ポリトランスフェクションによる細胞状態同定回路の急速開発

要約

複雑な遺伝子回路は、設計、テスト、最適化に時間がかかります。このプロセスを容易にするために、哺乳類細胞は、単一のウェル内の回路コンポーネントの複数の化学量論の試験を可能にする方法でトランスフェクトされます。このプロトコルは、実験計画、トランスフェクション、およびデータ解析の手順を概説しています。

要約

哺乳類の遺伝子回路は、さまざまな病状を感知して治療する可能性を実証していますが、回路コンポーネントのレベルの最適化は依然として困難で労働集約的です。このプロセスを加速するために、私たちの研究室は、従来の哺乳類トランスフェクションのハイスループット拡張であるポリトランスフェクションを開発しました。ポリトランスフェクションでは、トランスフェクションされた集団の各細胞が本質的に異なる実験を行い、異なるDNAコピー数で回路の挙動をテストし、ユーザーがシングルポット反応で多数の化学量論を分析できるようにします。これまでに、細胞の単一ウェルにおける3成分回路の比率を最適化するポリトランスフェクションが実証されています。原則として、同じ方法をさらに大きな回路の開発に使用できます。ポリトランスフェクションの結果は、一過性回路のコトランスフェクションに対するDNAの最適な比率を見つけたり、安定した細胞株を生成するための回路コンポーネントの発現レベルを選択したりするために簡単に適用できます。

ここでは、ポリトランスフェクションを使用して3成分回路を最適化する方法を示します。このプロトコルは、実験デザインの原則から始まり、ポリトランスフェクションが従来のコトランスフェクション法に基づいてどのように構築されるかを説明しています。次に、細胞のポリトランスフェクションを行い、数日後にフローサイトメトリーを行います。最後に、特定の成分比を持つ細胞のサブセットに対応するシングルセルフローサイトメトリーデータのスライスを調べることによって、データを分析します。ラボでは、ポリトランスフェクションを使用して、細胞分類器、フィードバックおよびフィードフォワードコントローラー、双安定モチーフなどを最適化しています。このシンプルでありながら強力な方法は、哺乳類細胞の複雑な遺伝子回路の設計サイクルをスピードアップします。

概要

哺乳類合成生物学の分野は、培養細胞株における単純な感覚応答部分の開発から、診断および治療における現実世界の課題に対処するための遺伝子の複雑なネットワークの最適化まで、急速に進歩しています¹。これらの高度な回路は、マイクロRNAプロファイルからサイトカイン、低分子薬物までの生物学的入力を検出し、トランジスタ、バンドパスフィルタ、トグルスイッチ、発振器などのロジック処理回路を実装することができます。彼らはまた、癌、関節炎、糖尿病、その他多くの疾患の動物モデルで有望な結果を示しています1,2,3,4,5。ただし、回路の複雑さが増すにつれて、各コンポーネントのレベルを最適化することはますます困難になります。

特に有用なタイプの遺伝子回路の1つは、細胞状態を感知して応答するようにプログラムすることができる細胞分類器である。特定の細胞状態でのタンパク質またはRNA出力の選択的産生は、細胞およびオルガノイドの分化をガイドおよびプログラムし、疾患細胞および/または望ましくない細胞型を特定および破壊し、治療細胞の機能を調節するための強力なツールです1,2,3,4,5 .しかし、複数の細胞RNAおよび/またはタンパク質種から細胞状態を正確に分類できる回路を哺乳類細胞で作成することは非常に困難でした。

細胞分類回路を開発する最も時間のかかるステップの1つは、回路内のセンサーやプロセシングファクターなどの個々の構成遺伝子の相対的な発現レベルを最適化することです。回路の最適化をスピードアップし、より洗練された回路の構築を可能にするために、最近の研究では、セル分類器回路とそのコンポーネントの数学的モデリングを使用して、最適な構成とトポロジーを予測しています^6,7。これはこれまでのところ強力な結果を示していますが、数学的解析は、回路内の構成要素遺伝子の入出力挙動を体系的に特徴付ける必要があるため、時間がかかります。さらに、複雑な遺伝子回路では無数の文脈依存の問題が出現する可能性があり、フル回路の動作が個々の部分の特性評価に基づく予測に反する原因となります^8,9。

細胞状態分類器などの複雑な哺乳類回路をより迅速に開発およびテストするために、私たちの研究室は、プラスミドコトランスフェクションプロトコルの進化形であるポリトランスフェクション¹⁰と呼ばれる技術を開発しました。コトランスフェクションでは、複数のプラスミドDNA種を正に帯電した脂質または高分子試薬と複合体化し、相関的に細胞に送達します(図1A)。ポリトランスフェクションでは、各トランスフェクション複合体からのDNAが非相関的に細胞に送達されるように、プラスミドを試薬と別々に複合体化します(図1B)。この方法を使用すると、トランスフェクトされた集団内の細胞は、異なる回路コンポーネントを運ぶ2つ以上のDNAペイロードの比率の多数の組み合わせにさらされます。

各細胞に送達される回路成分の比率を測定するために、ポリトランスフェクション内の各トランスフェクション複合体には、複合体の細胞取り込みの代理として機能する構成的に発現された蛍光レポーターが含まれています。哺乳類細胞内で活性な要素を含まないフィラーDNAは、単一のトランスフェクション複合体で細胞に送達される蛍光レポーターと回路成分の相対量を調整するために使用され、議論でより詳細に議論されます。Weissラボで使用されるフィラーDNAの例は、ターミネーター配列を含むプラスミドですが、プロモーター、コード配列などは含まれていません。次に、回路成分の比率が異なる細胞を比較して、遺伝子回路機能の最適な比率を見つけることができます。これにより、回路コンポーネントを遺伝子統合用の単一のベクター(レンチウイルス、トランスポゾン、ランディングパッドなど)に組み合わせるときに最適な遺伝子発現レベルを達成するために、プロモーターやその他の回路要素を選択するための有用な予測が得られます。したがって、ポリトランスフェクションは、直感に基づいて、または時間のかかる試行錯誤プロセス を介して 回路コンポーネント間の比率を選択する代わりに、シングルポット反応で遺伝子部分間の幅広い化学量論を評価します。

私たちの研究室では、ポリトランスフェクションにより、細胞分類器、フィードバックおよびフィードフォワードコントローラー、双安定モチーフなど、多くの遺伝子回路の最適化が可能になりました。このシンプルでありながら強力な方法は、哺乳類細胞の複雑な遺伝子回路の設計サイクルを大幅にスピードアップします。それ以来、ポリトランスフェクションは、いくつかの遺伝子回路の特性評価に使用され、高解像度で多次元入出力伝達関数を明らかにし¹⁰、細胞状態分類¹¹の代替回路トポロジーを最適化し、さまざまな公開された^12、13 および進行中のプロジェクトを加速しています。

ここでは、ポリトランスフェクションを使用して遺伝子回路を迅速に最適化するためのワークフローについて説明し、説明します(図2)。このプロトコルは、高品質のポリトランスフェクションデータを生成し、ポリトランスフェクションプロトコルおよびデータ解析におけるいくつかの一般的なエラーを回避する方法を示しています(図3)。次に、ポリトランスフェクションを使用して単純な回路コンポーネントの特性評価を行い、その過程でポリトランスフェクションの結果をコトランスフェクションに対してベンチマークする方法を示します(図4)。最後に、ポリトランスフェクションの結果は、がん分類回路の最適化を示しています(図5)。

プロトコル

メモ: 表 1 および 表 2 は、このプロトコルの重要なリファレンスです。表 1 は反応の試薬スケーリングを示し、 表2 はプロトコルに記載されているポリトランスフェクションの例(上半分)と可能なフォローアップ実験(下半分)のDNA比算術を示しています。

1. トランスフェクションのための細胞の準備

1. プロトコルを開始する前に、ヒト胚性腎臓(HEK293)細胞の培養が60%〜80%コンフルエントであることを確認してください。これを行うには、2日前に100 mm x 15 mmの組織培養ペトリ皿に1 x 10⁶ 細胞を播種し、5%_CO2で37°Cでインキュベートします。
   注:私たちのプロトコルはHEK293細胞に焦点を当てていますが、他の細胞タイプで代用することもできます。
2. 以下に説明するように、トランスフェクション用の培地と細胞を準備します。
   1. 10%ウシ胎児血清(FBS)および1%非必須アミノ酸(NEAA; 材料の表を参照)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)の溶液の少なくとも20 mLを37°Cに予熱します。 少なくとも2.4 mLのトリプシンと2.4 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)も37°Cに予熱します。血清培地を~16°Cに予温します。
      注意: すべての組織培養作業は、バイオセーフティキャビネットで注意して実行する必要があります。
3. 以下に説明するように、細胞をDMEM溶液に再懸濁します。
   1. 現在のメディアを吸引して廃棄します。HEK293細胞培養液に2 mLのPBSを分注し、細胞を洗浄します。PBSを吸引して廃棄します。
   2. 2 mLのトリプシンをHEK293細胞培養液に分注します。ペトリ皿を37°Cのインキュベーターに3分間、または細胞が皿に接着しなくなるまで入れます。ディッシュをバイオセーフティキャビネットに戻し、8 mLのDMEM溶液をプレートに分注して細胞溶液を希釈します。
   3. 数回穏やかに上下にピペッティングして溶液を混合します。すべての培地を吸引し、15 mLのコニカルチューブに入れます。
4. 細胞を300 x g で3分間遠心分離し、ペレット化します。培地を吸引し(細胞を吸引しないように注意して)、廃棄します。細胞を5 mLのDMEM溶液に再懸濁し、穏やかに上下にピペッティングして混合します。
5. 自動セルカウンター( 材料表に記載)を使用して現在の細胞濃度を推定します。6 ウェル (この例では) を 1 x 10⁵ セル (播種密度 50,000 セル/cm² の場合) の 24 ウェルプレートにシードします。
6. DMEM溶液を最大500 μLまで添加し(最初にDMEM溶液をウェルに加えます)、次に処理ごとに1つのウェルにカラーコントロールなし、mKO2コントロール、TagBFPコントロール、NeonGreenコントロール、オールカラーコントロール、ポリトランスフェクション1のラベルを付けます。TagBFP、mKO2、およびNeonGreenコントロールウェルは、ポリトランスフェクションに含まれるすべての蛍光タンパク質の単色コントロールです。

2. トランスフェクションの実施

1. 各DNA凝集体用のチューブを準備します。1.5 mLの微量遠心チューブを取っておき、チューブにカラーコントロールなし、mKO2コントロール、TagBFPコントロール、NeonGreenコントロール、オールカラーコントロール、ポリトランスフェクションミックス1、ポリトランスフェクションミックス2のラベルを付けます。
   1. 36 μLの還元血清培地を、カラーコントロールなし、mKO2コントロール、TagBFPコントロール、ネオングリーンコントロール、およびすべてのカラーコントロールチューブに追加します。18 μLの還元血清培地をポリトランスフェクションミックス1およびポリトランスフェクションミックス2のチューブのそれぞれに加えます。
      注:プラスミド濃度は150 ng/μLを想定しています。
   2. 600 ngのフィラープラスミドをカラーコントロールチューブなしに追加します。300 ngのmKO2と300 ngのフィラープラスミドをmKO2カラーコントロールチューブに追加します。300 ngのTagBFPと300 ngのフィラープラスミドをTagBFPカラーコントロールチューブに追加します。
   3. 300 ngの構成的ネオングリーンプラスミドと300 ngのフィラープラスミドをネオングリーンカラーコントロールチューブに追加します。mKO2、TagBFP、構成ネオングリーンをそれぞれ100 ng、およびフィラープラスミド300 ngをオールカラーコントロールチューブに追加します。
   4. 150 ngのmKO2をポリトランスフェクションミックス1チューブに加えます。75 ngのレポーターNeonGreenプラスミドと75 ngのフィラープラスミドをポリトランスフェクションミックス1チューブに加えます。
   5. 150 ngのTagBFPをポリトランスフェクションミックス2チューブに加えます。75 ngのL7aeプラスミドと75 ngのフィラープラスミドをポリトランスフェクションミックス2チューブに加えます。
2. 216 μLの還元血清培地と9.48 μLのトランスフェクション試薬を組み合わせて、1.5 mLの微量遠心チューブでトランスフェクションマスターミックスを作成します(試薬比と反応スケーリングについては 表1 を参照)。上下にピペッティングしてよく混ぜ、取っておきます。
3. 1.58 μLのエンハンサー試薬を、カラーコントロールなし、シングルカラーコントロール、およびすべてのカラーコントロールチューブのそれぞれに追加します。79 μLのエンハンサー試薬を各ポリトランスフェクションミックスチューブに加えます。激しくピペッティングして各チューブを個別に混合します。
4. DNAを含むトランスフェクションマスターミックスを各チューブに追加します。
   1. 37.58 μLのトランスフェクションマスターミックスを、カラーコントロールなし、シングルカラーコントロール、およびすべてのカラーコントロールチューブのそれぞれに追加します。激しくピペッティングして各チューブを個別に混合します。
   2. 18.79 μLのトランスフェクションマスターミックスを各ポリトランスフェクションミックスチューブに加えます。激しくピペッティングして各チューブを個別に混合します。
5. トランスフェクションミックスをウェルに分注します。
   1. 各トランスフェクション 65.97 μL をピペットで、無色、単色、およびすべてのカラーコントロール用に、対応するウェルに入れます。
   2. 32.98 μLのポリトランスフェクションミックス1をポリトランスフェクションウェルにピペットで入れ、プレートを平坦な表面に沿って8の字型パターンで素早く穏やかに旋回させ、複合体を効果的に分配します。次に、32.98 μLのポリトランスフェクションミックス2を同じポリトランスフェクションウェルにピペットで入れ、同じ方法でプレートを旋回させます。
6. プレートを37°Cのインキュベーターに入れ、5%_CO2 と共に振とうせずに48時間放置する。
   注:細胞の生存率を高めるために、トランスフェクション後6時間ごとに細胞培地を交換することができます(ただし、これは必ずしも必要ではなく、HEK293細胞とその誘導体では、培地を交換するときに細胞をプレートから剥離しないように注意する必要があります)。

試薬	量			スケーリング
DNA混合用の還元血清培地	コントロールチューブあたり36 μL、ポリトランスフェクションチューブあたり18 μL			チューブあたり0.05 μLの血清培地/ ng DNAを減少させ、ピペッティングを考慮して10〜20%余分な容量を使用
デオキシリボ核酸	チューブあたり300-600 ng
P3000型	コントロールチューブあたり1.58 μL、ポリトランスフェクションチューブあたり0.79 μL			チューブあたり0.0022 μL P3000/ng DNA、10-20%追加
リポマスターミックス用の還元血清培地	コントロールチューブあたり36 μL、ポリトランスフェクションチューブあたり18 μL			0.05 μLの還元血清培地/ ng総DNA、ピペッティングを考慮して10〜20%の追加容量
トランスフェクションおよびエンハンサー試薬	コントロールチューブあたり1.58 μL、ポリトランスフェクションチューブあたり0.79 μL			0.0022 μLリポフェクタミン3000/ng DNA、10-20%追加

表1:トランスフェクションの試薬スケーリング。 この表は、単一のウェルに含まれるDNA量に含める試薬の正しい比率を示しています。これは、反応を効果的にスケーリングし、マスターミックスを形成するために使用できます。試薬の量は、20%の過剰を含むようにスケーリングされています。

3. フローサイトメトリー用の細胞調製

1. 少なくとも4.2 mLのDMEM溶液を37°Cに予熱します。 少なくとも4.2 mLのトリプシンと4.2 mLのPBSを37°Cに予熱します。 蛍光活性化セルソーティング(FACS)緩衝液は、使用できるようになるまで4°Cに保ちます。
2. 細胞をFACS緩衝液(1%BSA、5 mMエチレンジアミン四酢酸[EDTA]、および0.1%アジ化ナトリウム[_NaN3]を添加したPBS)に再懸濁して、凝集を減らします; 材料の表を参照)。
   1. 各ウェルに現在の培地を吸引して廃棄します。5 mLのPBSを各ウェルに分注し、細胞を洗浄します。PBSを吸引して廃棄します。
   2. 5 mLのトリプシンを各ウェルに分注します。プレートを37°Cのインキュベーターに3分間、または細胞が皿に接着しなくなるまで置きます。プレートをバイオセーフティキャビネットに戻し、5 mLのDMEM溶液を各ウェルに分注して細胞溶液を希釈します。
   3. 各ウェルについて、数回穏やかに上下にピペッティングして溶液を混合します。各ウェルについて、すべての培地を吸引し、15 mLのコニカルチューブに入れます。
3. 細胞を300 x g で3分間遠心分離し、ペレット化します。細胞を吸引して廃棄しないように注意しながら、培地を吸引します。各チューブで、細胞を5mLのFACS緩衝溶液に再懸濁し、上下に穏やかにピペッティングして混合する。
4. 各細胞懸濁液をストレーナーに通し(凝集塊を除去するため)、別々のフローサイトメトリーコニカルチューブに入れます。これらのチューブを氷上に1時間以内保持し、できるだけ早くフローサイトメトリーを実行してください。

4. フローサイトメトリーの実施

注:フローサイトメーターの操作には、適切なトレーニングと必要なタスクの知識が必要です。ソフトウェアと機器は異なる場合があり、ユーザーは一般的にトレーニングを受ける必要があるため、このセクションでは、実行に役立つ特定の操作について説明します。

1. まず、フィラープラスミドコントロール(カラーコントロールなし)を導入した細胞を調べて、細胞特性を選択し、異常(凝集体、破片などを含む)を回避します。セルを区別するためのパラメーターの組み合わせは多数ありますが、特徴を区別するための良い方法として、次の 3 つの一般的なオプションを使用します。
   1. 側方散乱領域 (好み/セルの種類ごとの対数または線形スケール) と前方散乱領域 (線形スケール) を確認します。
   2. 側面散乱高さ (対数スケール) と側面散乱幅 (線形スケール) を確認します。
   3. 前方散乱幅 (線形スケール) と前方散乱高さ (線形スケール) を確認します。
2. 次に、単色コントロールを見てください。オールカラーコントロールを使用して、各蛍光タンパク質からのシグナルが同等の任意の蛍光単位(a.u.)に正規化されるように、機器の電圧を調整します。次に、補正マトリックスの設定に使用される各蛍光タンパク質の単一カラーコントロールを実行し、ブリードスルー補正を可能にします。
   注:理想的には、蛍光値の全ダイナミックレンジが見える必要があります。蛍光タンパク質シグナルのさらなる正規化は、標準化された単位(例えば、等価フルオレセイン[MEFLs]の分子;Beal et ^al.15を参照)への変換を介して行うことができる。分析中にMEFL変換を有効にするには、レインボーキャリブレーションビーズを実行します。このような較正は、機器間および日々の信号変動を低減するためにも有用である¹⁶。
3. ポリトランスフェクションサンプルチューブを実行します。
   注:分析中に高次元のポリトランスフェクションをより多くのビンに細分化する必要があり、各ビンには統計的に有意な比較を行うのに十分な細胞(理想的には>10)が必要であるため、可能であれば、1,000 x 10^(^=ミックス)の細胞を実行することをお勧めします。

5. 実験後解析の実行

1. 最初に、コントロール(および該当する場合はビーズ)からのデータを使用して、正確な結果を確保します。利用可能なソフトウェアツールの1つを使用して、生細胞ゲーティング(上記のゲートを使用)、補償、および自己蛍光補正を実行します。
   注:通常、グラフィカルユーザーインターフェイスと、前処理段階およびポリトランスフェクション分析に適したPythonライブラリの両方を備えたカスタムMATLABコード(https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis またはCytoflow¹⁷など)を使用します。

方式	コンプレックス	ng蛍光マーカー	ng L7ae (分数)	ngレポーター(分数)	ngフィラーDNA(フラクション)	合計 (ng)
ポリトランスフェクション1						600
→	1	150	75 (½)		75 (½)	300
→	2	150		75 (½)	75 (½)	300
ポリトランスフェクション2						600
→	1	150	25 (1/6)		125 (5/6)	300
→	2	150		125 (5/6)	25(1/6)	300

表2:プロトコルで実証されたポリトランスフェクションのDNA量、および調整されたプラスミド比を使用したフォローアップ実験の例。 表の上半分は、単純なポリトランスフェクション実験で使用したプラスミドの組成を示しています。下半分は、プラスミド比を調整して仮想の濃度空間をより適切にサブサンプリングする最新の実験の構成を示しており、遺伝子発現モジュレーターはレポーターに対してより最適な1:5の比率にあり、この比率付近でより多くのトランスフェクト細胞をサンプリングします。

結果

図1では、コトランスフェクションとポリトランスフェクションを比較しています。コトランスフェクションでは、すべてのプラスミドが同じトランスフェクションミックスで送達されるため、単一細胞が受け取る各プラスミドの量に高い相関が生じます(図1A)。各細胞に送達されるプラスミドの総数は大きく異なりますが、集団全体の個々の細胞?...

ディスカッション

コンピューター支援設計(CAD)、ブレッドボード、3D印刷などのラピッドプロトタイピング手法は、機械、電気、土木工学の分野に革命をもたらしました。特定の課題に対して考えられる多くのソリューションをすばやく検索する機能は、この分野の進歩を大幅に加速します。ポリトランスフェクションは生物工学の類似技術であり、遺伝子回路のラピッドプロトタイピングを可能にすると考え...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15mL Corning Falcon conical tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
24-well petri dish	Any company of choice		(Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin	NEB	B9000S
Centrifuge	Any company of choice		Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
Cytoflow	Non-commercial software package		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	Use the correct media for your cell type
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich	F4135
HEK cells	ATCC	CRL-1573	Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells	ATCC	CRL-12401	Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer	ThermoFisher Scientific	L3000001	Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer	BD Biosciences	N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Any company of choice
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	31985070	reduced serum medium
Phosphate buffered saline	ThermoFisher Scientific	70011044
Rainbow calibration beads	Spherotech	URCP-100-2H
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Trypsin	VWR	25-053-CI