Développement rapide de circuits d’identification de l’état cellulaire avec poly-transfection

Résumé

Les circuits génétiques complexes prennent beaucoup de temps à concevoir, à tester et à optimiser. Pour faciliter ce processus, les cellules de mammifères sont transfectées de manière à permettre de tester plusieurs stœchiométrie des composants du circuit dans un seul puits. Ce protocole décrit les étapes de la planification expérimentale, de la transfection et de l’analyse des données.

Résumé

Les circuits génétiques des mammifères ont démontré le potentiel de détecter et de traiter un large éventail d’états pathologiques, mais l’optimisation des niveaux de composants du circuit reste difficile et exigeante en main-d’œuvre. Pour accélérer ce processus, notre laboratoire a développé la poly-transfection, une extension à haut débit de la transfection traditionnelle des mammifères. Dans la poly-transfection, chaque cellule de la population transfectée effectue essentiellement une expérience différente, testant le comportement du circuit à différents nombres de copies d’ADN et permettant aux utilisateurs d’analyser un grand nombre de stœchiométrie dans une réaction à pot unique. Jusqu’à présent, des polytransfections qui optimisent les rapports des circuits à trois composants dans un seul puits de cellules ont été démontrées; En principe, la même méthode peut être utilisée pour le développement de circuits encore plus grands. Les résultats de la polytransfection peuvent être facilement appliqués pour trouver des rapports optimaux d’ADN à co-transfect pour les circuits transitoires ou pour choisir des niveaux d’expression pour les composants du circuit pour la génération de lignées cellulaires stables.

Ici, nous démontrons l’utilisation de la poly-transfection pour optimiser un circuit à trois composants. Le protocole commence par des principes de conception expérimentale et explique comment la polytransfection s’appuie sur les méthodes traditionnelles de co-transfection. Ensuite, la poly-transfection des cellules est réalisée et suivie d’une cytométrie en flux quelques jours plus tard. Enfin, les données sont analysées en examinant des tranches des données de cytométrie en flux unicellulaire qui correspondent à des sous-ensembles de cellules avec certains rapports de composants. En laboratoire, la polytransfection a été utilisée pour optimiser les classificateurs cellulaires, les contrôleurs de rétroaction et de feedforward, les motifs bistables et bien d’autres. Cette méthode simple mais puissante accélère les cycles de conception de circuits génétiques complexes dans les cellules de mammifères.

Introduction

Le domaine de la biologie synthétique des mammifères a rapidement progressé, passant du développement de simples parties sensorielles et réactives dans des lignées cellulaires cultivées à l’optimisation de réseaux complexes de gènes pour relever les défis du monde réel en matière de diagnostic et de thérapeutique¹. Ces circuits sophistiqués sont capables de détecter les entrées biologiques des profils de microARN aux cytokines en passant par les médicaments à petites molécules, et de mettre en œuvre des circuits de traitement logique, notamment des transistors, des filtres passe-bande, des interrupteurs à bascule et des oscillateurs. Ils ont également montré des résultats prometteurs dans des modèles animaux de maladies comme le cancer, l’arthrite, le diabète et bien d’autres 1,2,3,4,5. Cependant, à mesure que la complexité d’un circuit augmente, l’optimisation des niveaux de chacun de ses composants devient de plus en plus difficile.

Un type de circuit génétique particulièrement utile est un classificateur cellulaire, qui peut être programmé pour détecter et répondre aux états cellulaires. La production sélective de protéines ou d’ARN dans des états cellulaires spécifiques est un outil puissant pour guider et programmer la différenciation des cellules et des organoïdes, identifier et détruire les cellules malades et/ou les types de cellules indésirables, et réguler la fonction des cellules thérapeutiques 1,2,3,4,5 . Cependant, la création de circuits dans les cellules de mammifères capables de classer avec précision les états cellulaires de plusieurs espèces d’ARN cellulaire et / ou de protéines a été très difficile.

L’une des étapes les plus chronophages du développement d’un circuit de classification cellulaire consiste à optimiser les niveaux d’expression relatifs des gènes composants individuels, tels que les capteurs et les facteurs de traitement, dans le circuit. Pour accélérer l’optimisation des circuits et permettre la construction de circuits plus sophistiqués, des travaux récents ont utilisé la modélisation mathématique des circuits de classificateur de cellules et de leurs composants pour prédire des compositions et des topologies optimales ^6,7. Bien que cela ait montré des résultats puissants jusqu’à présent, l’analyse mathématique est limitée par la nécessité de caractériser systématiquement le comportement d’entrée-sortie des gènes composant dans le circuit, ce qui prend du temps. En outre, une myriade de problèmes dépendants du contexte peuvent émerger dans des circuits génétiques complexes, ce qui fait que le comportement d’un circuit complet défie les prédictions basées sur des caractérisations de parties individuelles ^8,9.

Pour développer et tester plus rapidement des circuits complexes de mammifères tels que les classificateurs d’état cellulaire, notre laboratoire a développé une technique appelée poly-transfection¹⁰, une évolution des protocoles de co-transfection plasmidique. Dans la co-transfection, plusieurs espèces d’ADN plasmidique sont complexées avec un réactif lipidique ou polymère chargé positivement, puis livrées aux cellules de manière corrélée (Figure 1A). Dans la polytransfection, les plasmides sont complexés séparément avec le réactif, de sorte que l’ADN de chaque complexe de transfection est livré aux cellules de manière décorrélée (Figure 1B). En utilisant cette méthode, les cellules de la population transfectée sont exposées à de nombreuses combinaisons de rapports de deux charges utiles d’ADN ou plus portant différents composants de circuit.

Pour mesurer les rapports des composants du circuit délivrés à chaque cellule, chaque complexe de transfection au sein d’une polytransfection contient un rapporteur fluorescent exprimé de manière constitutive qui sert d’indicateur de l’absorption cellulaire du complexe. L’ADN de remplissage qui ne contient aucun élément actif dans une cellule de mammifère est utilisé pour ajuster la quantité relative du rapporteur fluorescent et des composants du circuit livrés à une cellule dans un seul complexe de transfection et est discuté plus en détail dans la discussion. Un exemple d’ADN de remplissage utilisé dans le laboratoire Weiss est un plasmide contenant une séquence terminatrice, mais pas de promoteur, de séquence codante, etc. Les cellules avec différents ratios de composants de circuit peuvent ensuite être comparées pour trouver des rapports optimaux pour la fonction du circuit génétique. Cela donne à son tour des prédictions utiles pour choisir les promoteurs et autres éléments du circuit afin d’atteindre des niveaux optimaux d’expression génique lors de la combinaison de composants de circuit en un seul vecteur d’intégration génétique (par exemple, un lentivirus, un transposon ou une aire d’atterrissage). Ainsi, au lieu de choisir des rapports entre les composants du circuit en fonction de l’intuition ou d’un processus d’essais et d’erreurs fastidieux, la polytransfection évalue un large éventail de stœchiométrie entre les parties génétiques dans une réaction à pot unique.

Dans notre laboratoire, la polytransfection a permis l’optimisation de nombreux circuits génétiques, y compris les classificateurs cellulaires, les contrôleurs de rétroaction et de feedforward, et les motifs bistables. Cette méthode simple mais puissante accélère considérablement les cycles de conception de circuits génétiques complexes dans les cellules de mammifères. La polytransfection a depuis été utilisée pour caractériser plusieurs circuits génétiques afin de révéler leurs fonctions de transfert d’entrées-sorties multidimensionnelles à haute résolution 10, d’optimiser une topologie de circuit alternative pour la classification de l’état cellulaire¹¹ et d’accélérer divers projets publiés^12,13 et en cours.

Nous décrivons et décrivons ici le flux de travail pour utiliser la polytransfection afin d’optimiser rapidement un circuit génétique (Figure 2). Le protocole montre comment générer des données de polytransfection de haute qualité et éviter plusieurs erreurs courantes dans le protocole de polytransfection et l’analyse des données (Figure 3). Il montre ensuite comment utiliser la polytransfection pour caractériser des composants de circuits simples et, ce faisant, comparer les résultats de la polytransfection à la co-transfection (Figure 4). Enfin, les résultats de la poly-transfection montrent une optimisation du circuit classificateur du cancer (Figure 5).

Protocole

NOTE: Les tableaux 1 et 2 servent de références importantes pour ce protocole. Le tableau 1 montre la mise à l’échelle des réactifs pour les réactions, et le tableau 2 montre l’arithmétique du rapport ADN pour un exemple de polytransfection décrit dans le protocole (moitié supérieure) et pour une éventuelle expérience de suivi (moitié inférieure).

1. Préparation des cellules pour la transfection

1. Assurez-vous que la culture de cellules rénales embryonnaires humaines (HEK293) est confluente à 60% à 80% avant de commencer le protocole. Pour ce faire, ensemencez 1 x 10⁶ cellules dans une boîte de Pétri de culture tissulaire de 100 mm x 15 mm 2 jours auparavant, et incuber à 37 °C avec 5% de CO₂.
   REMARQUE: Bien que notre protocole se concentre sur les cellules HEK293, d’autres types de cellules peuvent être substitués.
2. Préparer les milieux et les cellules pour les transfections comme décrit ci-dessous.
   1. Préchauffer au moins 20 mL d’une solution de milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % d’acides aminés non essentiels (NEAA; voir le tableau des matières) à 37 °C. Préchauffer au moins 2,4 mL de trypsine et 2,4 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 37 °C également. Préchauffer le milieu sérique réduit à ~16 °C.
      REMARQUE : Tous les travaux de culture tissulaire doivent être effectués avec soin dans une enceinte de biosécurité.
3. Remettez les cellules en suspension dans la solution DMEM comme décrit ci-dessous.
   1. Aspirer et éliminer les supports actuels. Distribuer 2 ml de PBS sur la culture cellulaire HEK293 pour laver les cellules. Aspirer et éliminer le PBS.
   2. Distribuer 2 mL de trypsine sur la culture cellulaire HEK293. Placer la boîte de Petri dans un incubateur à 37 °C pendant 3 min ou jusqu’à ce que les cellules n’adhèrent plus à la boîte. Remettre la capsule dans l’enceinte de biosécurité et diluer la solution cellulaire en distribuant 8 ml de solution de DMEM dans la plaque.
   3. Mélanger la solution en pipitant doucement de haut en bas plusieurs fois. Aspirer tout le média et le placer dans un tube conique de 15 mL.
4. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 3 min pour les granuler. Aspirez le média (en prenant soin de ne pas aspirer les cellules) et jetez-le. Remettez les cellules en suspension dans 5 mL de solution DMEM, en mélangeant en pipitant doucement de haut en bas.
5. Estimer la concentration actuelle des cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé (répertorié dans le tableau des matériaux). Ensemencer six puits (dans cet exemple) dans une plaque de 24 puits avec 1 x 10⁵ cellules (pour une densité d’ensemencement de 50 000 cellules/cm²).
6. Ajouter la solution DMEM jusqu’à 500 μL (ajouter d’abord la solution DMEM aux puits), puis étiqueter un puits par traitement comme suit : aucun contrôle de couleur, contrôle mKO2, contrôle TagBFP, contrôle NeonGreen, contrôle toutes couleurs et poly-transfection 1. Les puits de contrôle TagBFP, mKO2 et NeonGreen sont des témoins unicolores pour toutes les protéines fluorescentes incluses dans la polytransfection.

2. Effectuer la transfection

1. Préparer des tubes pour chaque agrégat d’ADN. Mettez de côté les tubes microcentrifugeuses de 1,5 mL et étiquetez les tubes comme suit : aucun contrôle de couleur, contrôle mKO2, contrôle TagBFP, contrôle NeonGreen, contrôle toutes couleurs, mélange de polytransfection 1 et mélange de polytransfection 2.
   1. Ajouter 36 μL de milieu sérique réduit au contrôle sans couleur, au contrôle mKO2, au contrôle TagBFP, au contrôle NeonGreen et à tous les tubes de contrôle de couleur. Ajouter 18 μL de milieu sérique réduit à chacun des tubes du mélange de polytransfection 1 et du mélange de polytransfection 2.
      REMARQUE : Les concentrations de plasmides sont supposées être de 150 ng/μL.
   2. Ajouter 600 ng de plasmide de comblement dans le tube de contrôle sans couleur. Ajouter 300 ng de mKO2 et 300 ng de plasmide de comblement dans le tube de contrôle de couleur mKO2. Ajoutez 300 ng de TagBFP et 300 ng de plasmide de remplissage au tube de contrôle de couleur TagBFP.
   3. Ajouter 300 ng de plasmide constitutif NeonGreen et 300 ng de plasmide de remplissage au tube de contrôle de couleur NeonGreen. Ajouter 100 ng de mKO2, TagBFP et NeonGreen constitutif, ainsi que 300 ng de plasmide de remplissage, au tube de contrôle toutes couleurs.
   4. Ajouter 150 ng de mKO2 au mélange de polytransfection 1 tube. Ajouter 75 ng de plasmide rapporteur NeonGreen et 75 ng de plasmide de comblement au mélange de polytransfection 1 tube.
   5. Ajouter 150 ng de TagBFP au mélange de polytransfection 2 tubes. Ajouter 75 ng de plasmide L7ae et 75 ng de plasmide de comblement au mélange de polytransfection 2 tubes.
2. Créer le mélange maître de transfection dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL en combinant 216 μL de milieu sérique réduit avec 9,48 μL de réactif de transfection (voir le tableau 1 pour les rapports de réactifs et l’échelle de la réaction). Bien mélanger en tuytant de haut en bas et de réserver.
3. Ajoutez 1,58 μL de réactif amplificateur à chacun des tubes de contrôle sans couleur, de contrôle de couleur unique et de tous les tubes de contrôle de couleur. Ajouter 79 μL de réactif amplificateur à chacun des tubes de mélange de polytransfection. Mélanger chaque tube individuellement en pipetant vigoureusement.
4. Ajouter le mélange maître de transfection à chaque tube contenant de l’ADN.
   1. Ajoutez 37,58 μL de mélange maître de transfection à chacun des tubes de contrôle sans couleur, de contrôle de couleur unique et de tous les tubes de contrôle de couleur. Mélanger chaque tube individuellement en pipetant vigoureusement.
   2. Ajouter 18,79 μL de mélange maître de transfection à chacun des tubes de mélange de polytransfection. Mélanger chaque tube individuellement en pipetant vigoureusement.
5. Distribuer les mélanges de transfection dans les puits.
   1. Pipeter 65,97 μL de chaque mélange de transfection pour les contrôles sans couleur, couleur unique et toutes les couleurs dans les puits correspondants.
   2. Pipeter 32,98 μL du mélange de polytransfection 1 dans le puits de polytransfection et agiter la plaque rapidement mais doucement en huit serrés le long d’une surface plane pour répartir efficacement les complexes. Ensuite, pipeter 32,98 μL de la poly-transfection mélanger 2 dans le même puits de poly-transfection et agiter la plaque de la même manière.
6. Placer la plaque dans un incubateur à 37 °C, avec 5% de CO₂ et sans agitation, pendant une durée de 48 h.
   REMARQUE: Pour augmenter la viabilité cellulaire, le milieu cellulaire peut être remplacé toutes les 6 heures après la transfection (bien que cela ne soit pas toujours nécessaire, et avec les cellules HEK293 et ses dérivés, il faut faire attention à ne pas détacher les cellules de la plaque lors du changement du média).

Réactif	Quantité			Détartrage
Milieu sérique réduit pour mélange d’ADN	36 μL par tube témoin, 18 μL par tube de polytransfection			0,05 μL Milieu sérique réduit/ng ADN par tube, avec 10-20% de volume supplémentaire pour tenir compte du pipetage
ADN	300-600 ng par tube
P3000	1,58 μL par tube témoin, 0,79 μL par tube de polytransfection			0,0022 μL P3000/ng ADN par tube, avec 10-20% supplémentaires
Milieu sérique réduit pour Lipo master mix	36 μL par tube témoin, 18 μL par tube de polytransfection			0,05 μL de milieu sérique réduit/ng d’ADN total, avec 10 à 20 % de volume supplémentaire pour tenir compte du pipetage
Réactif de transfection et d’amplificateur	1,58 μL par tube témoin, 0,79 μL par tube de polytransfection			0,0022 μL de lipofectamine 3000/ng d’ADN, avec 10-20% d’extra

Tableau 1 : Mise à l’échelle des réactifs pour les transfections. Le tableau indique le rapport correct de réactif à inclure pour la quantité d’ADN incluse dans un seul puits. Cela peut être utilisé pour mettre à l’échelle efficacement les réactions et former des mélanges maîtres. Les quantités de réactifs ont été mises à l’échelle pour inclure un excès de 20%.

3. Préparer les cellules à la cytométrie en flux

1. Préchauffer au moins 4,2 mL de la solution DMEM à 37 °C. Préchauffer au moins 4,2 mL de trypsine et 4,2 mL de PBS à 37 °C. Conserver la solution tampon de tri cellulaire activée par fluorescence (FACS) à 4 °C jusqu’à ce qu’elle soit prête à être utilisée.
2. Resuspendre les cellules dans la solution tampon FACS (PBS supplémenté avec 1% de BSA, 5 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique [EDTA] et 0,1% d’azoture de sodium [_NaN3], pour réduire l’agglutination; voir le tableau des matériaux) comme décrit ci-dessous.
   1. Aspirer et éliminer les milieux actuels dans chaque puits. Distribuez 5 mL de PBS dans chaque puits pour laver les cellules. Aspirer et éliminer le PBS.
   2. Verser 5 mL de trypsine dans chaque puits. Placer la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 3 min, ou jusqu’à ce que les cellules n’adhèrent plus à la boîte. Remettre la plaque dans l’enceinte de biosécurité et diluer les solutions cellulaires en distribuant 5 mL de solution DMEM dans chaque puits.
   3. Pour chaque puits, mélanger la solution en remontant et descendant doucement plusieurs fois. Pour chaque puits, aspirez tous les milieux et placez-les dans un tube conique de 15 mL.
3. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 3 min pour les granuler. Aspirez le média, en prenant soin de ne pas aspirer les cellules et de les jeter. Dans chaque tube, remettre les cellules en suspension dans 5 mL de solution tampon FACS, en mélangeant en pipetant doucement de haut en bas.
4. Faire passer chaque solution de suspension cellulaire à travers une passoire (pour éliminer les touffes) dans des tubes coniques de cytométrie en flux séparés. Gardez ces tubes sur la glace pendant pas plus de 1 h et effectuez la cytométrie en flux dès que possible.

4. Effectuer la cytométrie en flux

REMARQUE: L’utilisation d’un cytomètre en flux nécessite une formation appropriée et une connaissance des tâches nécessaires. Étant donné que les logiciels et l’équipement peuvent varier et que les utilisateurs doivent être formés de manière générale, cette section fait référence à des opérations spécifiques qui sont utiles à effectuer.

1. Tout d’abord, examinez les cellules transfectées avec le contrôle plasmidique de remplissage (pas de contrôle de couleur) pour sélectionner les caractéristiques cellulaires et éviter les anomalies (y compris les agrégats, les débris, etc.). Bien qu’il existe de nombreuses combinaisons de paramètres pour distinguer les cellules, utilisez les trois options générales suivantes comme un bon moyen de visualiser les caractéristiques distinctives.
   1. Comparez la zone de diffusion latérale (échelle logarithmique ou linéaire par préférence/type de cellule) par rapport à la zone de diffusion vers l’avant (échelle linéaire).
   2. Comparez la hauteur de diffusion latérale (échelle logarithmique) par rapport à la largeur de diffusion latérale (échelle linéaire).
   3. Comparez la largeur de diffusion vers l’avant (échelle linéaire) par rapport à la hauteur de diffusion vers l’avant (échelle linéaire).
2. Ensuite, regardez les contrôles à couleur unique. Utilisez le contrôle toutes couleurs pour régler les tensions de l’instrument, de sorte que les signaux de chaque protéine fluorescente soient normalisés à des unités arbitraires équivalentes (u.a.) de fluorescence. Ensuite, exécutez les commandes de couleur unique pour chaque protéine fluorescente, qui sont utilisées pour définir la matrice de compensation, ce qui permet une correction du fond perdu.
   REMARQUE: Idéalement, la plage dynamique complète des valeurs de fluorescence devrait être visible. Une normalisation plus poussée des signaux de protéines fluorescentes peut se faire par conversion en unités normalisées (p. ex., molécules de fluorescéine équivalente [MEFL; voir Beal et ^coll.15]). Pour activer la conversion MEFL pendant l’analyse, exécutez des perles d’étalonnage arc-en-ciel. Un tel étalonnage est également utile pour réduire la variation du signal d’instrument à instrument et de jour en jour¹⁶.
3. Exécutez le tube à échantillon de polytransfection.
   REMARQUE : Dans la mesure du possible, il est recommandé d’exécuter des cellules de 1 000 x 10^ (^ = mélanges), car les polytransfections de dimensions supérieures doivent être subdivisées en plusieurs cellules pendant l’analyse, et chaque cellule a besoin de suffisamment de cellules (idéalement >10) pour faire des comparaisons statistiquement significatives.

5. Effectuer une analyse post-expérience

1. Dans un premier temps, utilisez les données des contrôles (et, le cas échéant, des perles) pour assurer des résultats précis. Utilisez l’un des outils logiciels disponibles pour effectuer le contrôle des cellules sous tension (à l’aide des portes décrites ci-dessus), la compensation et la correction de l’autofluorescence.
   REMARQUE: Nous utilisons généralement du code MATLAB personnalisé (par exemple, https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis ou Cytoflow¹⁷), qui possède à la fois une interface utilisateur graphique et une bibliothèque python adaptée à la phase de prétraitement et à l’analyse de polytransfection.

Méthode	Complexe	Marqueur fluorescent ng	ng L7ae (fraction)	ng Reporter (fraction)	ng Filler DNA (fraction)	Total (ng)
Poly-transfection 1						600
→	1	150	75 (½)		75 (½)	300
→	2	150		75 (½)	75 (½)	300
Poly-transfection 2						600
→	1	150	25 (1/6)		125 (5/6)	300
→	2	150		125 (5/6)	25(1/6)	300

Tableau 2 : Quantités d’ADN pour la polytransfection démontrées dans le protocole, et un exemple d’expérience de suivi avec des rapports plasmidiques accordés. La moitié supérieure du tableau montre la composition des plasmides utilisés dans une expérience simple de polytransfection. La moitié inférieure montre la composition d’une expérience mise à jour qui ajuste les rapports plasmidiques pour mieux sous-échantillonner un espace de concentration hypothétique, où le modulateur d’expression génique est à un rapport plus optimal de 1:5 par rapport à son rapporteur, ce qui donne plus de cellules transfectées à échantillonner autour de ce rapport.

Résultats

Dans la figure 1, nous comparons la co-transfection à la poly-transfection. Dans une co-transfection, tous les plasmides sont livrés dans le même mélange de transfection, ce qui entraîne une forte corrélation entre la quantité de chaque plasmide qu’une seule cellule reçoit (Figure 1A). Bien que le nombre total de plasmides délivrés à chaque cellule varie considérablement, la fluorescence des deux protéines rapporteures dans les cellules individuel...

Discussion

Les méthodes de prototypage rapide telles que la conception assistée par ordinateur (CAO), la planche à pain et l’impression 3D ont révolutionné les disciplines mécaniques, électriques et de génie civil. La capacité de rechercher rapidement de nombreuses solutions possibles à un défi donné accélère considérablement les progrès dans un domaine. Nous pensons que la polytransfection est une technologie analogue pour le génie biologique, permettant le prototypage rapide de circuits génétiques. De plus, d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
15mL Corning Falcon conical tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
24-well petri dish	Any company of choice		(Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin	NEB	B9000S
Centrifuge	Any company of choice		Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
Cytoflow	Non-commercial software package		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	Use the correct media for your cell type
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich	F4135
HEK cells	ATCC	CRL-1573	Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells	ATCC	CRL-12401	Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer	ThermoFisher Scientific	L3000001	Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer	BD Biosciences	N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Any company of choice
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	31985070	reduced serum medium
Phosphate buffered saline	ThermoFisher Scientific	70011044
Rainbow calibration beads	Spherotech	URCP-100-2H
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Trypsin	VWR	25-053-CI