Анализ поглощения антител для отслеживания эндоцитоза Notch/Delta во время асимметричного деления предшественников радиальной глии рыбок данио-рерио

Резюме

В этой работе разработан анализ поглощения антител для визуализации внутриродословной передачи сигналов Notch/DeltaD при делении предшественников радиальной глии эмбрионального мозга рыбок данио.

Аннотация

Асимметричное деление клеток (ACD), в результате которого образуются две дочерние клетки с разной судьбой, имеет основополагающее значение для создания клеточного разнообразия. В развивающихся органах как беспозвоночных, так и позвоночных асимметрично делящиеся прародители порождают самообновляющуюся дочь Notch^hi и дифференцирующую дочь Notch^lo . В эмбриональном мозге рыбок данио-рерио предшественники радиальной глии (RGP) - основные нервные стволовые клетки позвоночных - в основном подвергаются ACD, чтобы родить один RGP и один дифференцирующий нейрон. Оптическая прозрачность и легкий доступ к эмбрионам рыбок данио-рерио делают их идеальными для покадровой визуализации in vivo , чтобы непосредственно визуализировать, как и когда устанавливается асимметрия передачи сигналов Notch во время ACD. Недавние исследования показали, что динамический эндоцитоз лиганда Notch DeltaD играет решающую роль в определении судьбы клеток во время ACD, и этот процесс регулируется эволюционно консервативным регулятором полярности Par-3 (также известным как Pard3) и моторным комплексом динеина. Чтобы визуализировать паттерны транспортировки in vivo сигнальных эндосом Notch в митотических RGP, мы разработали этот анализ поглощения антител. С помощью анализа мы обнаружили динамику DeltaD-содержащих эндосом при делении RGP.

Введение

Передача сигналов Notch контролирует решение о судьбе клеток и формирование паттернов во время развития у многоклеточных¹, и недавние исследования показали, что передача сигналов Notch при делении стволовых клеток в основном зависит от эндоцитарного трафика ^2,3. Эндоцитозированные Notch/Delta могут активировать передачу сигналов Notch в ядре и усиливать транскрипцию генов-мишеней Notch ^4,5,6. Направленный эндосомальный трафик Notch/Delta впервые наблюдался в клетках-предшественниках органов чувств (SOP) дрозофилы во время ее асимметричного деления клеток (ACD), что привело к более высокой сигнальной активности Notch в pIIa, чем в pIIb ^7,8. Анализы поглощения антител с антителами анти-Дельта и анти-Notch были применены для мониторинга эндоцитарного процесса в митотических клетках СОП. Эндосомы Notch/DeltaD перемещаются вместе с кинезиновым моторным белком к центральному веретену во время цитокинеза и асимметрично транслоцируются в клетку pIIa из-за антипараллельного массива асимметричного центрального веретена в последний момент деления^{клетки 3,8}. Эти исследования пролили свет на молекулярные механизмы, регулирующие асимметричное деление в клетках SOP дрозофилы, но неясно, происходят ли подобные эндоцитарные процессы у предшественников радиальной глии позвоночных (RGP).

Более того, молекулярные механизмы, которые регулируют асимметричную передачу сигналов Notch/DeltaD во время деления RGP позвоночных, недостаточно изучены. Сообщалось, что у рыбок данио-рерио взаимодействие Notch и Delta способствует эндоцитозу лиганда^{DeltaD 9}. Неизвестно, может ли эндоцитоз DeltaD влиять на выбор дочерних клеток в развивающемся мозге позвоночных. Недавние исследования показывают, что инъекция флуоресцентно конъюгированных антител против DeltaD в нервную трубку может маркировать эндосомы Sara специфически в нейроэпителиальных клетках, а эндосомы, содержащие анти-DeltaD, предпочтительно разделяются на пролиферирующие дочерние клетки¹⁰. Было высказано предположение, что передача сигналов Notch от эндосом может регулировать судьбу дочерних клеток. Предыдущие результаты показали, что большинство RGP-клеток рыбок данио-рерио в развивающемся переднем мозге подвергаются ACD, а определение судьбы дочерних клеток зависит от внутриродословной передачи сигналов Notch/DeltaD¹¹. Чтобы выяснить природу внутрилинии передачи сигналов Notch/DeltaD в RGP рыбок данио, мы разработали анализ поглощения антител против DeltaD в развивающемся мозге рыбок данио. Используя этот протокол, мы успешно выполнили живую маркировку и визуализацию эндоцитарного трафика DeltaD в митотических RGP.

Флуоресцентно меченное анти-DeltaD-антитело эффективно интернализуется в RGP вдоль желудочка переднего мозга. Это значительно облегчило обнаружение направленного трафика эндосом DeltaD в асимметрично делящихся RGPs^12,13. По сравнению с предыдущими протоколами поглощения антител, разработанными для культур Drosophila notum и спинного мозга^{рыбок данио-рерио} 10, этот протокол обеспечил длительную и высокоэффективную маркировку анти-DeltaD в клеточном слое желудочка головного мозга, в частности, с менее чем 10 нл смеси микроинъекционных антител. Инъекция в задний желудочек головного мозга очень удобна для применения анализа поглощения антител в развивающемся мозге, так как желудочек заднего мозга хорошо расширен у эмбрионов рыбок данио-рерио и заполнен спинномозговой жидкостью на ранней стадии^{развития 14}. Вводя смесь антител в желудочек заднего мозга, не повреждая какие-либо важные развивающиеся ткани, протокол максимально минимизировал возможное повреждение зоны визуализации в переднем мозге. Уменьшенная доза вводимого первичного антитела также позволила избежать потенциальных побочных эффектов вмешательства в эндогенную передачу сигналов Delta-Notch in vivo. Этот протокол можно легко комбинировать с другими фармакологическими или генетическими возмущениями, использовать на разных стадиях развития и, возможно, адаптировать к взрослому мозгу, а также к 2D/3D органоидам мозга, полученным из плюрипотентных стволовых клеток человека. В совокупности протокол позволил понять, как и когда устанавливается асимметрия сигнализации Notch во время ACD. Основной задачей для успешной реализации этого протокола является достижение точной доставки соответствующих концентраций антитела на основе конкретных экспериментальных условий.

протокол

Для исследования мы использовали линию дикого типа AB и трансгенную линию Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] . Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Калифорнийском университете в Сан-Франциско, США (номер утверждения: AN179000).

1. Подготовка эмбрионов рыбок данио-рерио

1. Установите аквариумы для переправы рыбы во второй половине дня до 17:00 с одной самкой дикой рыбы и одной самцом рыбы Tg [ef1a: Myr-Tdtomato] , используя разделители для их разделения в каждом аквариуме.
2. Снимите разделители до 11:00 утра со всех переправочных цистерн на следующее утро. Соблюдайте тишину и не тревожьте рыб во время спаривания. Нерест обычно происходит в течение 30 минут после удаления разделителей. Оплодотворенные яйца остаются на дне емкости.
   1. Собирают оплодотворенные яйца из емкостей с помощью сетчатого фильтра. Перенесите яйца, смыв их, в чашку Петри, полную яичной воды, и исследуйте эмбрионы под препарирующим микроскопом с 10-20-кратным увеличением.
3. Перенесите оплодотворенные эмбрионы в чистую чашку Петри, содержащую приблизительно 20 мл эмбриональной среды (100 мл 1000-кратного исходного раствора содержит 29,4 г NaCl, 1,27 г KCl, 4,85 г CaCl 2,2H 2 O и 8,13 г MgSO_{4,7H 2} O) с помощью стеклянных пипеток Пастера большого диаметра. Храните эмбрионы при температуре 28 °C. Храните 50 оплодотворенных эмбрионов в чашке Петри с 30 мл эмбриональной среды при температуре 28,5 ° C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Одна пара рыб обычно производит 100-300 эмбрионов, а оплодотворение и выживаемость здоровых эмбрионов составляет более 95% для каждого спаривания.
4. На следующее утро выньте эмбрионы из инкубатора в 8:00 утра, когда эмбрионы достигнут стадии развития ~ 18-20 часов после оплодотворения (HPF). Наблюдайте их под эпифлуоресцентным микроскопом при 20-кратном увеличении, сначала используя белый свет. В это время эмбрионы рыбок данио-рерио находятся на стадии 20 сомитов.
   1. Откажитесь от мертвых эмбрионов, которые помутнели или разорвались под микроскопом, используя стеклянную пипетку.
5. Включите люминесцентную лампу и выберите настройку фильтра RFP микроскопа. Затем выберите эмбрионы с сильной красной флуоресценцией и перенесите их в новую посуду с яичной водой.
   1. Дехорионируйте эмбрионы вручную с помощью двух тонких щипцов (кончики щипцов должны быть острыми и неповрежденными) под белым светом (Таблица материалов).
   2. Зажмите хорион одной парой щипцов и сделайте разрыв хориона другими щипцами. Осторожно откройте слезу с помощью щипцов и сделайте ее достаточно большой, чтобы эмбрион мог пройти, осторожно толкая эмбрион кончиками других щипцов.
6. Перенесите дехорионированные эмбрионы в новую чашку Петри со свежей эмбриональной средой для быстрого промывания перед микроинъекцией.

2. Приготовление микроинъекций

1. Используйте капилляры (наружный диаметр 1,2 мм, внутренний диаметр 0,9 мм, с нитью) для вытягивания тонких инъекционных игл на съемнике. Разработайте и оптимизируйте программу вытягивания в соответствии с руководством.
2. Откройте кончик иглы щипцами под стереодиссекционным микроскопом. Диаметр наконечника составляет около 10 мкм, а угол конусности - около 30°.
3. Конъюгируйте мышиное моноклональное антитело против Dld с анти-мышиным IgG-Atto647N перед инъекцией.
   1. Для каждого инъекционного эксперимента смешайте 0,5 мкл антитела против Dld (0,5 мг / мл) с 2 мкл антитела против мыши-IgG-Atto647N (1 мг / мл) путем пипетки 5-10 раз. Затем инкубировать при комнатной температуре не менее 30 мин (или на льду 2-3 ч).
   2. После инкубации добавьте 2,5 мкл блокирующего буфера (10 мг / мл мышиного IgG) и 0,5 мкл 0,5% фенольного красного в смесь антител и пипетку 10x для тщательного перемешивания, чтобы заблокировать любые неконъюгированные антитела, оставшиеся в смеси.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого испытания готовьте одну дополнительную смесь без антител против Dld и используйте ее в качестве контроля.
4. Приготовьте 1% агарозу с низкой температурой плавления в зародышевой среде. Нагрейте смесь, содержащую агарозу, до 70 ° C, пока смесь не станет прозрачной.
   1. Аликвотируйте раствор агарозы в микроцентрифужных пробирках по 2 мл. Храните аликвоты в тепловом блоке при температуре ~40 °C.
5. Промойте зародыш в пробирке, содержащей 1% агарозы с низкой температурой плавления в течение 3 с.
6. Поместите эмбрион на перевернутую пластиковую крышку чашки Петри вместе с отдельными каплями агарозы (~ 30-40 мкл), чтобы закрепить каждый эмбрион отдельно на крышке, как показано на рисунке 1. Положите зародыши плашмя сбоку в агарозу и удерживайте это положение до тех пор, пока агароза не затвердеет при комнатной температуре.
7. Смонтируйте 12 эмбрионов в три ряда один за другим, как указано выше. Покройте все смонтированные в агарозе зародыши яичной средой.

3. Микроинъекция

1. Поместите внедренные эмбрионы под стереомикроскоп и залейте агарозу яичной водой.
2. Установите инжектор давления воздуха вместе с микроманипуляторами, расположив их рядом с микроскопами, как показано на рисунке 1. В качестве воздушного ресурса используйте стальной газовый баллон, содержащий газообразный азот (N₂) под высоким давлением.
   1. Открывайте газовый кран только после того, как эмбрионы были вставлены в агарозу. Затем при использовании модуля переднего заполнения микроинжектора подготовленную стеклянную иглу 2 мкл смеси антител на микроманипулятор, как показано на рисунке 1.
   2. Отрегулируйте входное давление на ~80-90 фунтов на квадратный дюйм, а давление впрыска на ~ 20 фунтов на квадратный дюйм.
3. Откалибруйте объем инъекции с помощью микрометра под микроскопом, как описано ранее¹⁵. Установите продолжительность настройки от 10 мс до 120 мс в зависимости от размера отверстия иглы. Доставляйте каждый импульс инъекции, постукивая по веслу. Настройте объем впрыска каждой подачи на ~ 4-5 нл.
4. Проткните кончик иглы для микроинъекций через дорсальную пластину крыши заднего мозга сзади к точке шарнира r0 / r1 и введите около 10 нл (два или три импульса) смеси антител, не затрагивая ткань мозга. Наблюдайте за потоком красных жидкостей в желудочке головного мозга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Задний желудочек мозга находится позади границы заднего мозга среднего мозга. Введенная смесь антител, содержащая феноловый красный, немедленно заполняет желудочек головного мозга от заднего мозга к переднему мозгу, диффундируя со спинномозговой жидкостью.
5. После инъекции быстро извлеките кончик иглы из эмбриона, вращая ручку микроманипулятора. Для успешной инъекции красный краситель вводимой смеси стабильно остается в желудочке мозга, не просачиваясь в окружающую агарозу.
6. Переместите монтажную пластину под микроскопом, чтобы найти другой смонтированный эмбрион в подходящем положении для повторов.
   1. После инъекции от шести до восьми эмбрионов очистите агарозу микрохирургическим ножом, чтобы освободить эмбрионы от встроенной агарозы. Перенесите микроинъекционные эмбрионы в свежую посуду с 30 мл эмбриональной среды и поместите их при комнатной температуре для следующих шагов.

4. Монтаж и покадровая съемка в реальном времени

1. Через 30 минут переносят отобранные эмбрионы в 10 мл эмбриональной среды. Добавьте 420 мкл трикаина (4 мг / мл) к 10 мл эмбриональной среды для анестезии эмбрионов.
2. Чтобы смонтировать эмбрионы, приготовьте 0,8% агарозу с низкой температурой плавления, содержащую такую же концентрацию трикаина в пробирке. Храните аликвоты в тепловом блоке при температуре ~40 °C.
3. С помощью стеклянной пипетки погрузите введенные эмбрионы в теплую агарозу на 3 с. Затем немедленно извлеките эмбрионы из агарозы той же стеклянной пипеткой и поместите эмбрионы в центр 35-миллиметровой стеклянной нижней посуды для культуры с каплей агарозы из трубки. Поместите на стекло только один эмбрион на каплю.
4. Осторожно ориентируйте эмбрионы с помощью волоконного зонда или наконечника, чтобы дорсальная сторона эмбрионального мозга находилась как можно ближе к стеклянному дну. Осторожно отрегулируйте положение эмбриона, чтобы удлинить эмбрион, не скручиваясь, по мере постепенного затвердевания агарозы.
5. После этого проверьте положение эмбриона, перевернув тарелку со стеклянным дном. Убедитесь, что весь дорсальный передний мозг с правильно установленными эмбрионами можно увидеть под микроскопом.
6. Добавьте 2-3 мл предварительно нагретой эмбриональной среды с температурой 28,5 °C, содержащей трикаин, чтобы покрыть эмбрион. Правильно поместите чашку на столик конфокального микроскопа с регулируемой температурой, как показано на рисунке 1. Отрегулируйте температуру камеры визуализации на уровне 28,5 °C. Теперь эмбрион готов к визуализации.
7. Выполняйте покадровую съемку в реальном времени с фиксированным интервалом времени с помощью объектива с 40-кратным погружением в воду.
   1. Используйте программное обеспечение для обработки изображений и управления микроскопом (μMANAGER: https://micro-manager.org/)¹⁶.
   2. Выберите каналы визуализации 564 нм и 647 нм для визуализации мембранной флуоресценции трансгенных рыбок данио-рерио MyR-Tdtomato и эндосомального анти-Dld-Atto647N в клетке (рис. 1).
   3. Установите мощность лазера на 30% для обоих каналов. Используйте время экспозиции на z-плоскость 200 мс для каждого канала.
   4. Для каждого эмбриона рыбок данио-рерио используйте z-шаг сканирования 1 мкм для 20 z-плоскостей в общей сложности и цикл сканирования из 100 таймфреймов.
   5. Установите временной интервал между каждым циклом сканирования на уровне 20 с и режим сканирования как канал, срез.

Результаты

На рисунке 2А эмбрионы, которым вводили Atto647N, без связывания с первичным антителом, показали фоновую флуоресценцию в желудочке мозга. В клетках можно наблюдать очень мало поглощенных флуоресцентных частиц. Эмбрионы рыбок данио, введенные против Dld-Atto647N, показали большое...

Обсуждение

Мы разработали анализ поглощения антител для маркировки и визуализации эндосомального трафика Notch/Delta у предшественников радиальной глии рыбок данио-рерио с высокой эффективностью. По сравнению с предыдущими методами, используемыми для отслеживания меченых антител против DeltaD в клетк...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm glass bottom culture dish	MatTek corporation	P35GC-1.5-10-C
air pressure injector	Narishige	IM300
Anti-Mouse-IgG-Atto647N	Sigma-Aldrich	50185
CaCl2.2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament	World Precision Instruments	1B120F-6
CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield	Nikin	N/A	Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal.
Dumont Medical Tweezers Style 5	Thomas Scientific	72877-D
Flaming-Brown P897 puller	Sutter Instruments	N/A	https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf
KCl	Millipore	529552
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	M2773
micromanipulators	World Precision Instruments	WPI M3301R
Mouse anti-Dld	Abcam	AB_1268496
Mouse IgG blocking buffer from Zenon	Thermofisher Scientific	Z25008
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
Phenol red	Sigma-Aldrich	P0290
Stemi 2000	Zeiss	N/A
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
UltraPureTM low melting point agarose	Invitrogen	16520050