل أنبوب تحكم ، 18 ميكرولتر لكل أنبوب متعدد النقل			0.05 ميكرولتر مخفض من الحمض النووي المتوسط / نانوغرام في المصل ، مع حجم إضافي بنسبة 10-20٪ لحساب السحب
كاشف النقل والمحسن	1.58 ميكرولتر لكل أنبوب تحكم ، 0.79 ميكرولتر لكل أنبوب متعدد النقل			0.0022 ميكرولتر ليبوفيكتامين 3000 / نانوغرام الحمض النووي ، مع 10-20٪ إضافية

الجدول 1: تحجيم الكاشف لعمليات النقل. يوضح الجدول النسبة الصحيحة للكاشف المطلوب تضمينها لكمية الحمض النووي (DNA) المضمنة في بئر واحدة. يمكن استخدام هذا لقياس التفاعلات بشكل فعال وتشكيل خلطات رئيسية. تم تحجيم كميات الكاشف لتشمل زيادة بنسبة 20٪.

3. تحضير الخلايا لقياس التدفق الخلوي

1. قم بتسخين 4.2 مل على الأقل من محلول DMEM مسبقا إلى 37 درجة مئوية. قم بتسخين 4.2 مل على الأقل من التربسين و 4.2 مل من PBS إلى 37 درجة مئوية. احتفظ بمحلول المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) عند 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
2. إعادة تعليق الخلايا في محلول المخزن المؤقت FACS (PBS مكمل ب 1٪ BSA ، 5 mM إيثيلين ديامينيترايتيك حمض [EDTA] ، و 0.1٪ أزيد الصوديوم [NaN₃] ، لتقليل التكتل ؛ انظر جدول المواد) كما هو موضح أدناه.
   1. نضح والتخلص من الوسائط الحالية في كل بئر. قم بتوزيع 5 مل من برنامج تلفزيوني في كل بئر لغسل الخلايا. نضح والتخلص من برنامج تلفزيوني.
   2. قم بتوزيع 5 مل من التربسين في كل بئر. ضع الطبق في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، أو حتى لا تلتصق الخلايا بالطبق. أعد اللوحة إلى خزانة السلامة الحيوية وقم بتخفيف محاليل الخلايا عن طريق توزيع 5 مل من محلول DMEM في كل بئر.
   3. لكل بئر ، امزج المحلول عن طريق سحب السحب برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات. لكل بئر ، قم بشفط جميع الوسائط ووضعها في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
3. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × غرام لمدة 3 دقائق لتكويتها. نضح وسائل الإعلام ، مع الحرص على عدم استنشاق الخلايا والتخلص منها. في كل أنبوب ، أعد تعليق الخلايا في 5 مل من محلول FACS العازلة ، واخلطها عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل.
4. مرر كل محلول معلق للخلية من خلال مصفاة (لإزالة الكتل) في أنابيب مخروطية منفصلة لقياس التدفق الخلوي. احتفظ بهذه الأنابيب على الجليد لمدة لا تزيد عن 1 ساعة ، وقم بإجراء قياس التدفق الخلوي في أسرع وقت ممكن.

4. إجراء قياس التدفق الخلوي

ملاحظة: يتطلب تشغيل مقياس التدفق الخلوي التدريب المناسب ومعرفة المهام الضرورية. نظرا لأن البرامج والمعدات قد تختلف ويجب تدريب المستخدمين بشكل عام ، يشير هذا القسم إلى عمليات محددة مفيدة للأداء.

1. أولا ، افحص الخلايا المنقولة باستخدام التحكم في بلازميد الحشو (بدون تحكم في اللون) لتحديد خصائص الخلية وتجنب الحالات الشاذة (بما في ذلك الركام والحطام وما إلى ذلك). في حين أن هناك العديد من مجموعات المعلمات لتمييز الخلايا ، استخدم الخيارات العامة الثلاثة التالية كطريقة جيدة لتصور الميزات المميزة.
   1. انظر إلى منطقة التشتت الجانبية (log أو المقياس الخطي لكل تفضيل / نوع الخلية) مقابل منطقة التشتت الأمامية (مقياس خطي).
   2. انظر إلى ارتفاع التشتت الجانبي (مقياس اللوغاريتم) مقابل عرض التشتت الجانبي (المقياس الخطي).
   3. انظر إلى عرض التشتت الأمامي (المقياس الخطي) مقابل ارتفاع التشتت الأمامي (المقياس الخطي).
2. بعد ذلك ، انظر إلى عناصر التحكم في اللون الفردي. استخدم التحكم في كل الألوان لضبط جهد الجهاز ، بحيث يتم تطبيع الإشارات من كل بروتين فلوري إلى وحدات عشوائية مكافئة (a.u.) من التألق. بعد ذلك ، قم بتشغيل عناصر التحكم أحادية اللون لكل بروتين فلوري ، والتي تستخدم لضبط مصفوفة التعويض ، مما يسمح بتصحيح النزيف.
   ملاحظة: من الناحية المثالية ، يجب أن يكون النطاق الديناميكي الكامل لقيم التألق مرئيا. يمكن إجراء مزيد من التطبيع لإشارات البروتين الفلوري عن طريق التحويل إلى وحدات موحدة (على سبيل المثال ، جزيئات الفلوريسئين المكافئ [MEFLs ؛ انظر Beal et ^al.15]). لتمكين تحويل MEFL أثناء التحليل ، قم بتشغيل حبات معايرة قوس قزح. هذه المعايرة مفيدة أيضا لتقليل تباين الإشارة من أداة إلى أخرى ومن يوم إلى^{يوم 16}.
3. قم بتشغيل أنبوب عينة النقل المتعدد.
   ملاحظة: حيثما أمكن ، يوصى بتشغيل خلايا 1,000 × 10 ^ (^ = يمزج) ، حيث يجب تقسيم عمليات النقل المتعددة عالية الأبعاد إلى المزيد من الصناديق أثناء التحليل ، ويحتاج كل صندوق إلى خلايا كافية (من الناحية المثالية >10) لإجراء مقارنات ذات دلالة إحصائية.

5. إجراء تحليل ما بعد التجربة

1. في البداية ، استخدم البيانات من عناصر التحكم (وإذا أمكن ، الخرزات) لضمان نتائج دقيقة. استخدم إحدى أدوات البرامج المتاحة لأداء بوابات الخلايا الحية (باستخدام البوابات الموضحة أعلاه) ، والتعويض ، وتصحيح التألق الذاتي.
   ملاحظة: نستخدم عادة إما كود MATLAB المخصص (على سبيل المثال ، https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis أو Cytoflow¹⁷) ، والذي يحتوي على واجهة مستخدم رسومية ومكتبة بيثون مناسبة لمرحلة المعالجة المسبقة ولتحليل النقل المتعدد.

أسلوب	معقد	نانوغرام علامة الفلورسنت	نانوغرام L7ae (كسر)	نانوغرام مراسل (كسر)	نانوغرام حشو الحمض النووي (جزء)	المجموع (نانوغرام)
بولي ترانسفيشن 1						600
→	1	150	75 (½)		75 (½)	300
→	2	150		75 (½)	75 (½)	300
بولي ترانسفيشن 2						600
→	1	150	25 (1/6)		125 (5/6)	300
→	2	150		125 (5/6)	25(1/6)	300

الجدول 2: كميات الحمض النووي للانتقال المتعدد الموضحة في البروتوكول ، ومثال على تجربة متابعة مع نسب البلازميد المضبوطة. يوضح النصف العلوي من الجدول تركيب البلازميدات المستخدمة في تجربة نقل متعدد. يظهر النصف السفلي تكوين تجربة محدثة تقوم بضبط نسب البلازميد لأخذ عينة فرعية أفضل من مساحة تركيز افتراضية ، حيث يكون معدل التعبير الجيني بنسبة 1: 5 مثالية بالنسبة لمراسله ، مما ينتج عنه المزيد من الخلايا المنقولة لأخذ عينات حول هذه النسبة.

النتائج

في الشكل 1 ، نقارن النقل المشترك بالنقل المتعدد. في النقل المشترك ، يتم تسليم جميع البلازميدات في نفس مزيج النقل ، مما يؤدي إلى ارتباط كبير بين كمية كل بلازميد تتلقاه أي خلية واحدة (الشكل 1 أ). في حين أن عدد البلازميدات الكلية التي يتم توصيلها إلى كل خلية يختلف...

Discussion

أحدثت طرق النماذج الأولية السريعة مثل التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) وألواح التجارب والطباعة ثلاثية الأبعاد 3D ثورة في تخصصات الهندسة الميكانيكية والكهربائية والمدنية. إن القدرة على البحث بسرعة من خلال العديد من الحلول الممكنة لتحد معين تسرع بشكل كبير من التقدم في مجال ما. نعتقد أن النقل ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15mL Corning Falcon conical tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
24-well petri dish	Any company of choice		(Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin	NEB	B9000S
Centrifuge	Any company of choice		Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
Cytoflow	Non-commercial software package		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	Use the correct media for your cell type
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich	F4135
HEK cells	ATCC	CRL-1573	Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells	ATCC	CRL-12401	Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer	ThermoFisher Scientific	L3000001	Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer	BD Biosciences	N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Any company of choice
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	31985070	reduced serum medium
Phosphate buffered saline	ThermoFisher Scientific	70011044
Rainbow calibration beads	Spherotech	URCP-100-2H
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Trypsin	VWR	25-053-CI