Poly-transfection을 이용한 세포 상태 식별 회로의 신속한 개발

요약

복잡한 유전 회로는 설계, 테스트 및 최적화에 시간이 많이 걸립니다. 이 과정을 촉진하기 위해 포유류 세포는 단일 웰에서 회로 구성 요소의 여러 화학량론을 테스트할 수 있는 방식으로 형질감염됩니다. 이 프로토콜은 실험 계획, transfection 및 데이터 분석을 위한 단계를 간략하게 설명합니다.

초록

포유류의 유전 회로는 광범위한 질병 상태를 감지하고 치료할 수 있는 잠재력을 입증했지만 회로 구성 요소 수준의 최적화는 여전히 어렵고 노동 집약적입니다. 이 과정을 가속화하기 위해 우리 연구실은 전통적인 포유류 형질감염의 고처리량 확장인 폴리 형질감염을 개발했습니다. 폴리형질감염에서 형질주입된 집단의 각 세포는 본질적으로 서로 다른 실험을 수행하여 서로 다른 DNA 복제 수에서 회로의 거동을 테스트하고 사용자가 단일 포트 반응에서 많은 수의 화학량론을 분석할 수 있도록 합니다. 지금까지, 세포의 단일 웰에서 3성분 회로의 비율을 최적화하는 폴리-형질감염이 입증되었다; 원칙적으로 더 큰 회로를 개발하는 데 동일한 방법을 사용할 수 있습니다. 폴리형질주입 결과는 일시적인 회로를 위한 동시 형질감염에 대한 DNA의 최적 비율을 찾거나 안정적인 세포주 생성을 위한 회로 성분에 대한 발현 수준을 선택하기 위해 쉽게 적용할 수 있습니다.

여기서는 3성분 회로를 최적화하기 위해 폴리 트랜스펙션을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 실험 설계 원칙으로 시작하여 폴리 트랜스펙션이 전통적인 공동 트랜스펙션 방법을 기반으로 하는 방법을 설명합니다. 다음에, 세포의 폴리형질감염을 수행하고, 며칠 후에 유세포 분석을 수행한다. 마지막으로, 데이터는 특정 성분 비율을 가진 세포의 하위 집합에 해당하는 단일 세포 유세포 분석 데이터의 슬라이스를 검사하여 분석됩니다. 실험실에서 폴리-트랜스펙션은 세포 분류자, 피드백 및 피드포워드 컨트롤러, 쌍안정 모티프 등을 최적화하는 데 사용되었습니다. 이 간단하지만 강력한 방법은 포유류 세포의 복잡한 유전 회로에 대한 설계 주기를 단축합니다.

서문

포유류 합성 생물학 분야는 배양된 세포주에서 간단한 감지 및 반응 부분을 개발하는 것부터 진단 및 치료의 실제 문제를 해결하기 위한 복잡한 유전자 네트워크의 최적화에 이르기까지 빠르게 발전했습니다¹. 이러한 정교한 회로는 microRNA 프로파일에서 사이토카인, 저분자 약물에 이르기까지 생물학적 입력을 감지하고 트랜지스터, 대역 통과 필터, 토글 스위치 및 발진기를 포함한 논리 처리 회로를 구현할 수 있습니다. 그들은 또한 암, 관절염, 당뇨병 등과 같은 질병의 동물 모델에서 유망한 결과를 보여주었습니다 1,2,3,4,5. 그러나 회로의 복잡성이 증가함에 따라 각 구성 요소의 레벨을 최적화하는 것이 점점 더 어려워지고 있습니다.

유전 회로의 특히 유용한 유형 중 하나는 세포 상태를 감지하고 반응하도록 프로그래밍할 수 있는 세포 분류기입니다. 특정 세포 상태에서 단백질 또는 RNA 산출물의 선택적 생산은 세포와 오가노이드의 분화를 유도 및 프로그래밍하고, 병든 세포 및/또는 바람직하지 않은 세포 유형을 식별 및 파괴하고, 치료 세포의 기능을 조절하는 강력한 도구입니다 1,2,3,4,5 . 그러나 여러 세포 RNA 및/또는 단백질 종에서 세포 상태를 정확하게 분류할 수 있는 포유류 세포에서 회로를 만드는 것은 매우 어려운 일이었습니다.

세포 분류 회로를 개발하는 데 가장 시간이 많이 소요되는 단계 중 하나는 회로 내에서 센서 및 처리 인자와 같은 개별 구성 요소 유전자의 상대적 발현 수준을 최적화하는 것입니다. 회로 최적화를 가속화하고 보다 정교한 회로의 구축을 허용하기 위해, 최근 연구에서는 최적의 조성 및 토폴로지를 예측하기 위해 셀 분류기 회로 및 그 구성 요소의 수학적 모델링을 사용했습니다(^6,7). 이것은 지금까지 강력한 결과를 보여주었지만 수학적 분석은 회로에서 구성 요소 유전자의 입출력 거동을 체계적으로 특성화해야 하는 필요성으로 인해 시간이 많이 걸리기 때문에 제한적입니다. 또한, 복잡한 유전 회로에서 무수히 많은 문맥 의존적 문제가 나타날 수 있으며, 이로 인해 전체 회로의 동작이 개별 부분 특성화에 기초한 예측을 무시하게 됩니다(^8,9).

세포 상태 분류기와 같은 복잡한 포유류 회로를 보다 신속하게 개발하고 테스트하기 위해 우리 연구실은 플라스미드 공동 형질주입 프로토콜의 진화인 폴리 형질감염¹⁰이라는 기술을 개발했습니다. 동시 형질감염에서 여러 플라스미드 DNA 종은 양전하를 띤 지질 또는 고분자 시약과 함께 복합체화된 다음 상관관계가 있는 방식으로 세포에 전달됩니다(그림 1A). 폴리형질감염에서, 플라스미드는 시약과 개별적으로 복합체화되어, 각각의 형질주입 복합체로부터의 DNA가 비상관된 방식으로 세포에 전달된다 (도 1B). 이 방법을 사용하여, 형질주입된 집단 내의 세포는 상이한 회로 성분을 운반하는 2개 이상의 DNA 페이로드 비율의 수많은 조합에 노출된다.

각각의 세포에 전달되는 회로 성분의 비율을 측정하기 위해, 폴리형질주입 내의 각각의 형질주입 복합체는 복합체의 세포 흡수에 대한 프록시로서 기능하는 구성적으로 발현된 형광 리포터를 함유한다. 포유동물 세포 내에서 활성인 어떠한 요소도 함유하지 않는 필러 DNA는 단일 형질감염 복합체에서 세포에 전달되는 형광 리포터 및 회로 성분의 상대적인 양을 조정하기 위해 사용되며, 논의에서 더 상세히 논의된다. Weiss 연구실에서 사용되는 필러 DNA의 예로는 터미네이터 서열을 포함하지만 프로모터, 코딩 서열 등을 포함하지 않는 플라스미드가 있습니다. 그런 다음 회로 구성 요소의 비율이 다른 세포를 비교하여 유전자 회로 기능에 대한 최적의 비율을 찾을 수 있습니다. 이는 차례로 유전자 통합을 위해 회로 구성 요소를 단일 벡터(예: 렌티바이러스, 트랜스포존 또는 랜딩 패드)로 결합할 때 최적의 유전자 발현 수준을 달성하기 위해 프로모터 및 기타 회로 요소를 선택하는 데 유용한 예측을 제공합니다. 따라서 직관에 따라 또는 시간이 많이 소요되는 시행착오 과정을 통해 회로 구성 요소 간의 비율을 선택하는 대신 poly-transfection은 단일 포트 반응에서 유전 부분 간의 광범위한 화학량론을 평가합니다.

우리 연구실에서 폴리 형질 감염은 세포 분류자, 피드백 및 피드 포워드 컨트롤러, 쌍안정 모티프를 포함한 많은 유전 회로의 최적화를 가능하게했습니다. 이 간단하지만 강력한 방법은 포유류 세포의 복잡한 유전 회로에 대한 설계 주기를 크게 단축합니다. 폴리-형질감염(Poly-transfection)은 이후 여러 유전 회로를 특성화하여 고분해능(high resolution)에서 다차원 입출력 전달 함수(input-output transfer function)를 밝히고(¹⁰), 세포 상태 분류(cell state classification)11를 위한 대체 회로 토폴로지(alternate circuit topology)를 최적화하며, 다양한 발표된^12,13 및 진행 중인 프로젝트를 가속화하는 데 사용되었다.

여기서는 유전자 회로를 신속하게 최적화하기 위해 폴리 트랜스펙션을 사용하는 워크플로우를 설명하고 묘사합니다(그림 2). 이 프로토콜은 고품질 poly-transfection 데이터를 생성하고 poly-transfection 프로토콜 및 데이터 분석에서 몇 가지 일반적인 오류를 방지하는 방법을 보여줍니다(그림 3). 그런 다음 poly-transfection을 사용하여 간단한 회로 구성 요소를 특성화하고 그 과정에서 co-transfection에 대한 poly-transfection 결과를 벤치마킹하는 방법을 보여줍니다(그림 4). 마지막으로, 폴리형질감염의 결과는 암 분류자 회로의 최적화를 보여준다(도 5).

프로토콜

참고: 표 1 과 표 2 는 이 프로토콜에 대한 중요한 참조 역할을 합니다. 표 1 은 반응에 대한 시약 스케일링을 보여주고, 표 2 는 프로토콜에 기술된 폴리형질감염의 예(상반부) 및 가능한 후속 실험(하반부)에 대한 DNA 비율 산술을 나타낸다.

1. 형질주입을 위한 세포 준비

1. 프로토콜을 시작하기 전에 인간 배아 신장(HEK293) 세포의 배양이 60%-80% 융합되는지 확인합니다. 이렇게 2일 전에 100 mm x 15 mm 조직 배양 페트리 디쉬에⁶ x 10 세포를 시딩하고, 5%_CO2와 함께 37°C에서 배양한다.
   참고: 당사의 프로토콜은 HEK293 세포에 중점을 두고 있지만 다른 세포 유형으로 대체될 수 있습니다.
2. 형질주입을 위한 배지 및 세포를 하기에 기재된 바와 같이 준비한다.
   1. 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 비필수 아미노산(NEAA; 재료 표 참조)을 갖는 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)의 용액을 최소 20 mL 37°C로 예열한다. 적어도 2.4 mL의 트립신 및 2.4 mL의 인산염 완충 식염수 (PBS)를 37°C로 예열한다. 예열은 혈청 배지를 ~16°C로 감소시켰습니다.
      알림: 모든 조직 배양 작업은 생물 안전 캐비닛에서 주의해서 수행해야 합니다.
3. 아래에 설명된 대로 DMEM 용액에서 세포를 재현탁합니다.
   1. 현재 미디어를 흡인하고 폐기하십시오. HEK293 세포 배양액에 PBS 2mL를 분주하여 세포를 세척합니다. PBS를 흡인하고 폐기하십시오.
   2. HEK293 세포 배양액에 트립신 2mL를 분주합니다. 페트리 접시를 37°C의 인큐베이터에 3분 동안 또는 세포가 더 이상 접시에 부착되지 않을 때까지 놓습니다. 접시를 생물 안전 캐비닛으로 되돌리고 8mL의 DMEM 용액을 플레이트에 분배하여 세포 용액을 희석합니다.
   3. 부드럽게 위아래로 여러 번 피펫팅하여 용액을 혼합합니다. 모든 배지를 흡인하고 15mL 원뿔형 튜브에 넣습니다.
4. 세포를 300 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다. 배지를 흡인하고(세포를 흡인하지 않도록 주의) 폐기합니다. 5mL의 DMEM 용액에 세포를 재현탁하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.
5. 자동화된 세포 계수기( 재료 표에 나열됨)를 사용하여 현재 세포 농도를 추정합니다. 1 x 10⁵ 세포(50,000 cells/^cm2의 파종 밀도의 경우)가 있는 24웰 플레이트에 6개의 웰(이 예에서)을 시드합니다.
6. DMEM 용액을 최대 500μL까지 추가하고(먼저 웰에 DMEM 용액 추가) 처리당 하나의 웰에 색상 제어 없음, mKO2 제어, TagBFP 제어, NeonGreen 제어, 모든 색상 제어 및 폴리-형질감염 1로 라벨을 붙입니다. TagBFP, mKO2 및 NeonGreen 대조군 웰은 폴리 트랜스펙션에 포함된 모든 형광 단백질에 대한 단색 대조군입니다.

2. 형질주입 수행

1. 각 DNA 응집체에 대한 튜브를 준비하십시오. 1.5mL 미세 원심분리기 튜브를 따로 보관하고 튜브에 색상 제어 없음, mKO2 제어, TagBFP 제어, NeonGreen 제어, 모든 색상 제어, 폴리 트랜스펙션 믹스 1 및 폴리 트랜스펙션 믹스 2로 라벨을 붙입니다.
   1. 36μL의 환원된 혈청 배지를 무색 대조군, mKO2 대조군, TagBFP 대조군, NeonGreen 대조군 및 모든 색상 대조군 튜브에 추가합니다. 18 μL의 환원된 혈청 배지를 각각의 폴리형질주입 믹스 1 및 폴리형질주입 믹스 2 튜브에 첨가한다.
      참고: 플라스미드 농도는 150ng/μL로 가정합니다.
   2. 600ng의 필러 플라스미드를 무색 조절 튜브에 추가합니다. mKO2 색상 제어 튜브에 mKO2 300ng과 필러 플라스미드 300ng을 추가합니다. 300ng의 TagBFP와 300ng의 필러 플라스미드를 TagBFP 색상 제어 튜브에 추가합니다.
   3. 300ng의 구성적 NeonGreen 플라스미드와 300ng의 필러 플라스미드를 NeonGreen 색상 제어 튜브에 추가합니다. mKO2, TagBFP 및 구성 NeonGreen의 각각 100ng과 필러 플라스미드 300ng을 모든 색상 제어 튜브에 추가합니다.
   4. 150ng의 mKO2를 폴리형질주입 믹스 1 튜브에 추가합니다. 75ng의 리포터 NeonGreen 플라스미드와 75ng의 필러 플라스미드를 폴리-형질주입 믹스 1 튜브에 추가합니다.
   5. 150ng의 TagBFP를 폴리형질주입 믹스 2 튜브에 추가합니다. 75 ng의 L7ae 플라스미드 및 75 ng의 필러 플라스미드를 폴리-형질주입 믹스 2 튜브에 첨가한다.
2. 216 μL의 환원된 혈청 배지와 9.48 μL의 형질주입 시약을 결합하여 1.5 mL 미세원심분리기 튜브에 형질주입 마스터 믹스를 만듭니다(시약 비율 및 반응 스케일링은 표 1 참조). 위아래로 피펫팅하여 잘 섞고 따로 보관합니다.
3. 1.58μL의 인핸서 시약을 각각 색상 제어 없음, 단일 색상 제어 및 모든 색상 제어 튜브에 추가합니다. 79 μL의 인핸서 시약을 각각의 폴리-트랜스펙션 믹스 튜브에 첨가한다. 각 튜브를 피펫팅으로 개별적으로 혼합합니다.
4. DNA가 들어 있는 각 튜브에 형질주입 마스터 믹스를 추가합니다.
   1. 37.58μL의 transfection 마스터 믹스를 각각 무색 제어, 단일 색상 제어 및 모든 색상 제어 튜브에 추가합니다. 각 튜브를 피펫팅으로 개별적으로 혼합합니다.
   2. 18.79 μL의 형질주입 마스터 혼합물을 각각의 폴리-형질주입 믹스 튜브에 첨가한다. 각 튜브를 피펫팅으로 개별적으로 혼합합니다.
5. 형질주입 믹스를 웰 내로 분배한다.
   1. 65.97 μL의 각 형질주입 혼합을 무색, 단색 및 모든 색상 대조군을 상응하는 웰에 피펫팅합니다.
   2. 32.98 μL의 폴리형질주입 피펫을 폴리형질감염 웰 내로 혼합하고, 복합체를 효과적으로 분배하기 위해 평평한 표면을 따라 타이트한 8자형 패턴으로 플레이트를 신속하지만 부드럽게 소용돌이친다. 이어서, 32.98 μL의 폴리형질주입 혼합된 2를 동일한 폴리형질주입 웰 내로 피펫팅하고 동일한 방식으로 플레이트를 소용돌이친다.
6. 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 5%_CO2 로 진탕하지 않고 48시간 동안 두었다.
   참고: 세포 생존율을 높이기 위해 형질주입 후 6시간마다 세포 배지를 교체할 수 있습니다(항상 필요한 것은 아니지만 HEK293 세포 및 그 유도체의 경우 배지를 교체할 때 플레이트에서 세포를 분리하지 않도록 주의해야 함).

시약	분량			스케일링
DNA 혼합물에 대한 혈청 배지 감소	대조군 튜브당 36 μL, 폴리-트랜스펙션 튜브당 18 μL			튜브당 혈청 배지/ng DNA 0.05μL 감소, 피펫팅을 설명하기 위해 10-20% 추가 부피
DNA (유전자)	튜브 당 300-600 ng
P3000 (영문)	대조군 튜브당 1.58 μL, 폴리 트랜스펙션 튜브당 0.79 μL			튜브당 0.0022 μL P3000/ng DNA, 10-20% 추가
Lipo 마스터 믹스를 위한 환원된 혈청 배지	대조군 튜브당 36 μL, 폴리-트랜스펙션 튜브당 18 μL			0.05 μL의 혈청 배지/ng 총 DNA 감소, 피펫팅을 설명하기 위해 10-20% 추가 부피
형질주입 및 인핸서 시약	대조군 튜브당 1.58 μL, 폴리 트랜스펙션 튜브당 0.79 μL			0.0022 μL 리포펙타민 3000/ng DNA, 10-20% 추가

표 1: transfection을 위한 시약 스케일링. 이 표는 단일 웰에 포함된 DNA 양에 대해 포함할 시약의 정확한 비율을 나타냅니다. 이것은 반응을 효과적으로 확장하고 마스터 믹스를 형성하는 데 사용할 수 있습니다. 시약의 양은 20% 초과분을 포함하도록 조정되었습니다.

3. 유세포 분석을 위한 세포 준비

1. 적어도 4.2 mL의 DMEM 용액을 37°C로 예비-가온한다. 적어도 4.2 mL의 트립신 및 4.2 mL의 PBS를 37°C로 예열한다. 사용할 준비가 될 때까지 형광 활성화 세포 분류(FACS) 완충 용액을 4°C에서 보관하십시오.
2. 응집을 줄이기 위해 FACS 완충액(1% BSA, 5mM 에틸렌디아민테트라아세트산[EDTA] 및 0.1% 아지드화나트륨[_NaN3]으로 보충된 PBS; 재료 표 참조)에 세포를 재현탁합니다.
   1. 각 웰에서 현재 매체를 흡인하고 폐기하십시오. PBS 5mL를 각 웰에 분주하여 세포를 세척합니다. PBS를 흡인하고 폐기하십시오.
   2. 5mL의 트립신을 각 웰에 분배합니다. 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 3분 동안 또는 세포가 더 이상 접시에 부착되지 않을 때까지 놓습니다. 플레이트를 생물안전 캐비닛으로 되돌리고 5mL의 DMEM 용액을 각 웰에 분배하여 세포 용액을 희석합니다.
   3. 각 웰에 대해 여러 번 부드럽게 피펫팅하여 용액을 혼합합니다. 각 웰에 대해 모든 배지를 흡인하고 15mL 원뿔형 튜브에 넣습니다.
3. 세포를 300 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다. 세포를 흡인하고 버리지 않도록 주의하면서 배지를 흡인합니다. 각 튜브에서 세포를 5mL의 FACS 완충 용액에 재현탁하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.
4. 각 세포 현탁액 용액을 스트레이너(덩어리 제거용)를 통해 별도의 유세포 분석 원추형 튜브로 통과시킵니다. 이 튜브를 얼음 위에 1시간 이상 두지 말고 가능한 한 빨리 유세포 분석을 수행하십시오.

4. 유세포 분석 수행

참고: 유세포 분석기를 작동하려면 필요한 작업에 대한 적절한 교육과 지식이 필요합니다. 소프트웨어 및 장비가 다를 수 있고 사용자는 일반적으로 교육을 받아야 하므로 이 섹션에서는 수행하는 데 유용한 특정 작업을 참조합니다.

1. 먼저, 필러 플라스미드 대조군(색상 대조군 없음)으로 형질감염된 세포를 검사하여 세포 특성을 선택하고 이상(응집체, 파편 등 포함)을 방지합니다. 셀을 구별하기 위한 다양한 매개변수 조합이 있지만, 구별되는 특징을 시각화하는 좋은 방법으로 다음 세 가지 일반 옵션을 사용하십시오.
   1. 측면 산란 영역(기본 설정/셀 유형별 로그 또는 선형 스케일)과 전방 산란 영역(선형 스케일)을 확인합니다.
   2. 측면 산란 높이(로그 스케일)와 측면 스캐터 폭(선형 스케일)을 확인합니다.
   3. 전방 산란 폭(선형 스케일)과 전방 스캐터 높이(선형 스케일)를 살펴봅니다.
2. 다음으로 단색 컨트롤을 살펴봅니다. 모든 색상 제어를 사용하여 기기 전압을 조정하여 각 형광 단백질의 신호가 형광의 등가 임의 단위(a.u.)로 정규화되도록 합니다. 다음으로, 보상 매트릭스를 설정하는 데 사용되는 각 형광 단백질에 대해 단색 컨트롤을 실행하여 블리드스루 보정을 허용합니다.
   알림: 이상적으로는 형광 값의 전체 동적 범위가 표시되어야 합니다. 형광 단백질 신호의 추가 정규화는 표준화된 단위(예: 등가 플루오레세인 분자[MEFL]; Beal et ^al.15 참조)로의 변환을 통해 수행할 수 있습니다. 해석 중에 MEFL 변환을 활성화하려면 무지개 보정 비드를 실행합니다. 이러한 교정은 또한 기기 간 및 일상적인 신호 변동을 감소시키는데 유용하다⁽¹⁶).
3. poly-transfection 샘플 튜브를 실행합니다.
   참고: 가능한 경우 1,000 x 10^(^ = 혼합) 세포를 실행하는 것이 좋으며, 분석 중에 고차원 폴리트랜스펙션을 더 많은 빈으로 세분화해야 하고 각 빈에는 통계적으로 유의미한 비교를 위해 충분한 세포(이상적으로는 >10)가 필요합니다.

5. 실험 후 분석 수행

1. 처음에는 컨트롤(및 해당되는 경우 비드)의 데이터를 사용하여 정확한 결과를 보장합니다. 사용 가능한 소프트웨어 도구 중 하나를 사용하여 라이브 셀 게이팅(위에서 설명한 게이트 사용), 보정 및 자가형광 보정을 수행합니다.
   참고: 일반적으로 사용자 지정 MATLAB 코드(예: https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis 또는 Cytoflow¹⁷)를 사용하며, 이 코드에는 그래픽 사용자 인터페이스와 전처리 단계 및 폴리 트랜스펙션 분석에 적합한 Python 라이브러리가 모두 있습니다.

메서드	콤플렉스	ng 형광 마커	ng L7ae (분획)	ng 리포터 (분수)	ng 필러 DNA(분획)	합계 (ng)
폴리-형질주입 1						600
→	1	150	75 (½)		75 (½)	300
→	2	150		75 (½)	75 (½)	300
폴리-형질주입 2						600
→	1	150	25 (1/6)		125 (5/6)	300
→	2	150		125 (5/6)	25(1/6)	300

표 2: 프로토콜에서 입증된 폴리형질감염을 위한 DNA 양, 및 조정된 플라스미드 비율을 사용한 후속 실험의 예. 표의 상반부는 간단한 폴리형질감염 실험에 사용된 플라스미드의 조성을 나타낸다. 하반부는 가상의 농도 공간을 더 잘 서브샘플링하기 위해 플라스미드 비율을 조정하는 업데이트된 실험의 구성을 보여주며, 여기서 유전자 발현 조절자는 리포터에 비해 더 최적의 1:5 비율에 있어 이 비율 주변의 샘플에 더 많은 형질주입된 세포를 생성합니다.

결과

그림 1에서 우리는 co-transfection과 poly-transfection을 비교합니다. 공동형질감염에서, 모든 플라스미드는 동일한 형질주입 혼합물로 전달되어, 임의의 단일 세포가 받는 각 플라스미드의 양 사이에 높은 상관관계를 초래한다(도 1A). 각 세포에 전달되는 총 플라스미드의 수는 크게 다르지만, 집단 전체에 걸쳐 개별 세포에 있는 두 리포터 단백질의 형광은 상...

토론

CAD(Computer-Aided Design), 브레드보드 및 3D 프린팅과 같은 신속한 프로토타이핑 방법은 기계, 전기 및 토목 공학 분야에 혁명을 일으켰습니다. 주어진 과제에 대한 가능한 많은 솔루션을 신속하게 검색할 수 있는 능력은 해당 분야의 발전을 크게 가속화합니다. 우리는 폴리 트랜스펙션이 생물 공학과 유사한 기술로, 유전자 회로의 신속한 프로토타이핑을 가능하게 한다고 믿습니다. 또한 다른 래피드 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
15mL Corning Falcon conical tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
24-well petri dish	Any company of choice		(Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin	NEB	B9000S
Centrifuge	Any company of choice		Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
Cytoflow	Non-commercial software package		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	Use the correct media for your cell type
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich	F4135
HEK cells	ATCC	CRL-1573	Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells	ATCC	CRL-12401	Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer	ThermoFisher Scientific	L3000001	Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer	BD Biosciences	N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Any company of choice
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	31985070	reduced serum medium
Phosphate buffered saline	ThermoFisher Scientific	70011044
Rainbow calibration beads	Spherotech	URCP-100-2H
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Trypsin	VWR	25-053-CI