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* Questi autori hanno contribuito in egual misura
Il presente protocollo descrive l'assemblaggio di liposomi assistiti da ottanolo (OLA), una tecnica microfluidica per generare liposomi biocompatibili. OLA produce liposomi monodispersi di dimensioni micron con un incapsulamento efficiente, consentendo una sperimentazione immediata su chip. Si prevede che questo protocollo sia particolarmente adatto per la biologia sintetica e la ricerca sulle cellule sintetiche.
La microfluidica è uno strumento ampiamente utilizzato per generare goccioline e vescicole di vario tipo in modo controllato e ad alto rendimento. I liposomi sono semplicistiche imitazioni cellulari composte da un interno acquoso circondato da un doppio strato lipidico; Sono preziosi nella progettazione di cellule sintetiche e nella comprensione dei fondamenti delle cellule biologiche in vitro e sono importanti per le scienze applicate, come la consegna del carico per applicazioni terapeutiche. Questo articolo descrive un protocollo di lavoro dettagliato per una tecnica microfluidica su chip, l'assemblaggio di liposomi assistiti da ottanolo (OLA), per produrre liposomi biocompatibili monodispersi, di dimensioni micron. L'OLA funziona in modo simile al soffiaggio delle bolle, in cui una fase acquosa interna (IA) e una fase circostante di 1-ottanolo che trasporta lipidi vengono pizzicate da flussi di fluidi esterni contenenti tensioattivi. Questo genera prontamente goccioline a doppia emulsione con tasche sporgenti di ottanolo. Mentre il doppio strato lipidico si assembla all'interfaccia delle gocce, la tasca si stacca spontaneamente per dare origine a un liposoma unilamellare pronto per ulteriori manipolazioni e sperimentazioni. L'OLA offre diversi vantaggi, come la generazione costante di liposomi (>10 Hz), l'incapsulamento efficiente di biomateriali e le popolazioni di liposomi monodispersi, e richiede volumi di campione molto piccoli (~ 50 μL), che possono essere cruciali quando si lavora con preziosi biologici. Lo studio include dettagli sulla microfabbricazione, la litografia morbida e la passivazione superficiale, necessari per stabilire la tecnologia OLA in laboratorio. Un'applicazione di biologia sintetica proof-of-principle è anche mostrata inducendo la formazione di condensati biomolecolari all'interno dei liposomi attraverso il flusso protonico transmembrana. Si prevede che questo protocollo video di accompagnamento faciliterà i lettori a stabilire e risolvere i problemi OLA nei loro laboratori.
Tutte le cellule hanno una membrana plasmatica come confine fisico, e questa membrana è essenzialmente un'impalcatura sotto forma di un doppio strato lipidico formato dall'auto-assemblaggio di molecole lipidiche anfifiliche. I liposomi sono le controparti sintetiche minime delle cellule biologiche; Hanno un lume acquoso circondato da fosfolipidi, che formano un doppio strato lipidico con i gruppi di testa idrofili rivolti verso la fase acquosa e le code idrofobiche sepolte verso l'interno. La stabilità dei liposomi è governata dall'effetto idrofobico, così come dall'idrofilia tra i gruppi polari, dalle forze di van der Waals tra le code di carbonio idrofobiche e dal legame idrogeno tra le molecole d'acqua e le teste idrofile 1,2. A seconda del numero di doppi strati lipidici, i liposomi possono essere classificati in due categorie principali, vale a dire vescicole unilamellari che comprendono un singolo doppio strato e vescicole multilamellari costruite da più doppi strati. Le vescicole unilamellari sono ulteriormente classificate in base alle loro dimensioni. Tipicamente di forma sferica, possono essere prodotte in una varietà di dimensioni, tra cui piccole vescicole unilamellari (SUV, diametro 30-100 nm), grandi vescicole unilamellari (LUV, diametro 100-1.000 nm) e, infine, vescicole unilamellari giganti (GUV, diametro >1.000 nm)3,4. Sono state sviluppate varie tecniche per produrre liposomi, e queste possono essere categorizzate ampiamente in tecniche di massa5 e tecniche microfluidiche6. Le tecniche di massa comunemente praticate includono la reidratazione del film lipidico, l'elettroformazione, il trasferimento di emulsione invertita e l'estrusione 7,8,9,10. Queste tecniche sono relativamente semplici ed efficaci, e queste sono le ragioni principali per il loro uso diffuso nella comunità della biologia sintetica. Tuttavia, allo stesso tempo, soffrono di gravi inconvenienti per quanto riguarda la polidispersità delle dimensioni, la mancanza di controllo sulla lamellarità e la bassa efficienza di incapsulamento 7,11. Tecniche come l'incapsulamento continuo dell'incrocio dell'interfaccia delle gocce (cDICE)12 e il tiro delle gocce e la filtrazione dimensionale (DSSF)13 superano in una certa misura queste limitazioni.
Gli approcci microfluidici sono saliti alla ribalta nell'ultimo decennio. La tecnologia microfluidica fornisce un ambiente controllabile per la manipolazione dei flussi di fluidi all'interno di microcanali definiti dall'utente grazie al caratteristico flusso laminare e al trasferimento di massa dominato dalla diffusione. I dispositivi lab-on-a-chip risultanti offrono possibilità uniche per il controllo spaziotemporale delle molecole, con volumi di campione significativamente ridotti e capacità di multiplexing14. Sono stati sviluppati numerosi metodi microfluidici per produrre liposomi, tra cui getto pulsato 15, doppia emulsione templante 16, espulsione transitoria della membrana 17, trasferimento di emulsione di goccioline18 e focalizzazione idrodinamica 19. Queste tecniche producono liposomi monodispersi, unilamellari, delle dimensioni di cellule con elevata efficienza di incapsulamento e alta produttività.
Questo articolo descrive in dettaglio la procedura per l'assemblaggio di liposomi assistiti da ottanolo (OLA), un metodo microfluidico su chip basato sul pinch-off idrodinamico e sul successivo meccanismo di deumidificazione con solvente20 (Figura 1). Si può mettere in relazione il funzionamento dell'OLA con un processo di soffiaggio delle bolle. Una giunzione a sei vie focalizza la fase acquosa interna (IA), due flussi organici che trasportano lipidi (LO) e due flussi acquosi esterni (OA) contenenti tensioattivi in un singolo punto. Ciò si traduce in goccioline di doppia emulsione acqua-in-(lipidi + ottanolo)-in-acqua. Mentre queste goccioline fluiscono a valle, la minimizzazione dell'energia interfacciale, il flusso di taglio esterno e l'interazione con le pareti del canale portano alla formazione di un doppio strato lipidico all'interfaccia quando la tasca del solvente si stacca, formando così liposomi unilamellari. A seconda delle dimensioni della tasca di ottanolo, il processo di deumidificazione può richiedere da decine di secondi a un paio di minuti. Alla fine del canale di uscita, le goccioline di ottanolo meno dense galleggiano in superficie, mentre i liposomi più pesanti (a causa di una soluzione incapsulata più densa) affondano sul fondo della camera di visualizzazione pronti per la sperimentazione. Come esperimento rappresentativo, viene dimostrato il processo di separazione di fase liquido-liquido (LLPS) all'interno dei liposomi. Per questo, i componenti richiesti sono incapsulati all'interno di liposomi a un pH acido che impedisce LLPS. Innescando esternamente un cambiamento di pH e, quindi, un flusso protonico transmembrana, si formano goccioline di condensa separate dalla fase all'interno dei liposomi. Ciò evidenzia le effettive capacità di incapsulamento e manipolazione del sistema OLA.
1. Fabbricazione del master wafer
2. Preparazione del dispositivo microfluidico
3. Realizzare la diapositiva in vetro rivestito PDMS
4. Incollaggio del dispositivo microfluidico
5. Funzionalizzazione superficiale del dispositivo microfluidico
NOTA: Prima della funzionalizzazione della superficie, è importante calibrare la pompa di pressione secondo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali) e assemblare il tubo per collegarlo al dispositivo microfluidico.
6. Assemblaggio liposomico assistito da ottanolo (OLA)
Questo studio dimostra la formazione di condensati senza membrana attraverso il processo di separazione di fase liquido-liquido (LLPS) all'interno dei liposomi come esperimento rappresentativo.
Preparazione del campione
L'IA, l'OA, l'ES e la soluzione di alimentazione (FS) sono preparati come segue:
IA: 12% glicerolo, 5 mM destrano, 150 mM KCl, 5 mg/mL poli-L-lisina (PLL), 0,05 mg/mL poli-L-lisina-FITC marcato (PLL-FITC), 8 mM adenosina ...
La complessità cellulare rende estremamente difficile comprendere le cellule viventi quando studiate nel loro insieme. Ridurre la ridondanza e l'interconnettività delle cellule ricostituendo i componenti chiave in vitro è necessario per approfondire la nostra comprensione dei sistemi biologici e creare imitazioni cellulari artificiali per applicazioni biotecnologiche22,23,24. I liposomi servono come un eccellente sistema mini...
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Vorremmo ringraziare Dolf Weijers, Vera Gorelova e Mark Roosjen per averci gentilmente fornito YFP. S.D. riconosce il sostegno finanziario del Consiglio olandese delle ricerche (numero di sovvenzione: OCENW. KLEIN.465).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-Octanol | Sigma-Aldrich | No. 297887 | |
1.5 mL tubes | Fisher scientific | 10451043 | Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes |
ATP | Sigma-Aldrich | No. A2383 | |
Biopsy punch | Darwin microfluidics | PT-T983-05 | 0.5 mm and 3 mm diameter |
Citrate-base | Sigma-Aldrich | No. 71405 | |
Dextran | Sigma-Aldrich | No. 31388 | Mr~6,000 |
Direct-write optical lithography machine | Durham Magneto Optics Ltd | MicroWriter ML3 Baby | setup and software |
DOPC lipid | Avanti | SKU:850375C | |
F68 | Sigma-Aldrich | No. 24040032 | |
Glass cover slip | Corning | #1, 24 x 40 mm | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | No. G2025 | |
Hydrochloric acid | Thermo Scientific Acros | No. 124630010 | |
Liss Rhod PE lipid | Avanti | SKU:810150C | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | No. P7793 | |
Photoresist | Micro resist technology GmbH | EpoCore 10 | |
Photoresist developer | micro resist technology GmbH | mr-Dev 600 | |
Plasma cleaner | Harrick plasma | PDC-32G | |
Polydimethylsiloxane | Dow | Sylgard 184 | PDMS and curing agent |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | No. P7890 | |
Poly-L-lysine–FITC Labeled | Sigma-Aldrich | No. P3543 | |
Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | no. P8136 | molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed |
Pressure controller | Elveflow | OBK1 Mk3+ | Flow controller |
Scotch tape | Magic Tape Invisible Matt Tape | ||
Silicon wafer | Silicon Materials | 0620R16002 | |
Spin coater | Laurell Technologies Corporation | Model WS-650MZ-23NPP | |
Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers | Darwin microfluidics | PN-BEN-23G | |
Tris-base | Sigma-Aldrich | No. 252859 | |
Tygon tubing | Darwin microfluidics | 1/16" OD x 0.02" ID | |
UV laser | 365 nm wavelength |
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