采用多转染的细胞状态识别电路的快速开发

摘要

复杂的基因回路在设计、测试和优化方面非常耗时。为了促进这一过程，哺乳动物细胞的转染方式允许在单个孔中测试电路组件的多个化学计量。该方案概述了实验计划、转染和数据分析的步骤。

摘要

哺乳动物遗传回路已经显示出感知和治疗各种疾病状态的潜力，但电路组件水平的优化仍然具有挑战性和劳动密集型。为了加速这一过程，我们的实验室开发了多转染，这是传统哺乳动物转染的高通量扩展。在多转染中，转染群体中的每个细胞基本上执行不同的实验，测试不同DNA拷贝数下的电路行为，并允许用户在单罐反应中分析大量化学计量。到目前为止，已经证明了优化单孔细胞中三组分电路比例的多转染;原则上，相同的方法可用于开发更大的电路。多转染结果可以轻松用于找到瞬时回路中DNA与共转染的最佳比例，或为产生稳定细胞系的电路组分选择表达水平。

在这里，我们演示了如何使用多转染来优化三组分电路。该方案从实验设计原则开始，并解释了多转染如何在传统共转染方法的基础上进行构建。接下来，进行细胞的多转染，几天后进行流式细胞术。最后，通过检查对应于具有特定成分比例的细胞亚群的单细胞流式细胞术数据切片来分析数据。在实验室中，多转染已被用于优化细胞分类器、反馈和前馈控制器、双稳基序等。这种简单但强大的方法加快了哺乳动物细胞中复杂遗传回路的设计周期。

引言

哺乳动物合成生物学领域发展迅速，从在培养细胞系中开发简单的感知和反应部分到优化复杂的基因网络，以应对诊断和治疗方面的现实^挑战1。这些精密电路能够检测从microRNA谱到细胞因子再到小分子药物的生物输入，并实现逻辑处理电路，包括晶体管、带通滤波器、拨动开关和振荡器。他们还在癌症，关节炎，糖尿病等疾病的动物模型中显示出有希望的结果1，²，³，^4，5。然而，随着电路复杂性的增加，优化其每个组件的电平变得越来越具有挑战性。

一种特别有用的遗传回路类型是细胞分类器，它可以被编程为感知和响应细胞状态。在特定细胞状态下选择性生产蛋白质或RNA输出是指导和编程细胞和类器官分化，识别和破坏患病细胞和/或不良细胞类型以及调节治疗细胞功能的有力工具¹，²，³，^4，5.然而，在哺乳动物细胞中创建能够准确分类来自多个细胞RNA和/或蛋白质物种的细胞状态的回路一直极具挑战性。

开发细胞分类回路最耗时的步骤之一是优化环内单个组分基因（如传感器和处理因子）的相对表达水平。为了加快电路优化并允许构建更复杂的电路，最近的工作使用细胞分类器电路及其组件的数学建模来预测最佳组成和拓扑6^，7。虽然到目前为止这已经显示出强大的结果，但数学分析受到需要系统表征电路中组件基因的输入输出行为的限制，这非常耗时。此外，在复杂的遗传回路中可能会出现无数与上下文相关的问题，导致完整回路的行为违背基于单个部分特征的预测8^，9。

为了更快地开发和测试复杂的哺乳动物电路，如细胞状态分类器，我们的实验室开发了一种称为多转染¹⁰的技术，这是质粒共转染方案的演变。在共转染中，将多个质粒DNA物种与带正电荷的脂质或聚合物试剂络合在一起，然后以相关方式递送到细胞（图1A）。在多转染中，质粒与试剂单独复合，使得每个转染复合物的DNA以去相关方式递送到细胞（图1B）。使用这种方法，转染群体中的细胞暴露于携带不同电路组件的两个或多个DNA有效载荷的多种比例组合中。

为了测量输送到每个细胞的电路元件的比例，多转染中的每个转染复合物都包含一个组成型表达的荧光报告基因，该荧光报告基因可作为细胞摄取复合物的代表。不含哺乳动物细胞内任何活性元素的填充DNA用于调节单个转染复合物中递送到细胞的荧光报告基因和电路元件的相对量，并在讨论中更详细地讨论。Weiss实验室中使用的填充DNA的一个例子是包含终止子序列的质粒，但没有启动子，编码序列等。然后可以比较具有不同电路组件比例的细胞，以找到基因回路功能的最佳比例。这反过来又为选择启动子和其他电路元件提供了有用的预测，以便在将电路组分组合到单个载体中进行遗传整合（例如，慢病毒、转座子或着陆垫）时达到最佳基因表达水平。因此，多转染不是根据 直觉或通过耗时 的试错过程来选择电路组件之间的比率，而是在单罐反应中评估遗传部分之间的各种化学计量。

在我们的实验室中，多转染已经优化了许多遗传回路，包括细胞分类器、反馈和前馈控制器以及双稳态基序。这种简单但强大的方法大大加快了哺乳动物细胞中复杂遗传回路的设计周期。此后，多转染已被用于表征多个遗传电路，以高分辨率¹⁰揭示其多维输入输出传递函数，优化细胞状态分类¹¹的替代电路拓扑，并加速各种已发表的^12，13 和正在进行的项目。

在这里，我们描述并使用多转染快速优化遗传电路的工作流程（图2）。该实验方案展示了如何生成高质量的多转染数据，并避免多转染方案和数据分析中的几个常见错误（图3）。然后演示如何使用多转染来表征简单的电路元件，并在此过程中将多转染结果与共转染进行基准比较（图4）。最后，多转染结果表明癌症分类器电路的优化（图5）。

研究方案

注意:表 1 和 表2 是该协议的重要参考。表 1 显示了反应的试剂缩放， 表2 显示了方案中描述的示例多转染（上半部分）和可能的后续实验（下半部分）的DNA比率算术。

1. 制备转染用细胞

1. 在开始方案之前，确保人胚胎肾（HEK293）细胞的培养为60%-80%汇合。为此，2天前在100mm x 15mm组织培养培养皿中接种1 x 10⁶ 细胞，并在37°C下用5%CO₂孵育。
   注意:虽然我们的实验方案侧重于HEK293细胞，但其他细胞类型可能会被替代。
2. 如下所述准备用于转染的培养基和细胞。
   1. 将至少 20 mL 的 Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM） 溶液与 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 非必需氨基酸 （NEAA;参见 材料表） 预热至 37 °C。 将至少 2.4 mL 胰蛋白酶和 2.4 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 预热至 37 °C。预热还原血清培养基至~16°C。
      注意:所有组织培养工作都应在生物安全柜中小心进行。
3. 如下所述将细胞重悬于DMEM溶液中。
   1. 吸出并处理当前介质。将 2 mL PBS 分配到 HEK293 细胞培养物上以洗涤细胞。吸出并处理 PBS。
   2. 将 2 mL 胰蛋白酶分配到 HEK293 细胞培养物中。将培养皿置于37°C的培养箱中3分钟或直到细胞不再粘附在培养皿上。将培养皿放回生物安全柜中，通过将 8 mL DMEM 溶液分配到板中来稀释细胞溶液。
   3. 通过轻轻上下移液几次来混合溶液。吸出所有培养基并将其放入 15 mL 锥形管中。
4. 将细胞以300 x g 离心3分钟以沉淀它们。吸出培养基（注意不要吸出细胞）并丢弃它。将细胞重悬于 5 mL DMEM 溶液中，通过轻轻上下移液进行混合。
5. 使用自动细胞计数器（在 材料表中列出）估计当前的细胞浓度。在具有1 x 10⁵ 个细胞的24孔板中接种六个孔（在本例中）（接种密度为50，000个细胞/ cm²）。
6. 加入最多 500 μL 的 DMEM 溶液（首先将 DMEM 溶液添加到孔中），然后每次处理标记一个孔，如下所示:无颜色对照、mKO2 对照、TagBFP 对照、NeonGreen 对照、全颜色对照和多转染 1。TagBFP、mKO2和NeonGreen对照孔是多转染中所有荧光蛋白的单色对照。

2. 进行转染

1. 为每个DNA聚集体准备试管。留出 1.5 mL 微量离心管，并将试管标记为:无颜色对照、mKO2 对照、TagBFP 对照、NeonGreen 对照、全色对照、多转染混合物 1 和多转染混合物 2。
   1. 向无颜色对照、mKO2 对照、TagBFP 对照、NeonGreen 对照和所有颜色对照管中加入 36 μL 还原血清培养基。向各多转染混合物 1 和多转染混合物 2 管中加入 18 μL 还原血清培养基。
      注意:假设质粒浓度为150ng / μL。
   2. 将 600 ng 填充质粒添加到无颜色对照管中。向mKO2颜色对照管中加入300ng的mKO2和300ng的填充质粒。向 TagBFP 颜色对照管中加入 300 ng 的 TagBFP 和 300 ng 的填充质粒。
   3. 向NeonGreen颜色对照管中加入300ng组成型NeonGreen质粒和300ng填充质粒。向全色对照管中加入 mKO2、TagBFP 和组成型 NeonGreen 各 100 ng，以及 300 ng 填充质粒。
   4. 将 150 ng mKO2 加入聚转染混合物 1 管中。将 75 ng 的报告基因 NeonGreen 质粒和 75 ng 填充质粒加入多转染混合物 1 管中。
   5. 将 150 ng TagBFP 加入聚转染混合物 2 管中。将 75 ng 的 L7ae 质粒和 75 ng 的填充质粒加入到多转染混合物 2 管中。
2. 将 216 μL 还原血清培养基与 9.48 μL 转染试剂混合，在 1.5 mL 微量离心管中创建转染预混液（试剂比例和反应规模见 表 1 ）。上下移液充分混合，放在一边。
3. 向每个无色对照管、单色对照管和所有颜色对照管中加入 1.58 μL 增强剂试剂。向每个聚转染混合管中加入 79 μL 增强剂试剂。通过剧烈移液单独混合每个试管。
4. 将转染预混液添加到每个含有DNA的试管中。
   1. 向无色对照管、单色对照管和所有色控管中加入37.58 μL转染预混液。通过剧烈移液单独混合每个试管。
   2. 向每个多转染混合管中加入 18.79 μL 转染预混液。通过剧烈移液单独混合每个试管。
5. 将转染混合物分配到孔中。
   1. 将无色、单色和全色对照的每种转染混合物移液 65.97 μL 到相应的孔中。
   2. 将 32.98 μL 的聚乙烯转染混合物 1 移入多转染孔中，沿平坦表面以紧密的八字形模式快速、轻柔地旋转板，以有效分布复合物。然后，将 32.98 μL 的多转染混合物 2 移液到同一聚转染孔中，并以相同的方式旋转板。
6. 将板置于37°C的培养箱中，用5%CO₂ 并且不摇动，持续48小时。
   注意:为了提高细胞活力，可以在转染后每6小时更换一次细胞培养基（尽管这并不总是必要的，并且对于HEK293细胞及其衍生物，更换培养基时必须注意不要将细胞从板上分离）。

试剂	量			缩放
用于DNA混合物的还原血清培养基	每个对照管 36 μL，每个多转染管 18 μL			每管 0.05 μL 降低血清培养基/ng DNA，额外 10-20% 体积用于移液
脱氧核糖核酸	每管 300-600 ng
P3000系列	每个对照管 1.58 μL，每个聚转染管 0.79 μL			每管 0.0022 μL P3000/ng DNA，额外含 10-20%
用于脂质预混液的还原血清培养基	每个对照管 36 μL，每个多转染管 18 μL			0.05 μL 降低血清培养基/ng 总 DNA，额外 10-20% 体积用于移液
转染和增强剂试剂	每个对照管 1.58 μL，每个聚转染管 0.79 μL			0.0022 μL 脂质菌胺 3000/ng DNA，含额外 10-20%

表1:转染试剂缩放。 该表显示了单个孔中包含的DNA数量的试剂的正确比例。这可用于有效地调整反应规模并形成预混液。试剂数量已扩大到包括20%的过量。

3. 制备流式细胞术用细胞

1. 将至少 4.2 mL 的 DMEM 溶液预热至 37 °C。 将至少 4.2 mL 胰蛋白酶和 4.2 mL PBS 预热至 37 °C。 将荧光激活细胞分选（FACS）缓冲溶液保持在4°C直至准备使用。
2. 将细胞重悬于FACS缓冲溶液（PBS补充有1%BSA，5mM乙二胺四乙酸[EDTA]和0.1%叠氮化钠[NaN₃]，以减少结块;参见 材料表）如下所述。
   1. 吸出并处理每个孔中的当前介质。将 5 mL PBS 分配到每个孔中以洗涤细胞。吸出并处理 PBS。
   2. 将 5 mL 胰蛋白酶分配到每个孔中。将板置于37°C的培养箱中3分钟，或直到细胞不再粘附在培养皿上。将板放回生物安全柜，并通过向每个孔中分配 5 mL DMEM 溶液来稀释细胞溶液。
   3. 对于每个孔，通过轻轻上下移液几次来混合溶液。对于每个孔，吸出所有培养基并将其放入 15 mL 锥形管中。
3. 将细胞以300 x g 离心3分钟以沉淀它们。吸出培养基，注意不要吸出细胞并将其丢弃。在每个试管中，将细胞重悬于 5 mL FACS 缓冲溶液中，通过轻轻上下移液进行混合。
4. 将每个细胞悬液通过过滤器（去除团块）放入单独的流式细胞术锥形管中。将这些试管放在冰上不超过1小时，并尽快进行流式细胞术。

4. 流式细胞术

注意:操作流式细胞仪需要适当的培训和必要任务的知识。由于软件和设备可能有所不同，并且用户应接受一般培训，因此本节是指有用的特定操作。

1. 首先，检查用填充质粒对照（无颜色对照）转染的细胞，以选择细胞特征并避免异常（包括聚集体、碎片等）。虽然有许多参数组合可以区分像元，但请使用以下三个常规选项作为可视化区分要素的好方法。
   1. 查看侧向散射区域（每个首选项/像元类型的对数或线性刻度）与前向散射区域（线性刻度）。
   2. 查看侧散射高度（对数刻度）与侧散射宽度（线性刻度）。
   3. 查看前向散射宽度（线性刻度）与前向散射高度（线性刻度）。
2. 接下来，查看单色控件。使用全颜色控制来调节仪器电压，以便将来自每个荧光蛋白的信号归一化为等效的任意荧光单位（a.u.）。接下来，运行每种荧光蛋白的单色对照，用于设置补偿基质，允许渗漏校正。
   注意:理想情况下，荧光值的整个动态范围应该是可见的。荧光蛋白信号的进一步归一化 可以通过转换为标准化 单位来完成（例如，等效荧光素分子[MEFL;参见Beal等人.¹⁵]）。要在分析过程中启用MEFL转换，请运行彩虹校准珠。这种校准对于减少仪器间和日常信号变化也很有用¹⁶。
3. 运行多转染样品管。
   注意:在可能的情况下，建议运行1，000 x 10^（^ =混合）细胞，因为在分析过程中需要将高维多转染细分为更多箱，并且每个箱需要足够的细胞（理想情况下>10）才能进行具有统计学意义的比较。

5. 进行实验后分析

1. 首先，使用来自对照（以及磁珠（如果适用）的数据来确保准确的结果。使用可用的软件工具之一进行活细胞门控（使用上述门）、补偿和自发荧光校正。
   注意:我们通常使用自定义 MATLAB 代码（例如 https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis 或 Cytoflow¹⁷），该代码具有图形用户界面和适用于预处理阶段和多转染分析的 python 库。

方法	复杂	ng荧光标记	ng L7ae （馏分）	吴报告员（分数）	ng 填充物 DNA（分数）	总计（纳克）
多转染 1						600
→	1	150	75 (½)		75 (½)	300
→	2	150		75 (½)	75 (½)	300
多转染 2						600
→	1	150	25 (1/6)		125 (5/6)	300
→	2	150		125 (5/6)	25(1/6)	300

表2:方案中演示的多转染DNA量，以及调谐质粒比例的示例后续实验。 表格的上半部分显示了简单多转染实验中使用的质粒组成。下半部分显示了更新实验的组成，该实验调整质粒比率以更好地对假设的浓度空间进行子采样，其中基因表达调节剂相对于其报告基因处于更理想的 1:5 比率，产生更多转染细胞来采样该比率。

结果

在 图1中，我们比较了共转染与多转染。在共转染中，所有质粒都在同一转染混合物中递送，导致任何单个细胞接收的每个质粒的量之间存在高度相关性（图1A）。虽然递送到每个细胞的总质粒数量差异很大，但整个群体中单个细胞中两种报告蛋白的荧光密切相关，表明两种质粒以相当恒定的比例共同递送。转染的细胞可能摄取很少或许多复合物，但由...

讨论

计算机辅助设计 （CAD）、试验板和 3D 打印等快速原型制作方法彻底改变了机械、电气和土木工程学科。快速搜索针对给定挑战的许多可能解决方案的能力极大地加快了该领域的进展。我们相信多转染是生物工程的类似技术，能够快速制作基因回路的原型。此外，其他快速原型技术需要对多种可能的解决方案进行手动顺序迭代，而多转染能够同时探索多种解决方案。多转染可以在单个孔中测试大?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15mL Corning Falcon conical tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
24-well petri dish	Any company of choice		(Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin	NEB	B9000S
Centrifuge	Any company of choice		Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
Cytoflow	Non-commercial software package		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	Use the correct media for your cell type
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich	F4135
HEK cells	ATCC	CRL-1573	Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells	ATCC	CRL-12401	Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer	ThermoFisher Scientific	L3000001	Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer	BD Biosciences	N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Any company of choice
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	31985070	reduced serum medium
Phosphate buffered saline	ThermoFisher Scientific	70011044
Rainbow calibration beads	Spherotech	URCP-100-2H
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Trypsin	VWR	25-053-CI