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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este trabajo desarrolla un ensayo de captación de anticuerpos para obtener imágenes de la señalización de Notch / DeltaD intra-linaje en la división de progenitores de glía radial del cerebro embrionario del pez cebra.

Resumen

La división celular asimétrica (ACD), que produce dos células hijas de diferentes destinos, es fundamental para generar diversidad celular. En los órganos en desarrollo tanto de invertebrados como de vertebrados, la división asimétrica de progenitores genera una Notchhi auto-renovadora y una hija Notchlo diferenciadora. En el cerebro embrionario del pez cebra, los progenitores de la glía radial (RGP), las principales células madre neurales de vertebrados, se someten principalmente a ACD para dar a luz a un RGP y una neurona diferenciadora. La claridad óptica y la fácil accesibilidad de los embriones de pez cebra los hacen ideales para obtener imágenes de lapso de tiempo in vivo para visualizar directamente cómo y cuándo se establece la asimetría de la señalización Notch durante ACD. Estudios recientes han demostrado que la endocitosis dinámica del ligando Notch DeltaD juega un papel crucial en la determinación del destino celular durante la ACD, y el proceso está regulado por el regulador de polaridad conservado evolutivamente Par-3 (también conocido como Pard3) y el complejo motor de dineína. Para visualizar los patrones de tráfico in vivo de los endosomas de señalización de Notch en los RGP mitóticos, hemos desarrollado este ensayo de captación de anticuerpos. Usando el ensayo, hemos descubierto el dinamismo de los endosomas que contienen DeltaD durante la división RGP.

Introducción

La señalización de Notch controla la decisión y el patrón del destino celular durante el desarrollo en metazoos1, y estudios recientes han demostrado que la señalización de Notch en la división de células madre depende principalmente del tráfico endocítico 2,3. Endocytosed Notch/Delta puede activar la señalización de Notch en el núcleo y mejorar la transcripción de los genes diana de Notch 4,5,6. El tráfico endosomal direccional Notch/Delta se observó por primera vez en células precursoras de órganos sensoriales (SOP) de Drosophila durante su división celular asimétrica (ACD), lo que resultó en una mayor actividad de señalización de Notch en pIIa que en pIIb 7,8. Se han aplicado ensayos de captación de anticuerpos con anticuerpos anti-Delta y anti-Notch para monitorizar el proceso endocítico en células POE mitóticas. Los endosomas Notch/DeltaD se mueven junto con una proteína motora de quinesina al huso central durante la citocinesis, y se translocan asimétricamente en la célula pIIa debido a la matriz antiparalela del huso central asimétrico en el último momento de la división celular 3,8. Estos estudios han arrojado luz sobre los mecanismos moleculares que regulan la división asimétrica en las células SOP de Drosophila, pero no está claro si ocurren procesos endocíticos similares en progenitores de glía radial de vertebrados (RGP).

Además, los mecanismos moleculares que regulan la señalización asimétrica de Notch/DeltaD durante la división RGP de vertebrados no se conocen bien. En el pez cebra, se ha descrito que la interacción de Notch y Delta facilita la endocitosis del ligando DeltaD9. Se desconoce si la endocitosis DeltaD puede afectar la elección del destino celular de las células hijas en el cerebro de los vertebrados en desarrollo. Estudios recientes muestran que la inyección de anticuerpos anti-DeltaD conjugados fluorescentes en el tubo neural podría marcar los endosomas Sara específicamente en las células neuroepiteliales, y los endosomas Sara que contienen anti-DeltaD se segregan preferentemente en células hijas proliferantes10. Se ha sugerido que la señalización de Notch de los endosomas podría regular el destino de las células hijas. Resultados anteriores han demostrado que la mayoría de las células RGP de pez cebra en el cerebro anterior en desarrollo experimentan ACD, y la determinación del destino de las células hijas depende de la señalización intralinaje Notch / DeltaD11. Con el fin de dilucidar la naturaleza de la señalización intralinaje Notch / DeltaD en RGP de pez cebra, hemos desarrollado el ensayo de captación de anticuerpos anti-DeltaD en el cerebro en desarrollo del pez cebra. Usando este protocolo, hemos realizado con éxito el etiquetado en vivo y las imágenes del tráfico endocítico DeltaD en RGP mitóticos.

El anticuerpo anti-DeltaD marcado con fluorescencia se internaliza eficientemente en los RGP a lo largo del ventrículo del cerebro anterior. Ha facilitado enormemente el descubrimiento del tráfico direccional de endosomas DeltaD en los RGPs de división asimétrica12,13. En comparación con los protocolos anteriores de captación de anticuerpos desarrollados para cultivos de Drosophila notum y la médula espinal del pez cebra 10, este protocolo ha logrado un marcado anti-DeltaD duradero y altamente eficiente en la capa de células del ventrículo cerebral, específicamente con menos de10 nL de mezcla de anticuerpos microinyectados. La inyección del ventrículo del cerebro posterior es muy conveniente para aplicar el ensayo de captación de anticuerpos en el cerebro en desarrollo, ya que el ventrículo del cerebro posterior está bien expandido en embriones de pez cebra y lleno de líquido cefalorraquídeo en la etapa temprana de desarrollo14. Al inyectar la mezcla de anticuerpos en el ventrículo del cerebro posterior sin dañar ningún tejido en desarrollo crucial, el protocolo ha minimizado el posible daño a la zona de imágenes en el cerebro anterior tanto como sea posible. La dosis reducida del anticuerpo primario inyectado también ha evitado los posibles efectos secundarios de interferir con la señalización endógena de Delta-Notch in vivo. Este protocolo puede combinarse fácilmente con otras perturbaciones farmacológicas o genéticas, utilizarse en diferentes etapas de desarrollo y posiblemente adaptarse al cerebro adulto, así como a los organoides cerebrales 2D / 3D derivados de células madre pluripotentes humanas. En conjunto, el protocolo ha permitido comprender cómo y cuándo se establece la asimetría de señalización Notch durante ACD. El principal desafío para la implementación exitosa de este protocolo es lograr la entrega precisa de concentraciones apropiadas del anticuerpo basadas en condiciones experimentales específicas.

Protocolo

Hemos utilizado la línea de tipo salvaje AB y la línea transgénica Tg [ef1a: Myr-Tdtomato] para el estudio. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California, San Francisco, EE.UU. (Número de aprobación: AN179000).

1. Preparación de embriones de pez cebra

  1. Instale tanques de cruce de peces por la tarde antes de las 5:00 p.m., con un pez hembra de tipo salvaje y un pez macho Tg [ef1a: Myr-Tdtomato] usando divisores para separarlos en cada tanque.
  2. Retire los divisores antes de las 11:00 a.m. de todos los tanques de cruce a la mañana siguiente. Manténgase callado y no moleste a los peces mientras se aparean. El desove generalmente ocurre dentro de los 30 minutos después de eliminar los divisores. Los huevos fertilizados permanecen en el fondo del tanque.
    1. Recoja los huevos fertilizados de los tanques con un filtro de malla. Transfiera los huevos lavándolos en una placa de Petri llena de agua de huevo y examine los embriones bajo un microscopio de disección con un aumento de 10x a 20x.
  3. Transfiera los embriones fertilizados a una placa de Petri limpia que contenga aproximadamente 20 ml de medio embrionario (100 ml de solución madre 1,000x contiene 29.4 g de NaCl, 1.27 g de KCl, 4.85 g de CaCl 2.2H 2 O y 8.13 g de MgSO4.7H 2O) con pipetas Pasteur de vidriode gran calibre. Mantener los embriones a 28 °C. Mantener 50 embriones fertilizados por placa de Petri con 30 mL de medio embrionario a 28.5 °C.
    NOTA: Un par de peces normalmente produce 100-300 embriones, y la tasa de fertilización y supervivencia de embriones sanos es superior al 95% para cada apareamiento.
  4. A la mañana siguiente, saque los embriones de la incubadora a las 8:00 a.m., cuando los embriones hayan alcanzado la etapa de desarrollo de ~ 18-20 h después de la fertilización (hpf). Obsérvelos bajo un microscopio de epifluorescencia con un aumento de 20x, usando luz blanca al principio. En ese momento, los embriones de pez cebra están en la etapa de somita 20.
    1. Deseche los embriones muertos que estén turbios o rotos bajo el microscopio usando una pipeta de vidrio.
  5. Encienda la lámpara fluorescente y elija la configuración del filtro RFP del microscopio. Luego, seleccione los embriones con fluorescencia roja fuerte y transfiéralos a un nuevo plato con agua de huevo.
    1. Decorionar los embriones manualmente con dos pinzas finas (las puntas de las pinzas deben ser afiladas y no dañadas) bajo luz blanca (Tabla de materiales).
    2. Sostenga el corion con un par de fórceps y haga un desgarro en el corion con los otros fórceps. Abra el desgarro con cuidado usando los fórceps y hágalo lo suficientemente grande para que el embrión pase empujando suavemente el embrión con las puntas de los otros fórceps.
  6. Transfiera los embriones descorionados a una nueva placa de Petri con medio embrionario fresco para un enjuague rápido antes de la microinyección.

2. Preparación de la microinyección

  1. Utilice los capilares (1,2 mm OD, 0,9 mm ID, con filamento) para tirar de agujas finas de inyección en un extractor. Diseñar y optimizar el programa de extracción de acuerdo con el manual.
  2. Abra la punta de la aguja con fórceps bajo un microscopio de disección estéreo. Haga que el diámetro de la punta sea de alrededor de 10 μm y el ángulo cónico de alrededor de 30 °.
  3. Conjugar el anticuerpo monoclonal anti-Dld de ratón con el anti-Mouse-IgG-Atto647N antes de la inyección.
    1. Para cada experimento de inyección, mezclar 0,5 μL del anticuerpo anti-Dld (0,5 mg/ml) con 2 μL del anticuerpo anti-Mouse-IgG-Atto647N (1 mg/ml) pipeteando 5-10 veces. Luego, incubar a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos (o en hielo durante 2-3 h).
    2. Después de la incubación, añadir 2,5 μL de tampón de bloqueo (10 mg/ml de IgG de ratón) y 0,5 μL de rojo de fenol al 0,5% a la mezcla de anticuerpos, y pipetear 10 veces para mezclar bien, para bloquear cualquier anticuerpo no conjugado que quede en la mezcla.
      NOTA: Para cada ensayo, prepare una mezcla adicional sin el anticuerpo anti-Dld y úsela como control.
  4. Prepare agarosa de bajo punto de fusión al 1% en el medio embrionario. Calentar la mezcla contenida en agarosa a 70 °C hasta que la mezcla se vuelva transparente.
    1. Alícuota de la solución de agarosa en tubos de microcentrífuga de 2 ml. Mantener las alícuotas en un bloque de calor a ~40 °C.
  5. Enjuague el embrión en el tubo que contiene un 1% de agarosa de bajo punto de fusión durante 3 s.
  6. Coloque el embrión en una tapa de placa de Petri de plástico invertida junto con gotas individuales de agarosa (~ 30-40 μL) para montar cada embrión por separado en la tapa como se muestra en la Figura 1. Coloque los embriones planos lateralmente en la agarosa y mantenga esta posición hasta que la agarosa se haya solidificado a temperatura ambiente.
  7. Monte 12 embriones en tres filas una por una como arriba. Cubra todos los embriones montados en la agarosa con medio de huevo.

3. Microinyección

  1. Coloque los embriones incrustados bajo el microscopio estereoscópico y cubra la agarosa con agua de huevo.
  2. Coloque el inyector de presión de aire junto con los micromanipuladores, colocándolos cerca de los microscopios como se muestra en la Figura 1. Utilice el cilindro de gas de acero que contiene nitrógeno gaseoso (N2) a alta presión como recurso de aire.
    1. Abra la válvula de gas solo después de que los embriones se hayan montado en la agarosa. Luego, cargue frontalmente la aguja de vidrio preparada con 2 μL de mezcla de anticuerpos en el micromanipulador, como se muestra en la Figura 1, cuando use el módulo de llenado frontal del microinyector.
    2. Sintoniza la presión de entrada a ~80-90 psi y la presión de inyección a ~20 psi.
  3. Calibre el volumen de inyección usando un micrómetro bajo el microscopio, como se describió anteriormente15. Establezca la duración del tiempo de sintonía para que sea de 10 ms a 120 ms, de acuerdo con el tamaño de la apertura de la aguja. Administre cada pulso de inyección golpeando la paleta. Sintonice el volumen de inyección de cada administración a ~4-5 nL.
  4. Introduzca la punta de la aguja de microinyección a través de la placa dorsal del techo del cerebro posterior al punto de bisagra r0/r1 e inyecte aproximadamente 10 nL (dos o tres pulsos) de mezcla de anticuerpos sin golpear el tejido cerebral. Observe el flujo de fluidos rojos en el ventrículo cerebral.
    NOTA: El ventrículo del cerebro posterior es posterior al límite del cerebro posterior del mesencéfalo. La mezcla de anticuerpos inyectados que contienen rojo de fenol llena el ventrículo cerebral desde el cerebro posterior hasta el cerebro anterior inmediatamente al difundirse con líquido cefalorraquídeo.
  5. Después de la inyección, retire la punta de la aguja del embrión rápidamente girando la perilla del micromanipulador. Para una inyección exitosa, el tinte rojo de la mezcla inyectada permanece en el ventrículo cerebral de manera estable sin filtrarse en la agarosa circundante.
  6. Mueva la placa de montaje bajo el microscopio para localizar otro embrión montado en una posición adecuada para repeticiones.
    1. Después de inyectar de seis a ocho embriones, pelar la agarosa con un cuchillo microquirúrgico para liberar los embriones de la agarosa incrustada. Transfiera los embriones microinyectados a un plato fresco con 30 ml de medio embrionario y colóquelos a temperatura ambiente para los próximos pasos.

4. Montaje e imágenes en vivo de lapso de tiempo

  1. Después de 30 min, transfiera los embriones seleccionados a 10 ml de medio embrionario. Agregue 420 μL de stock de tricaína (4 mg / ml) a 10 ml de medio embrionario para anestesiar los embriones.
  2. Para montar los embriones, prepare agarosa de bajo punto de fusión al 0,8% que contenga la misma concentración de tricaína en el tubo. Mantener las alícuotas en un bloque de calor a ~40 °C.
  3. Utilice una pipeta de vidrio para sumergir los embriones inyectados en la agarosa caliente durante 3 s. Luego, retire inmediatamente los embriones de la agarosa con la misma pipeta de vidrio y coloque los embriones en el centro de los platos de cultivo de fondo de vidrio de 35 mm con una gota de agarosa del tubo. Coloque solo un embrión por gota en el vidrio.
  4. Oriente los embriones suavemente con una sonda de fibra o punta de carga para mantener el lado dorsal del cerebro embrionario lo más cerca posible del fondo de vidrio. Ajuste la posición del embrión suavemente para extender el embrión sin curvarse a medida que la agarosa se solidifica gradualmente.
  5. Después, verifique la posición del embrión volteando el plato con fondo de vidrio. Asegúrese de que todo el prosencéfalo dorsal con los embriones montados correctamente se pueda ver bajo el microscopio.
  6. Añadir 2-3 ml de medio embrionario precalentado a 28,5 °C que contenga tricaína para cubrir el embrión. Coloque el plato correctamente en la etapa de temperatura controlada del microscopio confocal, como se muestra en la Figura 1. Ajuste la temperatura de la cámara de imágenes para que esté a 28,5 °C. El embrión ahora está listo para la obtención de imágenes.
  7. Realice imágenes en vivo de lapso de tiempo con un intervalo de tiempo fijo utilizando un objetivo de inmersión en agua 40x.
    1. Utilice el software de control de imágenes y microscopios (μMANAGER: https://micro-manager.org/)16.
    2. Seleccione los canales de imagen de 564 nm y 647 nm para obtener imágenes de la fluorescencia de membrana del pez cebra transgénico MyR-Tdtomato y el anti-Dld-Atto647N endosomal en la célula (Figura 1).
    3. Ajuste la potencia del láser al 30% para ambos canales. Utilice un tiempo de exposición por plano z de 200 ms para cada canal.
    4. Para cada embrión de pez cebra montado, use un paso z de escaneo de 1 μm para 20 planos z en total, y un ciclo de escaneo de 100 marcos de tiempo.
    5. Establezca el intervalo de tiempo entre cada ciclo de escaneo en 20 s y el modo de escaneo como canal, segmento.

Resultados

En la Figura 2A, los embriones inyectados con Atto647N, sin unirse con el anticuerpo primario, mostraron fluorescencia de fondo en el ventrículo cerebral. Se pueden observar muy pocas partículas fluorescentes engullidas en las células. Los embriones de pez cebra inyectados anti-Dld-Atto647N mostraron grandes cantidades de partículas fluorescentes internalizadas en la mayoría de las células del cerebro anterior en desarrollo (Figura 2A, panel derecho). Desp...

Discusión

Hemos desarrollado un ensayo de captación de anticuerpos para el etiquetado y la obtención de imágenes del tráfico endosomal de Notch/Delta en progenitores radiales de la glía del pez cebra con alta eficiencia. En comparación con los métodos anteriores utilizados para rastrear anticuerpos anti-DeltaD marcados en células SOP de Drosophila 7,8, nuestro método utilizó microinyección en lugar de incubaciónde muestras en el anticuerpo conjugado. Se microin...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El proyecto fue apoyado por NIH R01NS120218, el Premio Mary Anne Koda-Kimble Seed a la Innovación de la UCSF y Chan Zuckerberg Biohub.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
35mm glass bottom culture dish MatTek corporationP35GC-1.5-10-C
air pressure injector NarishigeIM300
Anti-Mouse-IgG-Atto647N Sigma-Aldrich50185
CaCl2.2H2Sigma-AldrichC3306
Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filamentWorld Precision Instruments1B120F-6
CSU-W1 Spinning Disk/High Speed WidefieldNikinN/ANikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. 
Dumont Medical Tweezers Style 5Thomas Scientific72877-D
Flaming-Brown P897 pullerSutter InstrumentsN/Ahttps://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf
KClMillipore529552
MgSO4.7H2OSigma-AldrichM2773
micromanipulatorsWorld Precision InstrumentsWPI M3301R
Mouse anti-Dld AbcamAB_1268496
Mouse IgG blocking buffer from ZenonThermofisher ScientificZ25008
NaClSigma-AldrichS3014
Phenol redSigma-AldrichP0290
Stemi 2000  Zeiss N/A
TricaineSigma-AldrichE10521
UltraPureTM low melting point agarose Invitrogen16520050

Referencias

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  3. Daeden, A., Gonzalez-Gaitan, M. Endosomal trafficking during mitosis and notch-dependent asymmetric division. Progress in Molecular and Subcellular Biology. 57, 301-329 (2018).
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  13. Zhao, X., Garcia, J., Royer, L. A., Guo, S. Colocalization analysis for cryosectioned and immunostained tissue samples with or without label retention expansion microscopy (LR-ExM) by JACoP. Bio-Protocol. 12 (5), 4336 (2022).
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