Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول الحالي تجميع الجسيمات الشحمية بمساعدة الأوكتانول (OLA) ، وهي تقنية ميكروفلويديك لتوليد الجسيمات الشحمية المتوافقة حيويا. تنتج OLA جسيمات ليبوزومات أحادية التشتت بحجم ميكرون مع تغليف فعال ، مما يسمح بإجراء تجارب فورية على الرقاقة. من المتوقع أن يكون هذا البروتوكول مناسبا بشكل خاص للبيولوجيا التركيبية وأبحاث الخلايا الاصطناعية.

Abstract

Microfluidics هي أداة مستخدمة على نطاق واسع لتوليد قطرات وحويصلات من أنواع مختلفة بطريقة خاضعة للرقابة وعالية الإنتاجية. الجسيمات الشحمية هي محاكاة خلوية مبسطة تتكون من داخل مائي محاط بطبقة ثنائية دهنية. إنها ذات قيمة في تصميم الخلايا الاصطناعية وفهم أساسيات الخلايا البيولوجية بطريقة مخبرية وهي مهمة للعلوم التطبيقية ، مثل تسليم البضائع للتطبيقات العلاجية. تصف هذه المقالة بروتوكول عمل مفصل لتقنية الموائع الدقيقة على الرقاقة ، وهي تجميع الجسيمات الشحمية بمساعدة الأوكتانول (OLA) ، لإنتاج الجسيمات الشحمية أحادية التشتت ، بحجم ميكرون ، متوافقة حيويا. يعمل OLA بشكل مشابه لنفخ الفقاعات ، حيث يتم الضغط على المرحلة المائية الداخلية (IA) ومرحلة 1-أوكتانول الحاملة للدهون المحيطة بواسطة تيارات السوائل الخارجية المحتوية على الفاعل بالسطح. هذا يولد بسهولة قطرات مستحلب مزدوج مع جيوب أوكتانول بارزة. عندما تتجمع الطبقة المزدوجة الدهنية عند واجهة القطيرات ، ينفصل الجيب تلقائيا ليؤدي إلى ظهور جسيم شحمي أحادي الصفيحة جاهز لمزيد من التلاعب والتجريب. يوفر OLA العديد من المزايا ، مثل توليد الجسيمات الشحمية الثابتة (>10 هرتز) ، والتغليف الفعال للمواد الحيوية ، ومجموعات الجسيمات الشحمية أحادية التشتت ، ويتطلب أحجام عينات صغيرة جدا (~ 50 ميكرولتر) ، والتي يمكن أن تكون حاسمة عند العمل مع المستحضرات البيولوجية الثمينة. تتضمن الدراسة تفاصيل حول التصنيع الدقيق ، والطباعة الحجرية الناعمة ، والتخميل السطحي ، وهي ضرورية لإنشاء تقنية OLA في المختبر. يظهر أيضا تطبيق البيولوجيا التركيبية لإثبات المبدأ من خلال تحفيز تكوين المكثفات الجزيئية الحيوية داخل الجسيمات الشحمية عبر تدفق البروتون عبر الغشاء. من المتوقع أن يسهل بروتوكول الفيديو المصاحب هذا على القراء إنشاء OLA واستكشاف الأخطاء وإصلاحها في مختبراتهم.

Introduction

تحتوي جميع الخلايا على غشاء بلازما كحدود فيزيائية لها ، وهذا الغشاء هو في الأساس سقالة على شكل طبقة ثنائية دهنية تتكون من التجميع الذاتي لجزيئات الدهون البرمائية. الجسيمات الشحمية هي الحد الأدنى من النظراء الاصطناعية للخلايا البيولوجية. لديهم تجويف مائي محاط بالفوسفوليبيدات ، والتي تشكل طبقة ثنائية دهنية مع مجموعات الرأس المحبة للماء التي تواجه المرحلة المائية والذيول الكارهة للماء المدفونة إلى الداخل. يخضع استقرار الجسيمات الشحمية للتأثير الكارهة للماء ، وكذلك المحبة للماء بين المجموعات القطبية ، وقوى فان دير فال بين ذيول الكربون الكارهة للماء ، والترابط الهيدروجيني بين جزيئات الماء والرؤوس المحبة للماء 1,2. اعتمادا على عدد الطبقات الثنائية الدهنية ، يمكن تصنيف الجسيمات الشحمية إلى فئتين رئيسيتين ، وهما الحويصلات أحادية الصفيحة التي تتكون من طبقة ثنائية واحدة وحويصلات متعددة الصفائح مكونة من طبقات ثنائية متعددة. يتم تصنيف الحويصلات أحادية الصفيحة بناء على أحجامها. عادة ما تكون كروية الشكل ، ويمكن إنتاجها في مجموعة متنوعة من الأحجام ، بما في ذلك الحويصلات الصغيرة أحادية الصفيحة (SUV ، قطرها 30-100 نانومتر) ، والحويصلات أحادية الصفيحة الكبيرة (LUV ، قطرها 100-1000 نانومتر) ، وأخيرا ، الحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUV ، قطر > 1000 نانومتر) 3,4. تم تطوير تقنيات مختلفة لإنتاج الجسيمات الشحمية ، ويمكن تصنيفها على نطاق واسع إلى تقنيات السائبة5 وتقنيات الموائع الدقيقة6. تشمل التقنيات السائبة الشائعة إعادة إماهة فيلم الدهون ، والتشكيل الكهربائي ، ونقل المستحلب المقلوب ، والبثق7،8،9،10. هذه التقنيات بسيطة وفعالة نسبيا ، وهذه هي الأسباب الرئيسية لاستخدامها على نطاق واسع في مجتمع البيولوجيا التركيبية. ومع ذلك ، في الوقت نفسه ، يعانون من عيوب كبيرة فيما يتعلق بتعدد التشتت في الحجم ، وعدم التحكم في الصفيحة ، وانخفاض كفاءة التغليف 7,11. تتغلب تقنيات مثل التغليف المستمر لواجهة القطيرات المتقاطعة (cDICE)12 وإطلاق القطيرات وترشيح الحجم (DSSF)13 على هذه القيود إلى حد ما.

وقد برزت نهج الموائع الدقيقة على مدى العقد الماضي. توفر تقنية الموائع الدقيقة بيئة يمكن التحكم فيها لمعالجة تدفقات السوائل داخل القنوات الدقيقة التي يحددها المستخدم بسبب التدفق الصفحي المميز ونقل الكتلة الذي يهيمن عليه الانتشار. توفر أجهزة المختبر على الرقاقة الناتجة إمكانيات فريدة للتحكم الزماني المكاني للجزيئات ، مع تقليل أحجام العينات بشكل كبير وقدرات تعدد الإرسال14. تم تطوير العديد من طرق الموائع الدقيقة لصنع الجسيمات الشحمية ، بما في ذلك النفث النبضي 15 ، وقوالب المستحلب المزدوج 16 ، وطرد الغشاء العابر 17 ، ونقل مستحلب القطيرات 18 ، والتركيز الهيدروديناميكي 19. تنتج هذه التقنيات الجسيمات الشحمية أحادية التشتت ، أحادية الصفيحة ، بحجم الخلية مع كفاءة تغليف عالية وإنتاجية عالية.

توضح هذه المقالة بالتفصيل الإجراء الخاص بتجميع الجسيمات الشحمية بمساعدة الأوكتانول (OLA) ، وهي طريقة الموائع الدقيقة على الرقاقة تعتمد على القرص الهيدروديناميكي وآلية إزالة ترطيب المذيبات اللاحقة20 (الشكل 1). يمكن للمرء أن يربط عمل OLA بعملية نفخ الفقاعات. يركز التقاطع السداسي على المرحلة المائية الداخلية (IA) ، وتيارين عضويين يحملان الدهون (LO) ، وتيارين مائيين خارجيين يحتويان على خافض للتوتر السطحي (OA) في مكان واحد. ينتج عن هذا قطرات مستحلب مزدوجة في الماء (دهون + أوكتانول) في الماء. عندما تتدفق هذه القطرات في اتجاه مجرى النهر ، يؤدي تقليل الطاقة البينية ، وتدفق القص الخارجي ، والتفاعل مع جدران القناة إلى تكوين طبقة ثنائية دهنية عند الواجهة حيث ينفصل جيب المذيب ، وبالتالي يشكل الجسيمات الشحمية أحادية الصفيحة. اعتمادا على حجم جيب الأوكتانول ، يمكن أن تستغرق عملية إزالة الرطوبة عشرات الثواني إلى دقيقتين. في نهاية قناة الخروج ، تطفو قطرات الأوكتانول الأقل كثافة على السطح ، في حين أن الجسيمات الشحمية الأثقل (بسبب محلول مغلف أكثر كثافة) تغرق في قاع غرفة التصور جاهزة للتجربة. كتجربة تمثيلية ، يتم إثبات عملية فصل الطور السائل عن السائل (LLPS) داخل الجسيمات الشحمية. لذلك ، يتم تغليف المكونات المطلوبة داخل الجسيمات الشحمية عند درجة حموضة حمضية تمنع LLPS. من خلال إحداث تغيير في الأس الهيدروجيني خارجيا ، وبالتالي تدفق البروتون عبر الغشاء ، تتشكل قطرات مكثفات مفصولة بالطور داخل الجسيمات الشحمية. هذا يسلط الضوء على قدرات التغليف والمعالجة الفعالة لنظام OLA.

Protocol

1. تصنيع الرقاقة الرئيسية

  1. خذ رقاقة سيليكون نظيفة بقطر 4 بوصات (10 سم) (انظر جدول المواد). قم بتنظيفه بشكل أكبر باستخدام الهواء المضغوط لإزالة أي جزيئات غبار.
  2. قم بتركيب الرقاقة على مغلف دوار ، وقم بتوزيع ~ 5 مل برفق من مقاوم للضوء السلبي (انظر جدول المواد) في وسط الرقاقة. حاول تجنب فقاعات الهواء ، لأنها قد تتداخل مع عملية الطباعة النهائية للرقاقة.
  3. للحصول على طبقة مقاومة للضوء بسمك 10 ميكرومتر ، قم بتغطية الرقاقة بالدوران عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية مع تسارع 100 دورة في الدقيقة / ثانية للانتشار الأولي ، متبوعا بدوران 60 ثانية عند 3000 دورة في الدقيقة مع تسارع 500 دورة في الدقيقة / ثانية. في حالة الرغبة في سمك مختلف ، قم بتغيير معلمات الغزل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  4. تخبز الرقاقة على طبق تسخين لمدة 2 دقيقة عند 65 درجة مئوية ثم لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية.
  5. بمجرد أن تبرد الرقاقة ، قم بتركيب الرقاقة في غرفة الطباعة بآلة الطباعة الحجرية البصرية للكتابة المباشرة (انظر جدول المواد) ، وقم بتغذية تصميم OLA (الشكل 2A ، ملف الترميز التكميلي 1) في البرنامج.
    ملاحظة: يتكون تصميم OLA بشكل أساسي من قناتين OA وقناتين LO وقناة IA واحدة ، والتي تندمج لتشكيل تقاطع سداسي الاتجاهات يستمر كقناة ما بعد الإنتاج وينتهي به المطاف في البئر التجريبي (EW).
  6. اطبع تصميم (تصميمات) OLA على الرقاقة المطلية باستخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية (انظر جدول المواد) بجرعة 300 مللي جول / سم2.
  7. بمجرد طباعة التصميم ، اخبز الرقاقة على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، تليها 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
  8. في هذه المرحلة ، تأكد من ظهور مخطط الجهاز المطبوع على الرقاقة ومرئيا للعين المجردة. لغسل المقاومة الضوئية غير المعالجة ، اغمس الرقاقة في دورق زجاجي يحتوي على محلول المطور (انظر جدول المواد) حتى تتم إزالة المقاومة الضوئية غير المعالجة بالكامل.
    ملاحظة: يمكن أن تؤثر المعالجة الزائدة للمطور على دقة التصميم.
  9. اغسل الرقاقة بالأسيتون والأيزوبروبانول والماء منزوع الأيونات (DI) بالتسلسل ، وأخيرا ، بالهواء المضغوط / N2 باستخدام مسدس نفخ.
  10. اخبز الرقاقة بقوة على حرارة 150 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للتأكد من أن التصميم المطبوع متصل بإحكام بسطح الرقاقة ولا ينفجر في عملية التصنيع النهائية. ثم تصبح الرقاقة الرئيسية جاهزة للاستخدام مرة أخرى (الشكل 2 ب).

2. تحضير جهاز الموائع الدقيقة

  1. ضع الرقاقة الرئيسية على قطعة مربعة من الألومنيوم ، ولف رقائق الألومنيوم حول الرقاقة ، لتشكيل هيكل يشبه البئر (الشكل 2C).
  2. قم بقياس 40 جم من polydimethylsiloxane (PDMS) و 4 جم من عامل المعالجة (10: 1 ، نسبة الوزن ، انظر جدول المواد) في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، واخلطه بقوة باستخدام ملعقة أو طرف ماصة لمدة 2-3 دقائق.
  3. يؤدي الخلط القوي ل PDMS وعامل المعالجة إلى حبس فقاعات الهواء داخل الخليط. أدر الأنبوب عند 100 × جم لمدة 2-3 دقائق لإزالة غالبية فقاعات الهواء الكبيرة.
  4. صب ما يقرب من 15-20 جم من الخليط المحضر في الخطوة 2.3 على الرقاقة الرئيسية ، وإزالة الغازات باستخدام المجفف. احفظ الخليط الزائد لعمل شرائح زجاجية مطلية ب PDMS (الخطوة 3).
  5. احتضن التجميع في فرن على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل.
  6. أخرج الرقاقة الرئيسية من الفرن واتركها تبرد. لإزالة كتلة PDMS الصلبة ، قم بإزالة رقائق الألومنيوم ، وقشر كتلة PDMS بعناية من حافة الرقاقة.
    ملاحظة: الرقاقة هشة وقد تنكسر ، لذلك من المهم القيام بهذه العملية بعناية.
  7. بمجرد إزالة كتلة PDMS ، حافظ على الهيكل المنقوش متجها لأعلى ، وباستخدام شفرة حادة أو مشرط ، قم بقطع كتل PDMS الفردية ، كل منها يحتوي على جهاز ميكروفلويديك واحد.
  8. ضع كتلة PDMS على سطح مظلم ، واضبط اتجاه الضوء (مصباح الطاولة مفيد لهذا الغرض) بحيث تكون القنوات المحفورة لامعة ، ونتيجة لذلك ، مرئية. قم بعمل ثقوب في المداخل وقناة الخروج باستخدام لكمات الخزعة بقطر 0.5 مم و 3 مم (انظر جدول المواد) ، على التوالي.
    ملاحظة: استخدم لكمة خزعة حادة لتجنب التشققات في PDMS ، والتي يمكن أن تسبب تسربا لاحقا. ادفع لكمة الخزعة برفق عبر كتلة PDMS ، وتأكد من مرورها بالكامل من خلالها. لإزالة لكمة الخزعة ، قم بسحبها برفق أثناء تدويرها في اتجاهات بديلة. كتلة PDMS مع تصميم OLA المحفور جاهزة الآن للربط بشريحة زجاجية مطلية PDMS.

3. صنع الشريحة الزجاجية المطلية PDMS

  1. خذ غطاء زجاجي شفاف ، واسكب ما يقرب من 0.5 مل من PDMS (تم تحضيره بشكل زائد في الخطوة 2.4) على وسط الشريحة الزجاجية ، وانشره عبر شريحة الغطاء عن طريق إمالة الشريحة الزجاجية برفق ، مما يضمن التغطية الكاملة للشريحة الزجاجية باستخدام PDMS.
  2. قم بتركيب الشريحة الزجاجية على طلاء الدوران ، وتأكد من وضعها في المنتصف (بحيث يتداخل منتصف الشريحة مع مركز عمود الضغط) ، وقم بتدوير الشريحة الزجاجية عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 15 ثانية (بزيادة 100 دورة في الدقيقة / ثانية) ثم عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية (بزيادة 500 دورة في الدقيقة / ثانية).
  3. ضع الشريحة الزجاجية المطلية ب PDMS (الجانب المطلي متجها لأعلى) على منصة مرتفعة مثل كتلة PDMS (1 سم × 1 سم) في طبق بتري مغطى ، واخبزيها على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.

4. الترابط من جهاز الموائع الدقيقة

  1. قم بتنظيف كتلة PDMS (المعدة في الخطوة 2) عن طريق لصق وإزالة شريط سكوتش المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) مرتين. تأكد من إبقاء الجانب النظيف متجها لأعلى حتى الاستخدام.
  2. نظف الشريحة الزجاجية المطلية ب PDMS بالهواء المضغوط / N2 باستخدام مسدس نفخ ، وحافظ على الجانب النظيف متجها لأعلى.
  3. ضع كتلة PDMS (القنوات المحفورة متجهة لأعلى) والشريحة الزجاجية المطلية ب PDMS (الجانب المطلي متجها لأعلى) في غرفة التفريغ بمنظف البلازما (انظر جدول المواد).
  4. قم بتشغيل الفراغ ، وعرض المحتويات لبلازما الهواء بتردد راديو يبلغ 12 ميجاهرتز (ارتفاع وضع التردد اللاسلكي) لمدة 15 ثانية لتنشيط الأسطح. يمكن رؤية بلازما الأكسجين في شكل لون وردي.
  5. مباشرة بعد معالجة البلازما ، ضع الشريحة الزجاجية المطلية ب PDMS على سطح نظيف بحيث يكون جانب PDMS متجها لأعلى. ضع كتلة PDMS برفق مع توجيه نمط الموائع الدقيقة الآن نحو الشريحة الزجاجية المطلية ب PDMS ، مما يسمح لها بالارتباط (الشكل 2D).
    ملاحظة: تعد إزالة الهواء المحبوس في الجهاز أمرا بالغ الأهمية لضمان الترابط الشامل.
  6. اخبز الأجهزة المستعبدة على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.

5. الأداء السطحي لجهاز الموائع الدقيقة

ملاحظة: قبل تشغيل السطح ، من المهم معايرة مضخة الضغط وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) وتجميع الأنبوب لتوصيله بجهاز الموائع الدقيقة.

  1. توصيل جهاز الموائع الدقيقة بمضخات الضغط
    1. قم بتوصيل وحدة التحكم في التدفق التي يحركها الضغط بمصدر ضغط خارجي (حتى 6 بارات). مطلوب ما لا يقل عن أربع قنوات ضغط هواء مستقلة: ثلاث وحدات فردية من 0-2 بار ، ووحدة واحدة من -0.9-4 بار.
    2. قم بمعايرة مضخة الضغط وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
    3. قطع الأنبوب (1/16 بوصة OD × 0.02 بوصة ID) إلى أربع قطع متساوية الحجم يبلغ طولها حوالي 20 سم.
    4. أدخل موصلات منحنية من الفولاذ المقاوم للصدأ 23 G 90 درجة (انظر جدول المواد) في أحد طرفي كل قطعة. يتم إدخال هذه النهاية لاحقا في المداخل الثلاثة (OA و LO و IA) لجهاز الموائع الدقيقة ويتم استخدام الطرف الرابع لإزالة المحلول الزائد (الخطوة 5.2.5).
    5. أدخل الطرف الآخر من الأنبوب في حامل خزان الموائع الدقيقة ، وقم بإغلاقه باستخدام تركيبات الموائع الدقيقة ، مع التأكد من أن الأنبوب طويل بما يكفي للمس قاع الخزان (أنابيب 1.5 مل ، انظر جدول المواد). هذا يمنع فقاعات الهواء غير المرغوب فيها من دخول جهاز الموائع الدقيقة أثناء معالجة PVA / إنتاج الجسيمات الشحمية.
  2. معالجة PVA لقناة الخروج
    ملاحظة: قبل توليد الجسيمات الشحمية ، من الضروري جعل الجهاز محبا للماء جزئيا في اتجاه مجرى تقاطع الإنتاج. يتم ذلك عن طريق معالجة هذه القنوات بمحلول كحول البولي فينيل (PVA) بنسبة 5٪ (وزن / حجم). يتم تحضير محلول PVA عن طريق إذابة مسحوق PVA (انظر جدول المواد) في الماء عند 80 درجة مئوية لمدة 3 ساعات مع التحريك المستمر باستخدام محرك مغناطيسي. قم بتصفية المحلول قبل استخدامه للمعالجة السطحية. مباشرة بعد ربط الجهاز ، تكون قنوات الموائع الدقيقة محبة للماء بسبب تنشيط السطح الناجم عن البلازما ، وسوف تصبح تدريجيا كارهة للماء مرة أخرى. يوصى بالانتظار لمدة 2 ساعة بعد الخبز (الخطوة 4.6) قبل البدء في علاج PVA.
    1. قم بتوزيع 200 ميكرولتر من محلول PVA بنسبة 5٪ وزن / فولت في أنبوب سعة 1.5 مل ، وقم بتوصيله بحامل خزان الموائع الدقيقة. أدخل الأنبوب (المذكور في الخطوة 5.1.3) بحيث يتم غمر أحد طرفيه في محلول PVA ويتم توصيل الطرف الآخر بمدخل قناة OA لجهاز الموائع الدقيقة.
      ملاحظة: يمكن أن يؤدي انخفاض تركيز PVA إلى وظائف سطح دون المستوى.
    2. كرر الخطوة أعلاه بدون PVA (أنبوب فارغ سعة 1.5 مل) ، وقم بتوصيله بقنوات LO و IA.
    3. زيادة ضغط مرحلة الزراعة العضوية إلى 100 ملي بار لتدفق محلول PVA في قنوات الزراعة العضوية. زيادة ضغوط مرحلتي IA و LO إلى 120 ملي بار لمنع التدفق العكسي لمحلول PVA داخل هذه القنوات (الشكل 2E).
      ملاحظة: إذا لزم الأمر ، اضبط ضغوط القنوات الفردية من أجل الحفاظ على ثبات الغضروف المفصلي عند تقاطع الإنتاج.
    4. قم بتدفق محلول PVA بهذه الطريقة لمدة 5 دقائق تقريبا ، مما يضمن التشغيل الكامل لقناة الخروج.
    5. لإزالة محلول PVA ، افصل الأنبوب عن مدخل الزراعة العضوية ، وقم على الفور بزيادة الضغط في قنوات LO و IA إلى 2 بار. في الوقت نفسه ، استخدم أنبوبا متصلا بقناة ضغط سلبي (−900 ملي بار) قم بإزالة PVA الزائد أولا من قناة الخروج ثم من مدخل الزراعة العضوية (الشكل 2F).
    6. اخبزي الجهاز على حرارة 120 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة واتركيه يبرد قبل الاستخدام. يمكن تخزين الجهاز في ظل الظروف المحيطة لمدة 1 شهر على الأقل.
      ملاحظة: يوصى بالانتظار لمدة 1 يوم (في درجة حرارة الغرفة) قبل الشروع في استخدام OLA لضمان استعادة PDMS غير المعالج كرهه للماء بعد العلاج بالبلازما.

6. تجميع الجسيمات الشحمية بمساعدة الأوكتانول (OLA)

  1. تحضير مخزون الدهون
    ملاحظة: هنا ، يتم استخدام خليط من الدهون 1،2-ديوليويل-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) و 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- (lissamine rhodamine B sulfonyl) (Liss Rhod PE) (انظر جدول المواد) كمثال ؛ يجب على المستخدمين إعداد تركيبة الدهون التي يحتاجونها بطريقة مماثلة.
    1. قم بتوزيع 76 ميكرولتر من DOPC (25 مجم / مل) و 16.6 ميكرولتر من Liss Rhod PE (1 مجم / مل) في دورق دائري القاع باستخدام محاقن زجاجية منفصلة.
    2. حافظ على القارورة ذات القاع المستدير في وضع مستقيم ، واستخدم مسدس نفخ N2 مضغوط لإعطاء تيار لطيف من النيتروجين لتبخير الكلوروفورم وتشكيل طبقة دهنية مجففة في قاع القارورة.
    3. ضع القارورة في المجفف لمدة 2 ساعة على الأقل تحت فراغ مستمر لإزالة أي كلوروفورم متبقي.
    4. أضف 100 ميكرولتر من الإيثانول إلى الدورق المستدير القاع ، متبوعا بسحب أو اهتزاز لطيف لضمان إذابة الدهون لتشكيل مخزون دهون بنسبة 10٪ (وزن / حجم).
      ملاحظة: في حالة عدم قابلية ذوبان تركيبة دهنية معينة تماما في الإيثانول ، استخدم خليط الإيثانول / الكلوروفورم ، مع الحفاظ على حجم الكلوروفورم صغيرا قدر الإمكان.
    5. ماصة الحل في قارورة زجاجية داكنة. اغسل القارورة برفق بالنيتروجين باستخدام مسدس نفخ لاستبدال الهواء بجو خامل. أغلق الغطاء بغشاء البارافين ، واحفظه في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن استخدام حل المخزون لمدة تصل إلى بضعة أشهر. في كل مرة يتم فيها فتح القارورة ، استبدل الهواء برفق بالنيتروجين ، وأعد إغلاقه بغطاء بغشاء البارافين.
  2. إعداد حلول OLA
    1. جعل حلول الأسهم من المكونات التي لا غنى عنها: 20 مللي متر ديكستران (ميغاواط 6000) ؛ 60٪ (V / V) الجلسرين. مخزن مؤقت للاختيار. في هذه الحالة ، تم تحضير 5x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (0.68 M NaCl ، 13.5 mM KCl ، 50 mM Na 2 HPO 4 ، 9 mM KH2PO 4 ؛درجة الحموضة7.4) (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: نظرا لأن الجلسرين النقي شديد اللزوجة ، فمن المستحسن قطع قطعة صغيرة في نهاية طرف الماصة بطريقة مائلة لسحب العينات بشكل فعال.
    2. تحضير 100 ميكرولتر من عينات IA و OA ومحلول الخروج (ES ، الحل المطلوب لملء EW). لسهولة التصور ، تمت إضافة البروتين الفلوري الأصفر (YFP) إلى محلول IA في هذه الحالة بالذات. تحقق من التوازن التناضحي بين IA و OA عن طريق حساب الأسمولية للمكونات المغلفة وإضافة كمية مناسبة من السكر أو الملح إلى الزراعة العضوية إذا لزم الأمر. يتم ذلك من أجل منع انفجار أو تقلص الجسيمات الشحمية أثناء الإنتاج.
      ملاحظة: التركيبات النهائية للمراحل الثلاث هي كما يلي:
      IA: 15٪ جلسرين ، 5 مللي مول ديكستران (Mw 6,000) ، 5.4 ميكرومتر YFP ، 1x PBS
      الزراعة العضوية: 15٪ جلسرين ، 5٪ F68 خافض للتوتر السطحي ، 1x PBS
      ES: 15٪ جلسرين ، 1x PBS
      يؤثر انخفاض تركيز الفاعل بالسطح F68 سلبا على توليد المستحلبات المزدوجة.
    3. تحضير 80 ميكرولتر من مرحلة LO عن طريق سحب 4 ميكرولتر من دهون المخزون إلى 76 ميكرولتر من 1-أوكتانول (انظر جدول المواد). التركيز النهائي ل DOPC هو 5 ملغ / مل.
    4. أجهزة الطرد المركزي العينات عند 700 × جم لمدة 60 ثانية لإزالة أي مجاميع كبيرة قبل الشروع في تجارب الموائع الدقيقة. هذا يمنع أي عوامل انسداد واضحة من دخول رقاقة الموائع الدقيقة.
  3. إنتاج الجسيمات الشحمية
    1. قم بتوزيع المحاليل (IA ، LO ، OA) في ثلاثة أنابيب سعة 1.5 مل ، وقم بتجميعها (كما هو مذكور في الخطوة 5.1) ، وقم بتوصيلها بشريحة الموائع الدقيقة المعالجة ب PVA (الخطوة 5.2.6).
    2. تطبيق ضغط إيجابي على القنوات الثلاث: ~ 100 ملي بار على قنوات IA و LO و ~ 200 ملي بار على قناة الزراعة العضوية.
      ملاحظة: نظرا لأن ضغط الزراعة العضوية أعلى من الآخرين ، فإن حل الزراعة العضوية سيكون أول من يصل إلى EW ؛ هذا ينصح بشدة.
    3. بمجرد وصول محلول الزراعة العضوية إلى EW ، قم بتقليل ضغط الزراعة العضوية إلى 100 ملي بار وزيادة LO إلى 200 ملي بار.  من المحتمل أن يؤدي حل LO الذي يصل إلى تقاطع الإنتاج إلى فقاعات هواء بسبب إزاحة الهواء من قنوات LO. بمجرد توزيع فقاعات الهواء في EW ، اضبط ضغط LO على 100 ملي بار. أخيرا ، قم بزيادة ضغط IA إلى 200 ملي بار ، وانتظر حتى تتم إزالة كل الهواء في قناة IA. التسلسل المثالي للوصول عند تقاطع المراحل الثلاث هو ، بالتالي ، OA و LO و IA.
    4. بعد إزالة الهواء من القنوات الثلاث ، اضبط جميع ضغوط القناة على 50 ملي بار وماصة 10 ميكرولتر من ES في غرفة الخروج. بعد سحب ES ، ضع شريحة غطاء على فتحة الخروج لتجنب التبخر. في حالة دفع LO للخلف ، قم بزيادة ضغط LO تدريجيا بزيادات قدرها 1 ملي بار حتى يبدأ في التدفق إلى التقاطع.
    5. بمجرد أن تبدأ المراحل الثلاث في التدفق المشترك عند التقاطع ، تأكد من بدء إنتاج المستحلب المزدوج ، واضبطه وفقا لجودته (الشكل 3A-C). قم بتغيير الضغوط تدريجيا (خطوات 0.1-1 ملي بار) بدلا من تغييرها فجأة ما لم يتم تغيير الضغط للتخلص من انسداد غير مرغوب فيه في القناة.
      ملاحظة: تعتمد القنوات المراد ضبطها على ما يحدث عند التقاطع. على سبيل المثال ، يجب تقليل IA إذا كانت المستحلبات كبيرة جدا ؛ يجب زيادة الزراعة العضوية إذا تشكلت مستحلبات مزدوجة ولكنها انفجرت بدلا من أن تقرص ؛ ويجب تقليل LO إذا كان جيب الأوكتانول كبيرا جدا.
    6. تأكد من أن قطرات المستحلب المزدوج تتدفق في اتجاه مجرى النهر إلى الحرب الإلكترونية. مع تدفقها ، تصبح جيوب الأوكتانول أكثر بروزا وأخيرا يتم قرصها ، وتشكيل الجسيمات الشحمية (الشكل 3D-F). تأكد من أن قناة ما بعد الإنتاج طويلة بما يكفي وأن هجرة المستحلبات المزدوجة بطيئة بما يكفي لإزالة الرطوبة.
      ملاحظة: في غضون دقائق بعد الإنتاج اللائق ، ستخرج الجسيمات الشحمية وقطرات الأوكتانول من قناة ما بعد الإنتاج وتذهب إلى الحرب الإلكترونية. نتيجة لذلك ، كونها أقل كثافة من الماء ، تطفو قطرات الأوكتانول على سطح ES. بسبب إضافة ديكستران في IA ، تكون الجسيمات الشحمية أثقل من محيطها وتذهب إلى قاع الغرفة جاهزة للمراقبة والمزيد من التلاعب.

النتائج

توضح هذه الدراسة تكوين المكثفات الخالية من الأغشية من خلال عملية فصل الطور السائل عن السائل (LLPS) داخل الجسيمات الشحمية كتجربة تمثيلية.

إعداد العينة
يتم تحضير محلول IA و OA و ES ومحلول التغذية (FS) على النحو التالي:

IA: 12٪ جلسرين ، 5 مللي مول ديكستران ، ...

Discussion

التعقيد الخلوي يجعل من الصعب للغاية فهم الخلايا الحية عند دراستها ككل. يعد الحد من التكرار والترابط بين الخلايا عن طريق إعادة تكوين المكونات الرئيسية في المختبر أمرا ضروريا لتعزيز فهمنا للأنظمة البيولوجية وإنشاء محاكاة خلوية اصطناعية لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية22،

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نود أن نعرب عن تقديرنا لدولف ويجرز وفيرا غوريلوفا ومارك روزجين لتزويدنا ببرنامج YFP. تقر S.D. بالدعم المالي المقدم من مجلس البحوث الهولندي (رقم المنحة: OCENW. كلاين.465).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-OctanolSigma-AldrichNo. 297887
1.5 mL tubesFisher scientific10451043Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes
ATPSigma-AldrichNo. A2383
Biopsy punchDarwin microfluidicsPT-T983-050.5 mm and 3 mm diameter
Citrate-baseSigma-AldrichNo. 71405
DextranSigma-AldrichNo. 31388Mr~6,000
Direct-write optical lithography machineDurham Magneto Optics LtdMicroWriter ML3 Babysetup and software
DOPC lipidAvantiSKU:850375C
F68Sigma-AldrichNo. 24040032
Glass cover slipCorning#1, 24 x 40 mm
GlycerolSigma-AldrichNo. G2025
Hydrochloric acidThermo Scientific AcrosNo. 124630010
Liss Rhod PE lipidAvantiSKU:810150C
ParafilmSigma-AldrichNo. P7793
PhotoresistMicro resist technology GmbHEpoCore 10
Photoresist developermicro resist technology GmbHmr-Dev 600
Plasma cleanerHarrick plasmaPDC-32G
PolydimethylsiloxaneDowSylgard 184PDMS and curing agent
Poly-L-lysineSigma-AldrichNo. P7890
Poly-L-lysine–FITC LabeledSigma-AldrichNo. P3543
Polyvinyl alcoholSigma-Aldrichno. P8136molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed
Pressure controllerElveflow OBK1 Mk3+Flow controller
Scotch tapeMagic Tape Invisible Matt Tape
Silicon waferSilicon Materials0620R16002
Spin coater Laurell Technologies CorporationModel WS-650MZ-23NPP
Stainless Steel 90° Bent PDMS CouplersDarwin microfluidicsPN-BEN-23G
Tris-baseSigma-AldrichNo. 252859
Tygon tubingDarwin microfluidics1/16" OD x 0.02" ID
UV laser 365 nm wavelength

References

  1. Frezard, F. Liposomes: From biophysics to the design of peptide vaccines. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 32 (2), 181-189 (1999).
  2. Monteiro, N., Martins, A., Reis, R. L., Neves, N. M. Liposomes in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of the Royal Society Interface. 11 (101), 20140459 (2014).
  3. Mishra, H., Chauhan, V., Kumar, K., Teotia, D. A comprehensive review on liposomes: A novel drug delivery system. Journal of Drug Delivery and Therapeutics. 8 (6), 400-404 (2018).
  4. Liu, W., et al. Research progress on liposomes: Application in food, digestion behavior and absorption mechanism. Trends in Food Science & Technology. 104, 177-189 (2020).
  5. Kamiya, K., Takeuchi, S. Giant liposome formation toward the synthesis of well-defined artificial cells. Journal of Materials Chemistry B. 5 (30), 5911-5923 (2017).
  6. van Swaay, D., DeMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab on a Chip. 13 (5), 752-767 (2013).
  7. Lombardo, D., Kiselev, M. A. Methods of liposomes preparation: Formation and control factors of versatile nanocarriers for biomedical and nanomedicine application. Pharmaceutics. 14 (3), 543 (2022).
  8. Zhang, H., D’Souza, G. G. M. Thin-film hydration followed by extrusion method for liposome preparation. Liposomes: Methods and Protocols. , 17-22 (2017).
  9. Filipczak, N., Pan, J., Yalamarty, S. S. K., Torchilin, V. P. Recent advancements in liposome technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 156, 4-22 (2020).
  10. Has, C., Sunthar, P. A comprehensive review on recent preparation techniques of liposomes. Journal of Liposome Research. 30 (4), 336-365 (2020).
  11. Large, D. E., Abdelmessih, R. G., Fink, E. A., Auguste, D. T. Liposome composition in drug delivery design, synthesis, characterization, and clinical application. Advanced Drug Delivery Reviews. 176, 113851 (2021).
  12. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  13. Morita, M., et al. Droplet-shooting and size-filtration (DSSF) method for synthesis of cell-sized liposomes with controlled lipid compositions. ChemBioChem. 16 (14), 2029-2035 (2015).
  14. Convery, N., Gadegaard, N. 30 years of microfluidics. Micro and Nano Engineering. 2, 76-91 (2019).
  15. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  16. Chu, L. Y., Utada, A. S., Shah, R. K., Kim, J. W., Weitz, D. A. Controllable monodisperse multiple emulsions. Angewandte Chemie. 119 (47), 9128-9132 (2007).
  17. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  18. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  19. Carugo, D., Bottaro, E., Owen, J., Stride, E., Nastruzzi, C. Liposome production by microfluidics: Potential and limiting factors. Scientific Reports. 6, 25876 (2016).
  20. Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
  21. Last, M. G., Deshpande, S., Dekker, C. pH-controlled coacervate-membrane interactions within liposomes. ACS Nano. 14 (4), 4487-4498 (2020).
  22. Jia, H., Schwille, P. Bottom-up synthetic biology: reconstitution in space and time. Current Opinion in Biotechnology. 60, 179-187 (2019).
  23. Ganar, K. A., Leijten, L., Deshpande, S. Actinosomes: Condensate-Templated Containers for Engineering Synthetic Cells. ACE Synthetic Biology. 11 (8), 2869-2879 (2022).
  24. Gaut, N. T., Adamala, K. P. Reconstituting Natural Cell Elements in Synthetic Cells. Advanced Biology. 5 (3), 2000188 (2021).
  25. Ganar, K. A., Honaker, L. W., Deshpande, S. Shaping synthetic cells through cytoskeleton-condensate-membrane interactions. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 54, 101459 (2021).
  26. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  27. Deshpande, S., et al. Spatiotemporal control of coacervate formation within liposomes. Nature Communications. 10, 1800 (2019).
  28. Love, C., et al. Reversible pH-responsive coacervate formation in lipid vesicles activates dormant enzymatic reactions. Angewandte Chemie. 132 (15), 6006-6013 (2020).
  29. Lu, T., et al. Endocytosis of coacervates into liposomes. Journal of the American Chemical Society. 144 (30), 13451-13455 (2022).
  30. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  31. Blanken, D., Foschepoth, D., Serrão, A. C., Danelon, C. Genetically controlled membrane synthesis in liposomes. Nature Communications. 11, 4317 (2020).
  32. Bouzetos, E., Ganar, K. A., Mastrobattista, E., Deshpande, S., vander Oost, J. (R) evolution-on-a-chip. Trends in Biotechnology. 40 (1), 60-76 (2022).
  33. Kamalinia, G., Grindel, B. J., Takahashi, T. T., Millward, S. W., Roberts, R. W. Directing evolution of novel ligands by mRNA display. Chemical Society Reviews. 50 (16), 9055-9103 (2021).
  34. Godino, E., et al. De novo synthesized Min proteins drive oscillatory liposome deformation and regulate FtsA-FtsZ cytoskeletal patterns. Nature Communications. 10, 4969 (2019).
  35. Tenchov, R., Bird, R., Curtze, A. E., Zhou, Q. Lipid nanoparticles─From liposomes to mRNA vaccine delivery, a landscape of research diversity and advancement. ACS Nano. 15 (11), 16982-17015 (2021).
  36. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
  37. Schaich, M., et al. An integrated microfluidic platform for quantifying drug permeation across biomimetic vesicle membranes. Molecular Pharmaceutics. 16 (6), 2494-2501 (2019).
  38. Schaich, M., Sobota, D., Sleath, H., Cama, J., Keyser, U. F. Characterization of lipid composition and diffusivity in OLA generated vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1862 (9), 183359 (2020).
  39. Deshpande, S., Spoelstra, W. K., Van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
  40. Jusková, P., et al. 34;Basicles": Microbial growth and production monitoring in giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (38), 34698-34706 (2019).
  41. Fletcher, M., et al. DNA-based optical quantification of ion transport across giant vesicles. ACS Nano. 16 (10), 17128-17138 (2022).
  42. Vaezi, Z., et al. Investigation of the programmed cell death by encapsulated cytoskeleton drug liposomes using a microfluidic platform. Microfluidics and Nanofluidics. 24 (7), 48 (2020).
  43. Al Nahas, K., et al. A microfluidic platform for the characterisation of membrane active antimicrobials. Lab on a Chip. 19 (5), 837-844 (2019).
  44. Bao, P., et al. Production of giant unilamellar vesicles and encapsulation of lyotropic nematic liquid crystals. Soft Matter. 17 (8), 2234-2241 (2021).
  45. Yandrapalli, N., Petit, J., Bäumchen, O., Robinson, T. Surfactant-free production of biomimetic giant unilamellar vesicles using PDMS-based microfluidics. Communications Chemistry. 4, 100 (2021).
  46. Cama, J., et al. An ultrasensitive microfluidic approach reveals correlations between the physico-chemical and biological activity of experimental peptide antibiotics. Scientific Reports. 12, 4005 (2022).
  47. Guerzoni, L. P., et al. High macromolecular crowding in liposomes from microfluidics. Advanced Science. 9 (27), 2201169 (2022).
  48. Gonzales, D. T., Yandrapalli, N., Robinson, T., Zechner, C., Tang, T. D. Cell-free gene expression dynamics in synthetic cell populations. ACS Synthetic Biology. 11 (1), 205-215 (2022).
  49. Ushiyama, R., Koiwai, K., Suzuki, H. Plug-and-play microfluidic production of monodisperse giant unilamellar vesicles using droplet transfer across water-oil interface. Sensors and Actuators B: Chemical. 355, 131281 (2022).
  50. Banlaki, I., Lehr, F. -. X., Niederholtmeyer, H., Karim, A. S., Jewett, M. C. Microfluidic production of porous polymer cell-mimics capable of gene expression. Cell-Free Gene Expression. , 237-255 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved