Assemblaggio di liposomi assistiti da ottanolo su chip per la bioingegneria

Riepilogo

Il presente protocollo descrive l'assemblaggio di liposomi assistiti da ottanolo (OLA), una tecnica microfluidica per generare liposomi biocompatibili. OLA produce liposomi monodispersi di dimensioni micron con un incapsulamento efficiente, consentendo una sperimentazione immediata su chip. Si prevede che questo protocollo sia particolarmente adatto per la biologia sintetica e la ricerca sulle cellule sintetiche.

Abstract

La microfluidica è uno strumento ampiamente utilizzato per generare goccioline e vescicole di vario tipo in modo controllato e ad alto rendimento. I liposomi sono semplicistiche imitazioni cellulari composte da un interno acquoso circondato da un doppio strato lipidico; Sono preziosi nella progettazione di cellule sintetiche e nella comprensione dei fondamenti delle cellule biologiche in vitro e sono importanti per le scienze applicate, come la consegna del carico per applicazioni terapeutiche. Questo articolo descrive un protocollo di lavoro dettagliato per una tecnica microfluidica su chip, l'assemblaggio di liposomi assistiti da ottanolo (OLA), per produrre liposomi biocompatibili monodispersi, di dimensioni micron. L'OLA funziona in modo simile al soffiaggio delle bolle, in cui una fase acquosa interna (IA) e una fase circostante di 1-ottanolo che trasporta lipidi vengono pizzicate da flussi di fluidi esterni contenenti tensioattivi. Questo genera prontamente goccioline a doppia emulsione con tasche sporgenti di ottanolo. Mentre il doppio strato lipidico si assembla all'interfaccia delle gocce, la tasca si stacca spontaneamente per dare origine a un liposoma unilamellare pronto per ulteriori manipolazioni e sperimentazioni. L'OLA offre diversi vantaggi, come la generazione costante di liposomi (>10 Hz), l'incapsulamento efficiente di biomateriali e le popolazioni di liposomi monodispersi, e richiede volumi di campione molto piccoli (~ 50 μL), che possono essere cruciali quando si lavora con preziosi biologici. Lo studio include dettagli sulla microfabbricazione, la litografia morbida e la passivazione superficiale, necessari per stabilire la tecnologia OLA in laboratorio. Un'applicazione di biologia sintetica proof-of-principle è anche mostrata inducendo la formazione di condensati biomolecolari all'interno dei liposomi attraverso il flusso protonico transmembrana. Si prevede che questo protocollo video di accompagnamento faciliterà i lettori a stabilire e risolvere i problemi OLA nei loro laboratori.

Introduzione

Tutte le cellule hanno una membrana plasmatica come confine fisico, e questa membrana è essenzialmente un'impalcatura sotto forma di un doppio strato lipidico formato dall'auto-assemblaggio di molecole lipidiche anfifiliche. I liposomi sono le controparti sintetiche minime delle cellule biologiche; Hanno un lume acquoso circondato da fosfolipidi, che formano un doppio strato lipidico con i gruppi di testa idrofili rivolti verso la fase acquosa e le code idrofobiche sepolte verso l'interno. La stabilità dei liposomi è governata dall'effetto idrofobico, così come dall'idrofilia tra i gruppi polari, dalle forze di van der Waals tra le code di carbonio idrofobiche e dal l....

Protocollo

1. Fabbricazione del master wafer

1. Prendi un wafer di silicio pulito da 4 pollici (10 cm) di diametro (vedi Tabella dei materiali). Pulirlo ulteriormente utilizzando aria pressurizzata per rimuovere eventuali particelle di polvere.
2. Montare il wafer su un rivestimento rotante e erogare delicatamente ~ 5 ml di un fotoresist negativo (vedi Tabella dei materiali) al centro del wafer. Cerca di evitare bolle d'aria, poiché potrebbero interferire con il processo di stampa a valle del wafer.
3. Per ottenere uno strato di fotoresist spesso 10 μm, rivestire il wafer a 500 giri/min per 30 s con un'accel....

Risultati

Questo studio dimostra la formazione di condensati senza membrana attraverso il processo di separazione di fase liquido-liquido (LLPS) all'interno dei liposomi come esperimento rappresentativo.

Preparazione del campione
L'IA, l'OA, l'ES e la soluzione di alimentazione (FS) sono preparati come segue:

IA: 12% glicerolo, 5 mM destrano, 150 mM KCl, 5 mg/mL poli-L-lisina (PLL), 0,05 mg/mL poli-L-lisina-FITC marcato (PLL-FITC), 8 mM adenosina .......

Discussione

La complessità cellulare rende estremamente difficile comprendere le cellule viventi quando studiate nel loro insieme. Ridurre la ridondanza e l'interconnettività delle cellule ricostituendo i componenti chiave in vitro è necessario per approfondire la nostra comprensione dei sistemi biologici e creare imitazioni cellulari artificiali per applicazioni biotecnologiche^22,23,24. I liposomi servono come un eccellente sistema mini.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Octanol	Sigma-Aldrich	No. 297887
1.5 mL tubes	Fisher scientific	10451043	Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes
ATP	Sigma-Aldrich	No. A2383
Biopsy punch	Darwin microfluidics	PT-T983-05	0.5 mm and 3 mm diameter
Citrate-base	Sigma-Aldrich	No. 71405
Dextran	Sigma-Aldrich	No. 31388	Mr~6,000
Direct-write optical lithography machine	Durham Magneto Optics Ltd	MicroWriter ML3 Baby	setup and software
DOPC lipid	Avanti	SKU:850375C
F68	Sigma-Aldrich	No. 24040032
Glass cover slip	Corning	#1, 24 x 40 mm
Glycerol	Sigma-Aldrich	No. G2025
Hydrochloric acid	Thermo Scientific Acros	No. 124630010
Liss Rhod PE lipid	Avanti	SKU:810150C
Parafilm	Sigma-Aldrich	No. P7793
Photoresist	Micro resist technology GmbH	EpoCore 10
Photoresist developer	micro resist technology GmbH	mr-Dev 600
Plasma cleaner	Harrick plasma	PDC-32G
Polydimethylsiloxane	Dow	Sylgard 184	PDMS and curing agent
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	No. P7890
Poly-L-lysine–FITC Labeled	Sigma-Aldrich	No. P3543
Polyvinyl alcohol	Sigma-Aldrich	no. P8136	molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed
Pressure controller	Elveflow	OBK1 Mk3+	Flow controller
Scotch tape	Magic Tape Invisible Matt Tape
Silicon wafer	Silicon Materials	0620R16002
Spin coater	Laurell Technologies Corporation	Model WS-650MZ-23NPP
Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers	Darwin microfluidics	PN-BEN-23G
Tris-base	Sigma-Aldrich	No. 252859
Tygon tubing	Darwin microfluidics	1/16" OD x 0.02" ID
UV laser			365 nm wavelength