Montagem de lipossomas assistida por octanol on-chip para bioengenharia

Resumo

O presente protocolo descreve a montagem de lipossomas assistida por octanol (OLA), uma técnica microfluídica para gerar lipossomas biocompatíveis. O OLA produz lipossomas monodispersos do tamanho de mícrons com encapsulamento eficiente, permitindo a experimentação imediata no chip. Prevê-se que este protocolo seja particularmente adequado para biologia sintética e pesquisa de células sintéticas.

Resumo

A microfluídica é uma ferramenta amplamente utilizada para gerar gotículas e vesículas de vários tipos de forma controlada e de alto rendimento. Os lipossomas são miméticos celulares simplistas compostos por um interior aquoso circundado por uma bicamada lipídica; Eles são valiosos para projetar células sintéticas e entender os fundamentos das células biológicas de forma in vitro e são importantes para ciências aplicadas, como a entrega de carga para aplicações terapêuticas. Este artigo descreve um protocolo de trabalho detalhado para uma técnica microfluídica on-chip, montagem de lipossomas assistida por octanol (OLA), para produzir lipossomas biocompatíveis monodispersos, de tamanho micron. O OLA funciona de forma semelhante ao sopro de bolhas, onde uma fase aquosa interna (IA) e uma fase adjacente de 1-octanol carreadora de lipídios são pinçadas por fluxos de fluido externo contendo surfactante. Isso gera prontamente gotículas de emulsão dupla com bolsas de octanol salientes. À medida que a bicamada lipídica se reúne na interface da gota, a bolsa se desprende espontaneamente para dar origem a um lipossomo unilamelar que está pronto para posterior manipulação e experimentação. O OLA oferece várias vantagens, como geração constante de lipossomas (>10 Hz), encapsulamento eficiente de biomateriais e populações de lipossomas monodispersas, e requer volumes de amostra muito pequenos (~50 μL), o que pode ser crucial quando se trabalha com biológicos preciosos. O estudo inclui detalhes sobre microfabricação, litografia suave e passivação de superfície, que são necessários para estabelecer a tecnologia OLA no laboratório. Uma aplicação da biologia sintética de prova de princípio também é mostrada induzindo a formação de condensados biomoleculares dentro dos lipossomas via fluxo de prótons transmembrana. Espera-se que este protocolo de vídeo que o acompanha facilitará aos leitores estabelecer e solucionar problemas de OLA em seus laboratórios.

Introdução

Todas as células têm uma membrana plasmática como limite físico, e esta membrana é essencialmente um arcabouço na forma de uma bicamada lipídica formada pela auto-montagem de moléculas lipídicas anfifílicas. Os lipossomas são as contrapartes sintéticas mínimas das células biológicas; Possuem lúmen aquoso circundado por fosfolipídios, que formam uma bicamada lipídica com os grupos de cabeças hidrofílicas voltadas para a fase aquosa e as caudas hidrofóbicas enterradas para dentro. A estabilidade dos lipossomas é governada pelo efeito hidrofóbico, assim como pela hidrofilicidade entre os grupos polares, forças de van der Waals entre as caudas de carbono hidrofóbicas e a ligação de hidrogênio entre as moléculas de água e as cabeças hidrofílicas ^1,2. Dependendo do número de bicamadas lipídicas, os lipossomas podem ser classificados em duas categorias principais: vesículas unilamelares compostas por uma única bicamada e vesículas multilamelares construídas a partir de múltiplas bicamadas. As vesículas unilamelares são ainda classificadas com base em seus tamanhos. De forma tipicamente esférica, podem ser produzidas em uma variedade de tamanhos, incluindo pequenas vesículas unilamelares (SUV, diâmetro de 30-100 nm), grandes vesículas unilamelares (LUV, diâmetro de 100-1.000 nm) e, finalmente, vesículas unilamelares gigantes (GUV, >diâmetro de 1.000 nm)^3,4. Várias técnicas têm sido desenvolvidas para a produção de lipossomas, e estas podem ser amplamente categorizadas^{em técnicas de} massa5 e técnicas microfluídicas6. Técnicas de massa comumente praticadas incluem reidratação de filme lipídico, eletroformação, transferência de emulsão invertida e extrusão 7,8,9,10. Estas técnicas são relativamente simples e eficazes, e estas são as principais razões para o seu uso generalizado na comunidade de biologia sintética. No entanto, ao mesmo tempo, sofrem de grandes desvantagens no que diz respeito à polidispersidade de tamanho, à falta de controle sobre a lamelaridade e à baixa eficiência de encapsulação ^7,11. Técnicas como continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE)¹² e droplet shooting and size filtration (DSSF)¹³ superam essas limitações até certo ponto.

As abordagens microfluídicas têm ganhado destaque na última década. A tecnologia microfluídica fornece um ambiente controlável para manipular fluxos de fluidos dentro de microcanais definidos pelo usuário devido ao fluxo laminar característico e à transferência de massa dominada por difusão. Os dispositivos lab-on-a-chip resultantes oferecem possibilidades únicas para o controle espaço-temporal de moléculas, com volumes de amostra significativamente reduzidos e capacidade de multiplexação¹⁴. Numerosos métodos microfluídicos para fazer lipossomas foram desenvolvidos, incluindo jato pulsado 15, modelagem de emulsão dupla 16, ejeção de membrana transitória 17, transferência de emulsão em gotícula¹⁸ e focalização hidrodinâmica ¹⁹. Essas técnicas produzem lipossomas monodispersos, unilamelares do tamanho de células com alta eficiência de encapsulação e alto rendimento.

Este artigo detalha o procedimento de montagem de lipossomas assistidos por octanol (OLA), um método microfluídico on-chip baseado no pinch-off hidrodinâmico e subsequente mecanismo de desidratação do solvente²⁰ (Figura 1). Pode-se relacionar o funcionamento do OLA a um processo de explosão de bolhas. Uma junção de seis vias concentra a fase aquosa interna (IA), duas correntes orgânicas carreadoras de lipídios (LO) e duas correntes aquosas externas (OA) contendo surfactante em um único ponto. Isso resulta em gotículas de emulsão dupla água-em-(lipídios + octanol)-em-água. À medida que essas gotículas fluem rio abaixo, a minimização da energia interfacial, o fluxo de cisalhamento externo e a interação com as paredes do canal levam à formação de uma bicamada lipídica na interface à medida que a bolsa de solvente se desprende, formando assim lipossomas unilamelares. Dependendo do tamanho do bolso octanol, o processo de desumectação pode levar de dezenas de segundos a alguns minutos. No final do canal de saída, as gotículas octanol menos densas flutuam para a superfície, enquanto os lipossomas mais pesados (devido a uma solução encapsulada mais densa) afundam no fundo da câmara de visualização prontos para experimentação. Como um experimento representativo, o processo de separação de fase líquido-líquido (LLPS) dentro de lipossomas é demonstrado. Para isso, os componentes necessários são encapsulados dentro de lipossomas a um pH ácido que impede a LLPS. Ao desencadear externamente uma mudança de pH e, portanto, um fluxo transmembrana de prótons, gotículas de condensado separadas por fase são formadas dentro dos lipossomas. Isso destaca os recursos efetivos de encapsulamento e manipulação do sistema OLA.

Protocolo

1. Fabricação do wafer mestre

1. Pegue um wafer de silicone limpo de 4 polegadas (10 cm) de diâmetro (consulte a Tabela de Materiais). Limpe-o ainda mais usando ar pressurizado para remover quaisquer partículas de poeira.
2. Monte o wafer em um revestidor de spin e distribua suavemente ~5 mL de um fotorresiste negativo (consulte a Tabela de Materiais) no centro do wafer. Tente evitar bolhas de ar, pois elas podem interferir no processo de impressão a jusante do wafer.
3. Para obter uma camada fotorresistente de 10 μm de espessura, spin-coat o wafer a 500 rpm por 30 s com uma aceleração de 100 rpm/s para espalhamento inicial, seguido por um giro de 60 s a 3.000 rpm com uma aceleração de 500 rpm/s. Caso se deseje uma espessura diferente, altere os parâmetros de fiação de acordo com as instruções do fabricante.
4. Asse a bolacha numa placa de aquecimento durante 2 min a 65 °C e depois durante 5 min a 95 °C.
5. Assim que o wafer esfriar, monte o wafer na câmara de impressão da máquina de litografia óptica de gravação direta (consulte Tabela de Materiais) e alimente o projeto OLA (Figura 2A, Arquivo de codificação suplementar 1) no software.
   NOTA: O projeto OLA consiste essencialmente em dois canais OA, dois canais LO e um canal IA, que se fundem para formar uma junção de seis vias que continua como um canal de pós-produção e termina no poço experimental (EW).
6. Imprima o(s) design(s) OLA no(s) wafer revestido(s) utilizando um laser UV (ver Tabela de Materiais) com uma dose de 300 mJ/cm².
7. Uma vez impresso o desenho, asse o wafer a 65 °C por 1 min, seguido de 95 °C por 3 min.
8. Neste ponto, certifique-se de que o contorno do dispositivo impresso aparece na bolacha e é visível a olho nu. Para lavar o fotorresiste não curado, mergulhe o wafer em um copo de vidro contendo a solução reveladora (consulte a Tabela de Materiais) até que o fotorresiste não curado seja totalmente removido.
   Observação : excesso de tratamento do desenvolvedor pode afetar a resolução do design.
9. Lave o wafer com acetona, isopropanol e água deionizada (DI) em sequência e, finalmente, com ar pressurizado/N₂ usando uma pistola.
10. Asse o wafer a 150 °C por 30 min para garantir que o design impresso esteja firmemente preso à superfície do wafer e não saia no processo de fabricação a jusante. O wafer mestre está então pronto para uso posterior (Figura 2B).

2. Preparação do dispositivo microfluídico

1. Coloque o wafer mestre sobre um pedaço quadrado de alumínio e envolva a folha de alumínio ao redor do wafer, formando uma estrutura bem parecida (Figura 2C).
2. Meça 40 g de polidimetilsiloxano (PDMS) e 4 g de agente de cura (10:1, relação de peso, ver Tabela de Materiais) em um tubo de centrífuga de 50 mL e misture vigorosamente usando uma espátula ou uma ponta de pipeta por 2-3 min.
3. A mistura vigorosa do PDMS e do agente de cura aprisiona bolhas de ar dentro da mistura. Gire o tubo a 100 x g por 2-3 min para remover a maioria das grandes bolhas de ar.
4. Deite cerca de 15-20 g da mistura preparada na etapa 2.3 sobre o wafer principal e desgaseifique utilizando um dessecador. Guarde o excesso de mistura para fazer lâminas de vidro revestidas com PDMS (passo 3).
5. Incubar o conjunto num forno a 70 °C durante, pelo menos, 2 horas.
6. Retire a bolacha mestra do forno e deixe esfriar. Para remover o bloco PDMS solidificado, remova a folha de alumínio e descasque cuidadosamente o bloco PDMS da borda do wafer.
   NOTA: O wafer é frágil e pode quebrar, por isso é importante fazer esse processo com cuidado.
7. Uma vez removido o bloco de PDMS, mantenha a estrutura padronizada voltada para cima e, usando uma lâmina afiada ou um bisturi, corte blocos PDMS individuais, cada um contendo um único dispositivo microfluídico.
8. Coloque o bloco PDMS em uma superfície escura e ajuste a direção da luz (uma lâmpada de mesa é útil para isso) para que os canais gravados sejam brilhantes e, como resultado, visíveis. Faça furos nas entradas e no canal de saída usando punções de biópsia de 0,5 mm e 3 mm de diâmetro (ver Tabela de Materiais), respectivamente.
   NOTA: Use um punção de biópsia afiado para evitar rachaduras no PDMS, que podem causar vazamento mais tarde. Empurre suavemente o punção de biópsia através do bloco PDMS e certifique-se de que ele passe completamente por ele. Para remover o punch da biópsia, retraia-o suavemente enquanto o gira em direções alternativas. O bloco PDMS com o design OLA gravado agora está pronto para se ligar a uma lâmina de vidro revestida por PDMS.

3. Fazendo a lâmina de vidro revestida com PDMS

1. Pegue uma lamínula de vidro transparente, despeje aproximadamente 0,5 mL de PDMS (preparado em excesso na etapa 2.4) no centro da lâmina de vidro e espalhe-a por toda a lamínula inclinando suavemente a lâmina de vidro, garantindo a cobertura total da lâmina de vidro com PDMS.
2. Monte a lâmina de vidro no revestidor de spin, certifique-se de sua posição central (de modo que o meio da lâmina se sobreponha ao centro do eixo de pressão) e gire a lâmina de vidro a 500 rpm por 15 s (a um incremento de 100 rpm/s) e depois a 1.000 rpm por 30 s (a um incremento de 500 rpm/s).
3. Coloque a lâmina de vidro revestida com PDMS (lado revestido voltado para cima) em uma plataforma elevada como um bloco de PDMS (1 cm x 1 cm) em uma placa de Petri coberta e asse a 70 °C por 2 h.

4. Colagem do dispositivo microfluídico

1. Limpe o bloco PDMS (preparado na etapa 2) colando e removendo a fita adesiva disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) duas vezes. Certifique-se de manter o lado limpo virado para cima até o uso.
2. Limpe a lâmina de vidro revestida com PDMS com ar/N₂ pressurizado usando uma pistola de sopro e mantenha o lado limpo voltado para cima.
3. Coloque o bloco PDMS (canais gravados virados para cima) e a lâmina de vidro revestida com PDMS (lado revestido virado para cima) na câmara de vácuo do limpador de plasma (ver Tabela de Materiais).
4. Ligue o vácuo e exponha o conteúdo ao plasma de ar a uma frequência de rádio de 12 MHz (modo RF alto) por 15 s para ativar as superfícies. O plasma de oxigênio pode ser visto na forma de uma tonalidade rosada.
5. Imediatamente após o tratamento com plasma, coloque a lâmina de vidro revestida com PDMS em uma superfície limpa com o lado PDMS voltado para cima. Coloque suavemente o bloco PDMS com o padrão microfluídico agora voltado para a lâmina de vidro revestida com PDMS, permitindo que eles se unam (Figura 2D).
   NOTA: A remoção do ar preso no dispositivo é crucial para garantir a colagem completa.
6. Asse os dispositivos colados a 70 °C durante 2 horas.

5. Funcionalização superficial do dispositivo microfluídico

NOTA: Antes da funcionalização da superfície, é importante calibrar a bomba de pressão de acordo com o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de Materiais) e montar a tubulação para conectá-la ao dispositivo microfluídico.

1. Conectando o dispositivo microfluídico às bombas de pressão
   1. Conecte o controlador de fluxo acionado por pressão a uma fonte de pressão externa (até 6 bares). Pelo menos quatro canais de pressão de ar independentes são necessários: três módulos individuais de 0-2 bar e um módulo de -0,9-4 bar.
   2. Calibrar a bomba de pressão de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de Materiais).
   3. Corte a tubulação (1/16 em OD x 0,02 em ID) em quatro peças de tamanho igual com aproximadamente 20 cm de comprimento.
   4. Insira conectores dobrados de 90° em aço inoxidável de 23 G (consulte a Tabela de Materiais) em uma extremidade de cada peça. Esta extremidade é posteriormente inserida nas três entradas (OA, LO e IA) do dispositivo microfluídico e a quarta é usada para remover o excesso de solução (passo 5.2.5).
   5. Insira a outra extremidade da tubulação no suporte do reservatório microfluídico e sela-a usando conexões microfluídicas, garantindo que a tubulação seja longa o suficiente para tocar o fundo do reservatório (tubos de 1,5 mL, consulte Tabela de Materiais). Isso evita que bolhas de ar indesejadas entrem no dispositivo microfluídico durante o tratamento PVA/produção de lipossomas.
2. Tratamento PVA do canal de saída
   NOTA: Antes da geração de lipossomas, é crucial tornar o dispositivo parcialmente hidrofílico a jusante da junção de produção. Isso é feito tratando esses canais com solução de álcool polivinílico (PVA) a 5% (p/v). A solução de PVA é preparada dissolvendo o pó de PVA (ver Tabela de Materiais) em água a 80 °C durante 3 h com agitação constante utilizando um agitador magnético. Filtrar a solução antes de a utilizar para tratamento de superfície. Imediatamente após a ligação do dispositivo, os canais microfluídicos são hidrofílicos devido à ativação superficial induzida pelo plasma, e gradualmente se tornarão hidrofóbicos novamente. Recomenda-se aguardar 2 h após o cozimento (passo 4.6) antes de iniciar o tratamento com PVA.
   1. Distribuir 200 μL de solução de PVA a 5% p/v em um tubo de 1,5 mL e conectá-lo ao suporte do reservatório microfluídico. Introduzir o tubo (o mencionado no passo 5.1.3) de modo a que uma extremidade fique submersa na solução de PVA e a outra extremidade seja ligada à entrada do canal OA do dispositivo microfluídico.
      NOTA: Uma concentração mais baixa de PVA pode levar à funcionalização superficial abaixo do padrão.
   2. Repita o passo acima sem PVA (tubo vazio de 1,5 mL) e conecte-o aos canais LO e IA.
   3. Aumentar a pressão da fase OA para 100 mbar para escoar a solução de PVA nos canais OA. Aumentar as pressões das fases IA e LO para 120 mbar para evitar o refluxo da solução de PVA no interior desses canais (Figura 2E).
      NOTA: Se necessário, ajuste as pressões dos canais individuais para manter o menisco estável na junção de produção.
   4. Escoar a solução de PVA desta forma por aproximadamente 5 min, garantindo a completa funcionalização do canal de saída.
   5. Para remover a solução de PVA, retire a tubulação da entrada OA e aumente imediatamente a pressão nos canais LO e IA para 2 bar. Simultaneamente, use uma tubulação conectada a um canal de pressão negativa (−900 mbar) para remover o excesso de PVA primeiro do canal de saída e depois da entrada do AA (Figura 2F).
   6. Asse o aparelho a 120 °C por 15 min e deixe esfriar antes de usar. O dispositivo pode ser armazenado em condições ambientais por pelo menos 1 mês.
      NOTA: Recomenda-se aguardar 1 dia (à temperatura ambiente) antes de prosseguir com OLA para garantir que o PDMS não tratado recupere sua hidrofobicidade após o tratamento com plasma.

6. Montagem de lipossomas assistida por octanol (OLA)

1. Preparo do estoque lipídico
   NOTA: Aqui, uma mistura de 1,2-dioloil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) e 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(lissamina rodamina B sulfonil) (Liss Rhod PE) lipídios (ver Tabela de Materiais) são usados como exemplo; Os usuários devem preparar a composição lipídica que precisam de maneira semelhante.
   1. Distribuir 76 μL de DOPC (25 mg/mL) e 16,6 μL de Liss Rhod PE (1 mg/mL) em um balão de fundo redondo usando seringas de vidro separadas.
   2. Mantenha o balão de fundo redondo na posição vertical e utilize uma pistola N₂ comprimida para dar um fluxo suave de azoto para evaporar o clorofórmio e formar uma película lipídica seca no fundo do frasco.
   3. Colocar o balão no exsicador durante, pelo menos, 2 h sob vácuo contínuo para remover qualquer clorofórmio remanescente.
   4. Adicionar 100 μL de etanol no balão de fundo redondo, seguido de pipetagem suave ou agitação para garantir que os lípidos são dissolvidos para formar um stock lipídico de 10% (p/v).
      NOTA: Caso uma determinada composição lipídica não seja completamente solúvel em etanol, use uma mistura etanol/clorofórmio, mantendo o volume de clorofórmio o menor possível.
   5. Pipetar a solução para um frasco para injetáveis de vidro escuro. Lave suavemente o frasco para injetáveis com azoto utilizando uma pistola de sopro para substituir o ar por uma atmosfera inerte. Sele a tampa com película de parafina e armazene a -20 °C.
      NOTA: A solução estoque pode ser usada por até alguns meses. Cada vez que o frasco para injetáveis for aberto, substitua suavemente o ar por azoto e volte a selar com tampa com película de parafina.
2. Preparando as soluções OLA
   1. Faça estoque de soluções dos componentes indispensáveis: dextran 20 mM (Mw 6.000); glicerol 60% (v/v); um buffer de escolha. Neste caso, 5x solução salina tamponada com fosfato (NaCl 0,68 M, KCl 13,5 mM, 50 mM Na 2 HPO 4, 9 mM KH₂PO 4; pH _7,4) foi preparada (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Como o glicerol puro é altamente viscoso, recomenda-se cortar um pequeno pedaço no final da ponta da pipeta de forma inclinada para uma pipetagem eficaz.
   2. Preparar 100 μL de amostras de IA, OA e solução de saída (ES, a solução desejada para encher o EW). Para facilitar a visualização, proteína fluorescente amarela (YFP) foi adicionada à solução IA neste caso em particular. Verificar o equilíbrio osmótico entre o IA e os AO, calculando a osmolaridade dos componentes encapsulados e adicionando uma quantidade adequada de açúcar ou sal no AO, se necessário. Isso é feito para evitar o estouro ou encolhimento dos lipossomas durante a produção.
      OBS: As composições finais das três fases são as seguintes:
      IA: 15% glicerol, 5 mM dextran (Mw 6.000), 5,4 μM YFP, 1x PBS
      OA: 15% glicerol, 5% surfactante F68, 1x PBS
      ES: 15% glicerol, 1x PBS
      Uma menor concentração de surfactante F68 afeta negativamente a geração de emulsões duplas.
   3. Preparar 80 μL da fase LO pipetando 4 μL de lípido reserva em 76 μL de 1-octanol (ver Tabela de Materiais). A concentração final de DOPC é de 5 mg/mL.
   4. Centrifugar as amostras a 700 x g por 60 s para remover quaisquer agregados grandes antes de prosseguir com os experimentos microfluídicos. Isso evita que quaisquer fatores de entupimento óbvios entrem no chip microfluídico.
3. Produção de lipossomas
   1. Distribuir as soluções (IA, LO, OA) em três tubos de 1,5 ml, montá-las (conforme mencionado no passo 5.1) e ligá-las ao chip microfluídico tratado com PVA (passo 5.2.6).
   2. Aplique uma pressão positiva nos três canais: ~100 mbar nos canais IA e LO e ~200 mbar no canal OA.
      NOTA: Como a pressão do AA é maior que as demais, a solução do AA será a primeira a chegar ao EW; isso é altamente recomendado.
   3. Quando a solução de OA atingir EW, diminua a pressão de OA para 100 mbar e aumente o LO para 200 mbar.  A solução LO que chega à junção de produção provavelmente resultará em bolhas de ar por causa do deslocamento de ar dos canais de LO. Uma vez que as bolhas de ar são dispensadas no EW, ajuste a pressão do LO para 100 mbar. Por fim, aumente a pressão IA para 200 mbar e aguarde até que todo o ar no canal IA seja removido. A sequência ideal de chegada à junção das três fases é, portanto, OA, LO e IA.
   4. Depois de remover o ar dos três canais, ajuste todas as pressões do canal para 50 mbar e pipete 10 μL de ES para a câmara de saída. Após pipetar o ES, coloque uma tampa deslizante no orifício de saída para evitar a evaporação. Caso o LO seja empurrado para trás, aumente gradualmente a pressão do LO em incrementos de 1 mbar até que ele comece a fluir para a junção.
   5. Uma vez que todas as três fases comecem a cofluir na junção, assegure-se do início da produção de emulsão dupla e ajuste de acordo com sua qualidade (Figura 3A-C). Mude as pressões gradualmente (passos de 0,1-1 mbar) em vez de abruptamente, a menos que a pressão esteja sendo alterada para eliminar um entupimento indesejado no canal.
      NOTA: Os canais a ajustar dependem do que está acontecendo na junção. Por exemplo, o IA precisa ser diminuído se as emulsões forem muito grandes; o AA precisa ser aumentado se emulsões duplas se formarem, mas estourarem em vez de serem beliscadas; e o LO precisa ser diminuído se a bolsa de octanol for muito grande.
   6. Verifique se as gotículas de emulsão dupla fluem a jusante para EW. À medida que fluem, as bolsas de octanol tornam-se cada vez mais proeminentes e, finalmente, são pinçadas, formando lipossomas (Figura 3D-F). Certifique-se de que o canal de pós-produção seja longo o suficiente e que a migração das emulsões duplas seja lenta o suficiente para a desumectação.
      NOTA: Dentro de minutos após a produção decente, lipossomas e gotículas de octanol sairão do canal de pós-produção e irão para o EW. Como resultado, sendo menos densas que a água, as gotículas octanol flutuam até a superfície do ES. Devido à adição de dextran no IA, os lipossomas são mais pesados que seus arredores e vão para o fundo da câmara prontos para observação e posterior manipulação.

Resultados

Este estudo demonstra a formação de condensados sem membrana através do processo de separação de fase líquido-líquido (LLPS) dentro de lipossomas como um experimento representativo.

Preparo da amostra
O IA, OA, ES e a solução de alimentação (FS) são preparados da seguinte forma:

IA: glicerol a 12%, dextrana 5 mM, KCl 150 mM, poli-L-lisina (PLL) a 5 mg/mL, poli-L-lisina-FITC marcada com 0,05 mg/mL (PLL-FITC), trifosfato de ade...

Discussão

A complexidade celular torna extremamente difícil entender as células vivas quando estudadas como um todo. Reduzir a redundância e a interconectividade das células por meio da reconstituição in vitro dos componentes-chave é necessário para aprofundar o entendimento dos sistemas biológicos e criar mímica celular artificial para aplicações biotecnológicas^22,23,24. Os lipossomas servem como um excelente sistema mínimo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Octanol	Sigma-Aldrich	No. 297887
1.5 mL tubes	Fisher scientific	10451043	Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes
ATP	Sigma-Aldrich	No. A2383
Biopsy punch	Darwin microfluidics	PT-T983-05	0.5 mm and 3 mm diameter
Citrate-base	Sigma-Aldrich	No. 71405
Dextran	Sigma-Aldrich	No. 31388	Mr~6,000
Direct-write optical lithography machine	Durham Magneto Optics Ltd	MicroWriter ML3 Baby	setup and software
DOPC lipid	Avanti	SKU:850375C
F68	Sigma-Aldrich	No. 24040032
Glass cover slip	Corning	#1, 24 x 40 mm
Glycerol	Sigma-Aldrich	No. G2025
Hydrochloric acid	Thermo Scientific Acros	No. 124630010
Liss Rhod PE lipid	Avanti	SKU:810150C
Parafilm	Sigma-Aldrich	No. P7793
Photoresist	Micro resist technology GmbH	EpoCore 10
Photoresist developer	micro resist technology GmbH	mr-Dev 600
Plasma cleaner	Harrick plasma	PDC-32G
Polydimethylsiloxane	Dow	Sylgard 184	PDMS and curing agent
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	No. P7890
Poly-L-lysine–FITC Labeled	Sigma-Aldrich	No. P3543
Polyvinyl alcohol	Sigma-Aldrich	no. P8136	molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed
Pressure controller	Elveflow	OBK1 Mk3+	Flow controller
Scotch tape	Magic Tape Invisible Matt Tape
Silicon wafer	Silicon Materials	0620R16002
Spin coater	Laurell Technologies Corporation	Model WS-650MZ-23NPP
Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers	Darwin microfluidics	PN-BEN-23G
Tris-base	Sigma-Aldrich	No. 252859
Tygon tubing	Darwin microfluidics	1/16" OD x 0.02" ID
UV laser			365 nm wavelength