ゼブラフィッシュ放射状グリア前駆細胞の非対称分裂におけるNotch/Δエンドサイトーシスを追跡するための抗体取り込みアッセイ

要約

この研究では、ゼブラフィッシュの胚性脳の放射状グリア前駆細胞を分裂させる系統内Notch/DeltaDシグナル伝達をイメージングするための抗体取り込みアッセイを開発しています。

要約

運命の異なる2つの娘細胞を生成する非対称細胞分裂(ACD)は、細胞の多様性を生み出すための基本です。無脊椎動物と脊椎動物の両方の発達中の器官では、前駆細胞を非対称に分割すると、自己再生するNotchとNotch^lo分化する娘が生成されます。ゼブラフィッシュの脳では、脊椎動物の主要な神経幹細胞である放射状グリア前駆細胞(RGP)が主にACDを受けて、1つのRGPニューロンと1つの分化ニューロンを産生します。ゼブラフィッシュ胚の光学的明瞭さと容易なアクセス性により、ACD中にNotchシグナル伝達の非対称性がいつどのように確立されるかを直接視覚化するためのin vivoタイムラプスイメージングに最適です。最近の研究では、NotchリガンドΔDの動的エンドサイトーシスがACD中の細胞運命決定に重要な役割を果たし、その過程は進化的に保存された極性調節因子Par-3(Pard3としても知られる)とダイニンモーター複合体によって制御されることが示されています。有糸分裂RGPにおけるNotchシグナル伝達エンドソームのin vivo輸送パターンを視覚化するために、この抗体取り込みアッセイを開発しました。このアッセイを用いて、RGP分裂中のDeltaD含有エンドソームの動態を明らかにしました。

概要

Notchシグナル伝達は、後生動物の発生中の細胞運命の決定とパターン形成を制御し^ており1、最近の研究では、幹細胞分裂におけるNotchシグナル伝達は主にエンドサイトーシス輸送に依存していることが示されています^2,3。エンドサイトーシスNotch/Deltaは、核内のNotchシグナル伝達を活性化し、Notch標的遺伝子の転写を増強することができます^4,5,6。指向性Notch/Δエンドソーム輸送は、ショウジョウバエ感覚器官前駆体(SOP)細胞の非対称細胞分裂(ACD)中に最初に観察され、pIIbよりもpIIaで高いNotchシグナル伝達活性をもたらしました^7,8。抗デルタ抗体および抗Notch抗体を用いた抗体取り込みアッセイは、有糸分裂SOP細胞のエンドサイトーシスプロセスをモニターするために適用されています。Notch/DeltaDエンドソームは、細胞質分裂中にキネシンモータータンパク質とともに中央紡錘体に移動し、細胞分裂の最後の瞬間に非対称中央紡錘体の逆平行配列に....

プロトコル

研究にはAB野生型系統とトランスジェニック系統 Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] を使用しました。すべての動物実験は、米国カリフォルニア大学サンフランシスコ校の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されました(承認番号:AN179000)。

1.ゼブラフィッシュ胚の調製

1. 午後5:00前の魚横断水槽を設置し、野生型魚1匹とオスTg [ef1a:Myr-Tdtomato] 魚1匹を仕切りで各水槽に分離します。
2. 翌朝、午前11:00までにすべての交差タンクから仕切りを取り外します。静かにして、交尾中は魚を邪魔しないでください。産卵は通常、仕切りを取り除いてから30分以内に起こります。受精卵はタンクの底に残ります。
   1. メッシュフィルターでタンクから受精卵を集めます。卵を洗い流して卵水を入れたペトリ皿に移し、解剖顕微鏡で10倍から20倍の倍率で胚を調べます。
3. 受精した胚を、大口径ガラス製パスツールピペットで約20 mLの胚培地(100 mLの1,000xストック溶液には、29.4 gのNaCl、1.27 gのKCl、4.85 gのCaCl 2.2H 2 O、および8.13 gのMgSO_{4.7H 2}Oを含む)を含む清潔なペトリ皿に移します....

結果

図2Aにおいて、Atto647Nを注射した胚は、一次抗体と結合することなく、脳室においてバックグラウンド蛍光を示した。細胞内にはごくわずかな取り込まれた蛍光粒子が観察されます。抗Dld-Atto647Nを注入したゼブラフィッシュ胚は、発達中の前脳のほとんどの細胞に大量の内在化蛍光粒子を示しました(図2A、右パネル)。図2Bに示.......

ディスカッション

我々は、ゼブラフィッシュ放射状グリア前駆細胞におけるエンドソームNotch/Delta輸送を高効率で標識およびイメージングするための抗体取り込みアッセイを開発しました。ショウジョウバエSOP細胞^7,8で標識抗DeltaD抗体を追跡するために使用された以前の方法と比較して、私たちの方法は、結合抗体内のサンプルのインキュベーションの代わりにマイ.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm glass bottom culture dish	MatTek corporation	P35GC-1.5-10-C
air pressure injector	Narishige	IM300
Anti-Mouse-IgG-Atto647N	Sigma-Aldrich	50185
CaCl2.2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament	World Precision Instruments	1B120F-6
CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield	Nikin	N/A	Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal.
Dumont Medical Tweezers Style 5	Thomas Scientific	72877-D
Flaming-Brown P897 puller	Sutter Instruments	N/A	https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf
KCl	Millipore	529552
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	M2773
micromanipulators	World Precision Instruments	WPI M3301R
Mouse anti-Dld	Abcam	AB_1268496
Mouse IgG blocking buffer from Zenon	Thermofisher Scientific	Z25008
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
Phenol red	Sigma-Aldrich	P0290
Stemi 2000	Zeiss	N/A
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
UltraPureTM low melting point agarose	Invitrogen	16520050