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* Questi autori hanno contribuito in egual misura
Il presente protocollo descrive l'assemblaggio di liposomi assistiti da ottanolo (OLA), una tecnica microfluidica per generare liposomi biocompatibili. OLA produce liposomi monodispersi di dimensioni micron con un incapsulamento efficiente, consentendo una sperimentazione immediata su chip. Si prevede che questo protocollo sia particolarmente adatto per la biologia sintetica e la ricerca sulle cellule sintetiche.
La microfluidica è uno strumento ampiamente utilizzato per generare goccioline e vescicole di vario tipo in modo controllato e ad alto rendimento. I liposomi sono semplicistiche imitazioni cellulari composte da un interno acquoso circondato da un doppio strato lipidico; Sono preziosi nella progettazione di cellule sintetiche e nella comprensione dei fondamenti delle cellule biologiche in vitro e sono importanti per le scienze applicate, come la consegna del carico per applicazioni terapeutiche. Questo articolo descrive un protocollo di lavoro dettagliato per una tecnica microfluidica su chip, l'assemblaggio di liposomi assistiti da ottanolo (OLA), per produrre liposomi biocompatibili monodispersi, di dimensioni micron. L'OLA funziona in modo simile al soffiaggio delle bolle, in cui una fase acquosa interna (IA) e una fase circostante di 1-ottanolo che trasporta lipidi vengono pizzicate da flussi di fluidi esterni contenenti tensioattivi. Questo genera prontamente goccioline a doppia emulsione con tasche sporgenti di ottanolo. Mentre il doppio strato lipidico si assembla all'interfaccia delle gocce, la tasca si stacca spontaneamente per dare origine a un liposoma unilamellare pronto per ulteriori manipolazioni e sperimentazioni. L'OLA offre diversi vantaggi, come la generazione costante di liposomi (>10 Hz), l'incapsulamento efficiente di biomateriali e le popolazioni di liposomi monodispersi, e richiede volumi di campione molto piccoli (~ 50 μL), che possono essere cruciali quando si lavora con preziosi biologici. Lo studio include dettagli sulla microfabbricazione, la litografia morbida e la passivazione superficiale, necessari per stabilire la tecnologia OLA in laboratorio. Un'applicazione di biologia sintetica proof-of-principle è anche mostrata inducendo la formazione di condensati biomolecolari all'interno dei liposomi attraverso il flusso protonico transmembrana. Si prevede che questo protocollo video di accompagnamento faciliterà i lettori a stabilire e risolvere i problemi OLA nei loro laboratori.
Tutte le cellule hanno una membrana plasmatica come confine fisico, e questa membrana è essenzialmente un'impalcatura sotto forma di un doppio strato lipidico formato dall'auto-assemblaggio di molecole lipidiche anfifiliche. I liposomi sono le controparti sintetiche minime delle cellule biologiche; Hanno un lume acquoso circondato da fosfolipidi, che formano un doppio strato lipidico con i gruppi di testa idrofili rivolti verso la fase acquosa e le code idrofobiche sepolte verso l'interno. La stabilità dei liposomi è governata dall'effetto idrofobico, così come dall'idrofilia tra i gruppi polari, dalle forze di van der Waals tra le code di carbonio idrofobiche e dal l....
1. Fabbricazione del master wafer
Questo studio dimostra la formazione di condensati senza membrana attraverso il processo di separazione di fase liquido-liquido (LLPS) all'interno dei liposomi come esperimento rappresentativo.
Preparazione del campione
L'IA, l'OA, l'ES e la soluzione di alimentazione (FS) sono preparati come segue:
IA: 12% glicerolo, 5 mM destrano, 150 mM KCl, 5 mg/mL poli-L-lisina (PLL), 0,05 mg/mL poli-L-lisina-FITC marcato (PLL-FITC), 8 mM adenosina .......
La complessità cellulare rende estremamente difficile comprendere le cellule viventi quando studiate nel loro insieme. Ridurre la ridondanza e l'interconnettività delle cellule ricostituendo i componenti chiave in vitro è necessario per approfondire la nostra comprensione dei sistemi biologici e creare imitazioni cellulari artificiali per applicazioni biotecnologiche22,23,24. I liposomi servono come un eccellente sistema mini.......
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Vorremmo ringraziare Dolf Weijers, Vera Gorelova e Mark Roosjen per averci gentilmente fornito YFP. S.D. riconosce il sostegno finanziario del Consiglio olandese delle ricerche (numero di sovvenzione: OCENW. KLEIN.465).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-Octanol | Sigma-Aldrich | No. 297887 | |
1.5 mL tubes | Fisher scientific | 10451043 | Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes |
ATP | Sigma-Aldrich | No. A2383 | |
Biopsy punch | Darwin microfluidics | PT-T983-05 | 0.5 mm and 3 mm diameter |
Citrate-base | Sigma-Aldrich | No. 71405 | |
Dextran | Sigma-Aldrich | No. 31388 | Mr~6,000 |
Direct-write optical lithography machine | Durham Magneto Optics Ltd | MicroWriter ML3 Baby | setup and software |
DOPC lipid | Avanti | SKU:850375C | |
F68 | Sigma-Aldrich | No. 24040032 | |
Glass cover slip | Corning | #1, 24 x 40 mm | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | No. G2025 | |
Hydrochloric acid | Thermo Scientific Acros | No. 124630010 | |
Liss Rhod PE lipid | Avanti | SKU:810150C | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | No. P7793 | |
Photoresist | Micro resist technology GmbH | EpoCore 10 | |
Photoresist developer | micro resist technology GmbH | mr-Dev 600 | |
Plasma cleaner | Harrick plasma | PDC-32G | |
Polydimethylsiloxane | Dow | Sylgard 184 | PDMS and curing agent |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | No. P7890 | |
Poly-L-lysine–FITC Labeled | Sigma-Aldrich | No. P3543 | |
Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | no. P8136 | molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed |
Pressure controller | Elveflow | OBK1 Mk3+ | Flow controller |
Scotch tape | Magic Tape Invisible Matt Tape | ||
Silicon wafer | Silicon Materials | 0620R16002 | |
Spin coater | Laurell Technologies Corporation | Model WS-650MZ-23NPP | |
Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers | Darwin microfluidics | PN-BEN-23G | |
Tris-base | Sigma-Aldrich | No. 252859 | |
Tygon tubing | Darwin microfluidics | 1/16" OD x 0.02" ID | |
UV laser | 365 nm wavelength |
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