用于追踪斑马鱼径向胶质细胞祖细胞不对称分裂期间缺口/δ内吞作用的抗体摄取测定

摘要

这项工作开发了一种抗体摄取测定法，用于在胚胎斑马鱼大脑的径向胶质细胞祖细胞分裂中成像谱系内Notch/DeltaD信号传导。

摘要

不对称细胞分裂（ACD）产生两个不同命运的子细胞，是产生细胞多样性的基础。在无脊椎动物和脊椎动物的发育器官中，不对称分裂的祖先产生一个Notch^hi 自我更新和一个Notch^lo 差异化的女儿。在胚胎斑马鱼的大脑中，径向神经胶质细胞祖细胞（RGP） - 主要的脊椎动物神经干细胞 - 主要经历ACD以产生一个RGP和一个分化神经元。斑马鱼胚胎的光学清晰度和易于接近性使其成为 体内 延时成像的理想选择，以直接可视化在ACD期间如何以及何时建立Notch信号的不对称性。最近的研究表明，Notch配体DeltaD的动态内吞作用在ACD期间的细胞命运决定中起着至关重要的作用，并且该过程由进化上保守的极性调节剂Par-3（也称为Pard3）和动力蛋白运动复合物调节。为了可视化有丝分裂RGP中Notch信号内体的 体内 运输模式，我们开发了这种抗体摄取测定。使用该测定法，我们揭示了RGP分裂过程中含DeltaD的内体的动力学。

引言

Notch信号控制后生动物1发育过程中的细胞命运决定和模式，最近的研究表明，干细胞分裂中的Notch信号主要取决于内吞运输^2，3。内吞Notch/Delta可以激活细胞核中的Notch信号传导并增强Notch靶基因⁴，^5，6的转录。在果蝇感觉器官前体（SOP）细胞的不对称细胞分裂（ACD）过程中首次观察到定向Notch/Delta内体运输，导致pIIa中的Notch信号传导活性高于pIIb^7，8。抗Delta和抗Notch抗体的抗体摄取测定已被应用于监测有丝分裂SOP细胞的内吞过程。Notch/DeltaD 内体在细胞分裂过程中与驱动蛋白一起移动到中心纺锤体，并且由于细胞分裂^3，8 的最后一刻不对称中心纺锤体的反平行阵列而不对称地易位到 pIIa 细胞中。这些研究揭示了调节果蝇SOP细胞中不对称分裂的分子机制，但尚不清楚脊椎动物径向胶质细胞祖细胞（RGP）中是否发生类似的内吞过程。

此外，在脊椎动物RGP分裂过程中调节不对称Notch/DeltaD信号传导的分子机制尚不清楚。据报道，在斑马鱼中，Notch和Delta的相互作用促进了DeltaD配体⁹的内吞作用。目前尚不清楚DeltaD内吞作用是否会影响发育中的脊椎动物大脑中子细胞的细胞命运选择。最近的研究表明，将荧光偶联的抗DeltaD抗体注射到神经管中可以在神经上皮细胞中特异性标记Sara内体，并且含有Sara内体的抗DeltaD优先分离成增殖的子细胞¹⁰。有人提出，来自内体的Notch信号可以调节子细胞的命运。先前的结果表明，发育中的前脑中的大多数斑马鱼RGP细胞都会经历ACD，子细胞命运的确定取决于谱系内Notch/DeltaD信号传导¹¹。为了阐明斑马鱼RGP中谱系内Notch/DeltaD信号传导的性质，我们开发了斑马鱼发育大脑中的抗DeltaD抗体摄取测定。使用该协议，我们已经成功地对有丝分裂RGP中的DeltaD内吞运输进行了活标记和成像。

荧光标记的抗 DeltaD 抗体沿前脑室有效内化到 RGP 中。它极大地促进了在不对称分裂的RGP中发现DeltaD内体的定向运输^12，13。与以前为果蝇培养物和斑马鱼脊髓 10 开发的抗体摄取方案相比，该方案在脑室细胞层中实现了持久高效的抗 DeltaD 标记，特别是微量注射的抗体混合物少于¹⁰ nL。后脑脑室注射对于在发育中的大脑中应用抗体摄取测定非常方便，因为后脑脑室在斑马鱼胚胎中扩增良好，并在早期发育阶段¹⁴充满脑脊液。通过将抗体混合物注射到后脑心室而不损伤任何关键的发育组织，该方案尽可能减少了对前脑成像区域的可能损害。注射一抗剂量的减少也避免了干扰 体内内源性Delta-Notch信号传导的潜在副作用。该协议可以很容易地与其他药理学或遗传扰动相结合，用于不同的发育阶段，并且可能适用于成人大脑以及人类多能干细胞衍生的2D / 3D脑类器官。综上所述，该协议使得理解在ACD期间如何以及何时建立Notch信号不对称成为可能。成功实施该方案的主要挑战是根据特定的实验条件精确输送适当浓度的抗体。

研究方案

我们使用AB野生型系和转基因株系 Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] 进行研究。所有动物实验均获得美国加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（批准文号:AN179000）。

1. 斑马鱼胚胎的制备

1. 在下午5:00之前设置鱼穿越水箱，使用分隔器将一条雌性野生型鱼和一条雄性Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] 鱼分开。
2. 第二天早上上午 11:00 之前从所有交叉水箱中拆下分隔器。保持安静，不要在鱼交配时打扰它们。产卵通常在移除分隔物后 30 分钟内发生。受精卵留在水箱底部。
   1. 用网状过滤器从水箱中收集受精卵。通过将鸡蛋洗净到装满鸡蛋水的培养皿中来转移卵子，并在解剖显微镜下以10倍至20倍放大倍率检查胚胎。
3. 用大口径玻璃巴斯德移液器将受精胚胎转移到含有约 20 mL 胚胎培养基（100 mL 1，000x 储备溶液含有 29.4 g NaCl、1.27 g KCl、4.85 g CaCl_2.2H 2 O 和 8.13 g MgSO_{4.7H 2}O ）的干净培养皿中。将胚胎保持在28°C。 每个培养皿在28.5°C下用30mL胚胎培养基保持50个受精胚胎。
   注意:一对鱼通常产生100-300个胚胎，每次交配健康胚胎的受精和存活率超过95%。
4. 第二天早上，在上午8:00将胚胎从培养箱中取出，此时胚胎已达到受精后~18-20小时（hpf）的发育阶段。首先使用白光在落射荧光显微镜下以20倍放大倍率观察它们。那时，斑马鱼胚胎处于20体阶段。
   1. 使用玻璃移液管丢弃在显微镜下浑浊或破裂的死胚胎。
5. 打开荧光灯并选择显微镜的RFP滤光片设置。然后，选择具有强烈红色荧光的胚胎，并将它们转移到装有蛋水的新培养皿中。
   1. 在白光下用两个细镊子手动去皮胚胎（镊子的尖端应锋利且未损坏）（材料表）。
   2. 用一对镊子握住绒毛膜，用其他镊子撕裂绒毛膜。用镊子小心地打开撕裂，并用其他镊子的尖端轻轻推动胚胎，使其足够大，使胚胎通过。
6. 将去皮的胚胎转移到带有新鲜胚胎培养基的新培养皿中，以便在显微注射前快速冲洗。

2.显微注射的制备

1. 使用毛细管（外径 1.2 毫米，内径 0.9 毫米，带细丝）在拉拔器上拉动细注射针。根据手册设计和优化拉取程序。
2. 在立体解剖显微镜下用镊子打开针尖。使尖端的直径约为10μm，锥角约为30°。
3. 注射前将小鼠单克隆抗Dld抗体与抗小鼠IgG-Atto647N偶联。
   1. 对于每个进样实验，通过移液5-10次将0.5 μL抗Dld抗体（0.5 mg/mL）与2 μL抗小鼠-IgG-Atto647N抗体（1 mg / mL）混合。然后，在室温下孵育至少30分钟（或在冰上孵育2-3小时）。
   2. 孵育后，向抗体混合物中加入 2.5 μL 封闭缓冲液（10 mg/mL 小鼠 IgG）和 0.5 μL 0.5% 酚红，并移液 10 倍彻底混合，以阻断混合物中残留的任何未偶联抗体。
      注意:对于每个试验，准备一种不含抗Dld抗体的额外混合物，并将其用作对照。
4. 在胚胎培养基中制备1%低熔点琼脂糖。在70°C下加热含有琼脂糖的混合物，直到混合物变成透明。
   1. 将琼脂糖溶液分装在 2 mL 微量离心管中。将等分试样保持在~40°C的加热块中。
5. 在含有1%低熔点琼脂糖的管中冲洗胚胎3秒。
6. 将胚胎与单滴琼脂糖（~30-40μL）一起放在倒置的塑料培养皿盖上，将每个胚胎分别安装在盖子上，如图 1所示。将胚胎横向放置在琼脂糖中并保持该位置，直到琼脂糖在室温下凝固。
7. 如上所述，将12个胚胎一排一排地安装。用蛋培养基覆盖琼脂糖中的所有镶嵌胚胎。

3. 显微注射

1. 将嵌入的胚胎放在体视显微镜下，并用蛋水覆盖琼脂糖。
2. 将气压注射器与显微操纵器放在一起，将它们放置在靠近显微镜的位置，如图 1所示。使用高压下含有气态氮（N₂）的钢制气瓶作为空气资源。
   1. 只有在胚胎安装在琼脂糖中后，才打开气体阀。然后，当使用显微进样器的前填充模块时，将制备好的玻璃针头与2 μL抗体混合物预先加载到显微操纵器上，如图 1所示。
   2. 将输入压力调整为 ~80-90 psi，将注射压力调整为 ~20 psi。
3. 通过在显微镜下使用千分尺校准注射体积，如前^所述15。根据针开口的大小，将调谐持续时间设置为 10 毫秒到 120 毫秒。通过敲击桨叶传递每个注射脉冲。将每次递送的进样体积调整至~4-5 nL。
4. 将显微注射针的尖端穿过后脑的背顶板戳到r0 / r1铰链点，并注射约10nL（两个或三个脉冲）的抗体混合物而不击中脑组织。观察脑室中红色液体的流动。
   注意:后脑心室位于中脑后脑边界的后方。注射的含酚红抗体混合物通过脑脊液扩散，立即将脑室从后脑填充到前脑。
5. 注射后，通过旋转显微操纵器的旋钮迅速从胚胎中取出针尖。为了成功注射，注射混合物的红色染料稳定地保留在脑室中，而不会泄漏到周围的琼脂糖中。
6. 将安装板移动到显微镜下，将另一个安装的胚胎定位在合适的位置进行重复。
   1. 注射六到八个胚胎后，用显微手术刀剥开琼脂糖，将胚胎从嵌入的琼脂糖中释放出来。将显微注射的胚胎转移到装有30mL胚胎培养基的新鲜培养皿中，并将其置于室温下进行下一步。

4. 安装和延时实时成像

1. 30分钟后，将选定的胚胎转移到10mL胚胎培养基中。将 420 μL 三卡因原液 （4 mg/mL） 加入 10 mL 胚胎培养基中以麻醉胚胎。
2. 为了安装胚胎，准备0.8%低熔点琼脂糖，在管中含有相同浓度的三卡因。将等分试样保持在~40°C的加热块中。
3. 使用玻璃移液管将注射的胚胎浸入温热的琼脂糖中3秒。然后，立即用相同的玻璃移液管从琼脂糖中取出胚胎，并将胚胎放在35mm玻璃底培养皿的中心，从管中取出一滴琼脂糖。每滴只将一个胚胎放在玻璃上。
4. 用纤维探针或加载尖端轻轻地定向胚胎，以使胚胎大脑的背侧尽可能靠近玻璃底部。轻轻调整胚胎位置以延长胚胎，而不会卷曲，因为琼脂糖逐渐凝固。
5. 然后，通过将玻璃底培养皿翻转过来检查胚胎位置。确保在显微镜下可以看到具有正确安装胚胎的整个背前脑。
6. 加入2-3mL含有三卡因的28.5°C预热胚胎培养基以覆盖胚胎。将培养皿正确放置在共聚焦显微镜的温度控制载物台上，如图 1所示。将成像室的温度调节为28.5°C。 胚胎现在已准备好进行成像。
7. 使用40倍水浸物镜以固定的时间间隔执行延时实时成像。
   1. 使用成像和显微镜控制软件（μMANAGER: https://micro-manager.org/）¹⁶.
   2. 选择564 nm和647 nm的成像通道，用于对细胞中MyR-Tdtomato转基因斑马鱼和内体抗Dld-Atto647N的膜荧光进行成像（图1）。
   3. 将两个通道的激光功率设置为 30%。每个通道使用每个 z 平面 200 毫秒的曝光时间。
   4. 对于每个安装的斑马鱼胚胎，总共对 20 个 z 平面使用 1 μm 的扫描 z 步长，以及 100 个时间帧的扫描周期。
   5. 将每个扫描周期之间的时间间隔设置为20秒，扫描模式为通道，切片。

结果

在 图2A中，注射Atto647N的胚胎不与一抗结合，在脑室中显示出背景荧光。在细胞中可以观察到很少的吞噬荧光颗粒。注射抗Dld-Atto647N的斑马鱼胚胎在发育中的前脑的大多数细胞中显示出大量内化的荧光颗粒（图2A，右图）。放大以聚焦有丝分裂RGP后，如图 2B所示，我们能够记录细胞内抗Dld-Atto647N内体在细胞分裂过程中的动态运动（...

讨论

我们已经开发了一种抗体摄取测定法，用于高效标记和成像斑马鱼径向胶质细胞祖细胞的内体Notch/Delta运输。与以前用于追踪果蝇SOP细胞⁷，⁸中标记的抗DeltaD抗体的方法相比^，我们的方法使用显微注射而不是在偶联抗体中孵育样品。将荧光偶联的抗DLD抗体显微注射到后脑室;这种技术不会造成伤害，注射后胚胎的正常发育和完全恢复证明了这一点。胚胎脑...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm glass bottom culture dish	MatTek corporation	P35GC-1.5-10-C
air pressure injector	Narishige	IM300
Anti-Mouse-IgG-Atto647N	Sigma-Aldrich	50185
CaCl2.2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament	World Precision Instruments	1B120F-6
CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield	Nikin	N/A	Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal.
Dumont Medical Tweezers Style 5	Thomas Scientific	72877-D
Flaming-Brown P897 puller	Sutter Instruments	N/A	https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf
KCl	Millipore	529552
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	M2773
micromanipulators	World Precision Instruments	WPI M3301R
Mouse anti-Dld	Abcam	AB_1268496
Mouse IgG blocking buffer from Zenon	Thermofisher Scientific	Z25008
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
Phenol red	Sigma-Aldrich	P0290
Stemi 2000	Zeiss	N/A
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
UltraPureTM low melting point agarose	Invitrogen	16520050