مقايسة امتصاص الأجسام المضادة لتتبع الشق / الالتقام الخلوي دلتا أثناء التقسيم غير المتماثل لأسلاف الدبقية الكعبرية الزرد

Summary

يطور هذا العمل مقايسة امتصاص الأجسام المضادة لتصوير إشارات Notch / DeltaD داخل السلالة في تقسيم أسلاف الدبقية الشعاعية لدماغ الزرد الجنيني.

Abstract

يعد الانقسام الخلوي غير المتماثل (ACD) ، الذي ينتج خليتين ابنتين من مصائر مختلفة ، أمرا أساسيا لتوليد التنوع الخلوي. في الأعضاء النامية لكل من اللافقاريات والفقاريات ، يولد السلف المنقسم بشكل غير متماثل الشق عالي التجديد الذاتي وابنة Notch^lo المميزة. في دماغ الزرد الجنيني ، تخضع أسلاف الدبقية الكعبرية (RGPs) - الخلايا الجذعية العصبية الفقارية الرئيسية - في الغالب ل ACD لتلد RGP واحد وخلية عصبية متمايزة واحدة. إن الوضوح البصري وسهولة الوصول إلى أجنة الزرد يجعلها مثالية للتصوير بفاصل زمني في الجسم الحي لتصور مباشر كيف ومتى يتم إنشاء عدم تناسق إشارات Notch أثناء ACD. أظهرت الدراسات الحديثة أن التكاثر الخلوي الديناميكي ل Notch ligand DeltaD يلعب دورا مهما في تحديد مصير الخلية أثناء ACD ، ويتم تنظيم العملية بواسطة منظم القطبية المحفوظ تطوريا Par-3 (المعروف أيضا باسم Pard3) ومجمع محرك الداينين. لتصور أنماط الاتجار في الجسم الحي لإندوسومات إشارات Notch في RGPs الانقسامية ، قمنا بتطوير مقايسة امتصاص الأجسام المضادة هذه. باستخدام الفحص ، اكتشفنا ديناميكية الإندوسومات المحتوية على DeltaD أثناء تقسيم RGP.

Introduction

تتحكم إشارات الشق في قرار مصير الخلية ونمطها أثناء التطور في metazoans¹ ، وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن إشارات Notch في انقسام الخلايا الجذعية تعتمد بشكل أساسي على الاتجار داخل الخلايا ^2,3. يمكن ل Endocytosed Notch / Delta تنشيط إشارات Notch في النواة وتعزيز نسخ الجينات المستهدفة من Notch⁴،^5،6. لوحظ الاتجار بالشق الاتجاهي / دلتا endosomal لأول مرة في خلايا سلائف الأعضاء الحسية (SOP) في ذبابة الفاكهة أثناء انقسام الخلايا غير المتماثل (ACD) ، مما أدى إلى نشاط إشارات Notch أعلى في pIIa مقارنة ب pIIb ^7,8. تم تطبيق مقايسات امتصاص الأجسام المضادة مع الأجسام المضادة لدلتا والأجسام المضادة للشق لمراقبة العملية الداخلية في خلايا SOP الانقسامية. تتحرك إندوسومات الشق / دلتا D جنبا إلى جنب مع بروتين محرك كينيسين إلى المغزل المركزي أثناء التحريك الخلوي ، ويتم نقلها بشكل غير متماثل إلى خلية pIIa بسبب المصفوفة المضادة للتوازي للمغزل المركزي غير المتماثل في اللحظة الأخيرة من انقسام الخلية ^3,8. ألقت هذه الدراسات الضوء على الآليات الجزيئية التي تنظم الانقسام غير المتماثل في خلايا ذبابة الفاكهة SOP ، ولكن من غير الواضح ما إذا كانت العمليات الداخلية المماثلة تحدث في أسلاف الخلايا الدبقية الشعاعية الفقارية (RGPs).

علاوة على ذلك ، فإن الآليات الجزيئية التي تنظم إشارات Notch / DeltaD غير المتماثلة أثناء انقسام RGP للفقاريات ليست مفهومة جيدا. في الزرد ، تم الإبلاغ عن أن تفاعل Notch و Delta يسهل التداخل الخلوي ل DeltaD^{ligand 9}. من غير المعروف ما إذا كان التكاثر الخلوي DeltaD يمكن أن يؤثر على اختيار مصير الخلية للخلايا الوليدة في دماغ الفقاريات النامية. تظهر الدراسات الحديثة أن حقن الأجسام المضادة المضادة ل DeltaD المترافقة بالفلورسنت في الأنبوب العصبي يمكن أن يسمي إندوسومات سارة على وجه التحديد في الخلايا الظهارية العصبية ، ومضادات DeltaD التي تحتوي على إندوسومات سارة تنفصل بشكل تفضيلي إلى خلايا ابنة متكاثرة¹⁰. وقد اقترح أن إشارات الشق من الإندوسومات يمكن أن تنظم مصير الخلايا الابنة. أظهرت النتائج السابقة أن معظم خلايا RGP لأسماك الزرد في الدماغ الأمامي النامي تخضع ل ACD ، ويعتمد تحديد مصير الخلية الابنة على إشارات Notch / DeltaD داخل السلالة¹¹. من أجل توضيح طبيعة إشارات Notch / DeltaD داخل النسب في RGPs الزرد ، قمنا بتطوير مقايسة امتصاص الأجسام المضادة ل DeltaD في الدماغ النامي لأسماك الزرد. باستخدام هذا البروتوكول ، نجحنا في إجراء وضع العلامات الحية والتصوير لتهريب الخلايا الداخلية DeltaD في RGPs الانقسامية.

يتم استيعاب الجسم المضاد المضاد DeltaD المسمى بالفلورسنت بكفاءة في RGPs على طول البطين الأمامي للدماغ. لقد سهل إلى حد كبير اكتشاف الاتجار الاتجاهي بإندوسومات DeltaD في RGPs المقسمة بشكل غير متماثل^12,13. بالمقارنة مع بروتوكولات امتصاص الأجسام المضادة السابقة التي تم تطويرها لمزارع ذبابة الفاكهة والحبل الشوكي الزرد 10 ، حقق هذا البروتوكول علامات طويلة الأمد وعالية الكفاءة لمكافحة DeltaD في طبقة خلايا البطين في الدماغ ، وتحديدا مع أقل من¹⁰ nL من خليط الأجسام المضادة المحقونة بالحقن الدقيق. يعد حقن البطين الخلفي في الدماغ مناسبا جدا لتطبيق مقايسة امتصاص الأجسام المضادة في الدماغ النامي ، حيث يتم توسيع البطين الخلفي بشكل جيد في أجنة الزرد ويمتلئ بالسائل النخاعي في مرحلة التطور^{المبكرة 14}. من خلال حقن خليط الأجسام المضادة في البطين الخلفي للدماغ دون إصابة أي أنسجة نامية مهمة ، قلل البروتوكول من الضرر المحتمل لمنطقة التصوير في الدماغ الأمامي قدر الإمكان. كما تجنبت الجرعة المخفضة للجسم المضاد الأولي المحقون الآثار الجانبية المحتملة للتدخل في إشارات دلتا نوتش الداخلية في الجسم الحي. يمكن دمج هذا البروتوكول بسهولة مع الاضطرابات الدوائية أو الجينية الأخرى ، واستخدامه في مراحل نمو مختلفة ، وربما تكييفه مع الدماغ البالغ وكذلك عضويات الدماغ 2D / 3D المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية. مجتمعة ، جعل البروتوكول من الممكن فهم كيف ومتى يتم إنشاء عدم تناسق إشارات Notch أثناء ACD. يتمثل التحدي الرئيسي للتنفيذ الناجح لهذا البروتوكول في تحقيق التسليم الدقيق للتركيزات المناسبة للجسم المضاد بناء على ظروف تجريبية محددة.

Protocol

لقد استخدمنا خط النوع البري AB والخط المعدل وراثيا Tg [ef1a: Myr-Tdtomato] للدراسة. تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) في جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو ، الولايات المتحدة الأمريكية (رقم الموافقة: AN179000).

1. تحضير أجنة الزرد

1. قم بإعداد خزانات عبور الأسماك في فترة ما بعد الظهر قبل الساعة 5:00 مساء ، مع أنثى سمكة من النوع البري وسمك ذكر واحد Tg [ef1a: Myr-Tdtomato] باستخدام فواصل لفصلها في كل حوض.
2. قم بإزالة الفواصل قبل الساعة 11:00 صباحا من جميع خزانات العبور في صباح اليوم التالي. التزم الصمت ولا تزعج الأسماك أثناء التزاوج. يحدث التبويض عادة في غضون 30 دقيقة بعد إزالة الفواصل. يبقى البيض المخصب في قاع الخزان.
   1. جمع البيض المخصب من الدبابات مع مرشح شبكة. انقل البيض عن طريق غسله في طبق بتري مليء بماء البيض وافحص الأجنة تحت مجهر تشريح بتكبير 10x إلى 20x.
3. انقل الأجنة المخصبة إلى طبق بتري نظيف يحتوي على حوالي 20 مل من وسط الجنين (100 مل من محلول مخزون 1000x يحتوي على 29.4 جم من كلوريد الصوديوم ، و 1.27 جم من KCl ، و 4.85 جم من CaCl 2.2H 2 O ، و 8.13 جم من MgSO_{4.7H 2}O) مع ماصات باستور الزجاجية ذات التجويف الكبير. الحفاظ على الأجنة عند 28 درجة مئوية. احتفظ ب 50 جنينا مخصبا لكل طبق بتري مع 30 مل من وسط الجنين عند 28.5 درجة مئوية.
   ملاحظة: ينتج زوج واحد من الأسماك عادة 100-300 جنين ، ومعدل الإخصاب والبقاء على قيد الحياة للأجنة السليمة يزيد عن 95٪ لكل تزاوج.
4. في صباح اليوم التالي ، أخرج الأجنة من الحاضنة في الساعة 8:00 صباحا ، عندما وصلت الأجنة إلى مرحلة النمو ~ 18-20 ساعة بعد الإخصاب (HPF). راقبهم تحت مجهر التألق عند تكبير 20x ، باستخدام الضوء الأبيض في البداية. في ذلك الوقت ، تكون أجنة الزرد في مرحلة 20 سوميت.
   1. تخلص من الأجنة الميتة الغائمة أو الممزقة تحت المجهر باستخدام ماصة زجاجية.
5. قم بتشغيل مصباح الفلورسنت واختر إعداد مرشح RFP للمجهر. ثم ، حدد الأجنة ذات التألق الأحمر القوي وانقلها إلى طبق جديد بماء البيض.
   1. قم بإزالة الأجنة يدويا باستخدام ملقطين دقيقين (يجب أن تكون أطراف الملقط حادة وغير تالفة) تحت الضوء الأبيض (جدول المواد).
   2. امسك المشيم بزوج واحد من الملقط وقم بعمل تمزق في المشيم بالملقط الآخر. افتح المسيل للدموع بعناية باستخدام الملقط ، واجعله كبيرا بما يكفي لمرور الجنين عن طريق دفع الجنين برفق بأطراف الملقط الآخر.
6. انقل الأجنة المنزوعة الأيونات إلى طبق بتري جديد بوسط جنيني طازج لشطف سريع قبل الحقن المجهري.

2. إعداد الحقن المجهري

1. استخدم الشعيرات الدموية (1.2 مم OD ، 0.9 مم ID ، مع خيوط) لسحب إبر الحقن الدقيقة على مجتذب. تصميم وتحسين برنامج السحب وفقا للكتيب.
2. افتح طرف الإبرة بالملقط تحت مجهر تشريح ستيريو. اجعل قطر الطرف حوالي 10 ميكرومتر ، وزاوية الاستدقاق حوالي 30 درجة.
3. اقترن الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل Dld للفأر مع مضاد الفأر IgG-Atto647N قبل الحقن.
   1. لكل تجربة حقن، امزج 0.5 ميكرولتر من الجسم المضاد ل Dld (0.5 مجم / مل) مع 2 ميكرولتر من الجسم المضاد المضاد للفأر IgG-Atto647N (1 مجم / مل) عن طريق سحب 5-10 مرات. ثم ، احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل (أو على الجليد لمدة 2-3 ساعات).
   2. بعد الحضانة ، أضف 2.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع (10 مجم / مل من الفأر IgG) و 0.5 ميكرولتر من 0.5٪ فينول أحمر إلى خليط الأجسام المضادة ، وماصة 10x للخلط جيدا ، لمنع أي أجسام مضادة غير مقترنة متبقية في الخليط.
      ملاحظة: لكل تجربة، قم بإعداد خليط إضافي واحد بدون الجسم المضاد ل Dld واستخدمه كعنصر تحكم.
4. تحضير 1 ٪ أغاروز نقطة انصهار منخفضة في وسط الجنين. سخني خليط الأغاروز على حرارة 70 درجة مئوية حتى يصبح المزيج شفافا.
   1. قسمة محلول الأغاروز في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 2 مل. احتفظ بالحصص في كتلة حرارية عند ~ 40 °C.
5. شطف الجنين في أنبوب يحتوي على 1 ٪ نقطة انصهار منخفضة agarose لمدة 3 ثوان.
6. ضع الجنين على غطاء طبق بتري بلاستيكي مقلوب مع قطرات فردية من الأغاروز (~ 30-40 ميكرولتر) لتركيب كل جنين على حدة على الغطاء كما هو موضح في الشكل 1. ضع الأجنة بشكل مسطح بشكل جانبي في الأغاروز وحافظ على هذا الوضع حتى يتجمد الأغاروز في درجة حرارة الغرفة.
7. جبل 12 الأجنة في ثلاثة صفوف واحدا تلو الآخر على النحو الوارد أعلاه. تغطية جميع الأجنة المركبة في agarose مع وسط البيض.

3. الحقن المجهري

1. ضع الأجنة المضمنة تحت المجهر المجسم وقم بتغطية الأغاروز بماء البيض.
2. اضبط حاقن ضغط الهواء مع المعالجات الدقيقة ، وضعها بالقرب من المجاهر كما هو موضح في الشكل 1. استخدم أسطوانة الغاز الفولاذية التي تحتوي على النيتروجين الغازي (N₂) تحت ضغط عال كمورد للهواء.
   1. افتح صمام الغاز فقط بعد تركيب الأجنة في الأغاروز. بعد ذلك ، قم بتحميل الإبرة الزجاجية المحضرة مسبقا ب 2 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة على المعالج الدقيق ، كما هو موضح في الشكل 1 ، عند استخدام وحدة التعبئة الأمامية للحاقن الدقيق.
   2. اضبط ضغط الإدخال على ~ 80-90 رطل / بوصة مربعة ، وضغط الحقن على ~ 20 رطل / بوصة مربعة.
3. معايرة حجم الحقن باستخدام ميكرومتر تحت المجهر ، كما هو موضح سابقا¹⁵. اضبط مدة وقت الضبط لتكون من 10 مللي ثانية إلى 120 مللي ثانية ، وفقا لحجم فتحة الإبرة. قم بتوصيل كل نبضة من الحقن عن طريق النقر على المجداف. ضبط حجم الحقن لكل تسليم إلى ~ 4-5 nL.
4. قم بوخز طرف إبرة الحقن المجهري من خلال لوحة السقف الظهرية للدماغ الخلفي الخلفي إلى نقطة المفصلة r0 / r1 ، وحقن حوالي 10 nL (نبضتان أو ثلاث نبضات) من خليط الأجسام المضادة دون ضرب أنسجة المخ. مراقبة تدفق السوائل الحمراء في بطين الدماغ.
   ملاحظة: البطين الخلفي للدماغ الخلفي هو الخلفي لحدود الدماغ الخلفي للدماغ المتوسط. يملأ خليط الأجسام المضادة المحتوي على الفينول الأحمر المحقون بطين الدماغ من الدماغ الخلفي إلى الدماغ الأمامي على الفور عن طريق الانتشار بالسائل الدماغي الشوكي.
5. بعد الحقن ، قم بإزالة طرف الإبرة من الجنين بسرعة عن طريق تدوير مقبض المعالج الدقيق. للحصول على حقن ناجح ، تبقى الصبغة الحمراء للخليط المحقون في بطين الدماغ بثبات دون أن تتسرب إلى الأغاروز المحيط.
6. حرك لوحة التثبيت تحت المجهر لتحديد موقع جنين مركب آخر في وضع مناسب للتكرار.
   1. بعد حقن ستة إلى ثمانية أجنة ، قشر الأغاروز بسكين جراحي مجهري لتحرير الأجنة من الأغاروز المدمج. انقل الأجنة المحقونة بالحقن الدقيق إلى طبق طازج يحتوي على 30 مل من وسط الجنين ، وضعها في درجة حرارة الغرفة للخطوات التالية.

4. تصاعد والتصوير الحي الفاصل الزمني

1. بعد 30 دقيقة ، انقل الأجنة المختارة إلى 10 مل من وسط الجنين. أضف 420 ميكرولتر من مخزون التريكايين (4 مجم / مل) إلى 10 مل من وسط الجنين لتخدير الأجنة.
2. لتركيب الأجنة ، قم بإعداد أغاروز منخفض بنسبة 0.8٪ يحتوي على نفس تركيز التريكايين في الأنبوب. احتفظ بالحصص في كتلة حرارية عند ~ 40 °C.
3. استخدم ماصة زجاجية لغمر الأجنة المحقونة في الأغاروز الدافئ لمدة 3 ثوان. بعد ذلك ، قم بإزالة الأجنة على الفور من الأغاروز بنفس الماصة الزجاجية وضع الأجنة في وسط أطباق الثقافة ذات القاع الزجاجي 35 مم مع قطرة من الأغاروز من الأنبوب. ضع جنينا واحدا فقط لكل قطرة على الزجاج.
4. قم بتوجيه الأجنة برفق باستخدام مسبار الألياف أو طرف التحميل لإبقاء الجانب الظهري من الدماغ الجنيني قريبا من القاع الزجاجي قدر الإمكان. اضبطي موضع الجنين برفق لتمديد الجنين دون تجعيد الشعر حيث يتجمد الأغاروز تدريجيا.
5. بعد ذلك ، تحقق من موضع الجنين عن طريق قلب الطبق السفلي الزجاجي. تأكد من أن الدماغ الأمامي الظهري بالكامل مع الأجنة المثبتة بشكل صحيح يمكن رؤيته تحت المجهر.
6. أضف 2-3 مل من 28.5 درجة مئوية من وسط جنيني مسخن مسبقا يحتوي على تريكايين لتغطية الجنين. ضع الطبق بشكل صحيح على مرحلة التحكم في درجة حرارة المجهر متحد البؤر، كما هو موضح في الشكل 1. اضبط درجة حرارة غرفة التصوير لتكون عند 28.5 درجة مئوية. الجنين جاهز الآن للتصوير.
7. قم بإجراء تصوير مباشر بفاصل زمني مع فاصل زمني ثابت باستخدام هدف غمر الماء 40x.
   1. استخدم برنامج التصوير والتحكم المجهري (μMANAGER: https://micro-manager.org/)¹⁶.
   2. حدد قنوات التصوير 564 نانومتر و 647 نانومتر لتصوير مضان الغشاء لسمك الزرد المعدل وراثيا MyR-Tdtomato ومضاد الاندوسوم Dld-Atto647N في الخلية (الشكل 1).
   3. اضبط طاقة الليزر على 30٪ لكلتا القناتين. استخدم وقت تعريض لكل مستوى z يبلغ 200 مللي ثانية لكل قناة.
   4. لكل جنين زرد مركب ، استخدم خطوة z للمسح تبلغ 1 ميكرومتر ل 20 طائرة z في المجموع ، ودورة مسح من 100 إطار زمني.
   5. اضبط الفاصل الزمني بين كل دورة مسح ضوئي على 20 ثانية ووضع المسح كقناة ، شريحة.

النتائج

في الشكل 2 أ ، أظهرت الأجنة المحقونة ب Atto647N ، دون الارتباط بالجسم المضاد الأولي ، مضان الخلفية في بطين الدماغ. يمكن ملاحظة عدد قليل جدا من جزيئات الفلورسنت المبتلعة في الخلايا. أظهرت أجنة الزرد المحقونة المضادة ل Dld-Atto647N كميات كبيرة من جزيئات الفلورسنت الداخلية في معظم خلاي?...

Discussion

لقد طورنا مقايسة امتصاص الأجسام المضادة لوضع العلامات والتصوير للاتجار بالشق / دلتا الإندوسومي في أسلاف الدبقية الشعاعية الزرد بكفاءة عالية. مقارنة بالطرق السابقة المستخدمة لتتبع الأجسام المضادة المضادة ل DeltaD في خلايا ذبابة الفاكهة^{SOP 7,8} ، استخدمت طريقتنا ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm glass bottom culture dish	MatTek corporation	P35GC-1.5-10-C
air pressure injector	Narishige	IM300
Anti-Mouse-IgG-Atto647N	Sigma-Aldrich	50185
CaCl2.2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament	World Precision Instruments	1B120F-6
CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield	Nikin	N/A	Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal.
Dumont Medical Tweezers Style 5	Thomas Scientific	72877-D
Flaming-Brown P897 puller	Sutter Instruments	N/A	https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf
KCl	Millipore	529552
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	M2773
micromanipulators	World Precision Instruments	WPI M3301R
Mouse anti-Dld	Abcam	AB_1268496
Mouse IgG blocking buffer from Zenon	Thermofisher Scientific	Z25008
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
Phenol red	Sigma-Aldrich	P0290
Stemi 2000	Zeiss	N/A
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
UltraPureTM low melting point agarose	Invitrogen	16520050