JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم بروتوكولا لفحص الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تسلسل عالي الإنتاجية (ATAC-seq) على وجه التحديد على الخلايا الشحمية باستخدام فرز النواة مع الأنسجة الدهنية المعزولة من الفئران المراسلة المعدلة وراثيا مع وضع العلامات الفلورية النووية.

Abstract

يعد فحص الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع التسلسل عالي الإنتاجية (ATAC-seq) تقنية قوية تتيح تنميط إمكانية الوصول إلى الكروماتين على مستوى الجينوم. كانت هذه التقنية مفيدة لفهم الآليات التنظيمية للتعبير الجيني في مجموعة من العمليات البيولوجية. على الرغم من تعديل ATAC-seq لأنواع مختلفة من العينات ، لم تكن هناك تعديلات فعالة لطرق ATAC-seq للأنسجة الدهنية. تشمل التحديات التي تواجه الأنسجة الدهنية عدم التجانس الخلوي المعقد ، ومحتوى الدهون الكبير ، والتلوث العالي للميتوكوندريا. للتغلب على هذه المشاكل ، قمنا بتطوير بروتوكول يسمح ب ATAC-seq الخاص بالخلايا الشحمية من خلال استخدام فرز النواة المنشطة بالفلورة مع الأنسجة الدهنية من المراسل المعدل وراثيا وضع العلامات النووية وترجمة فأر تنقية تقارب الريبوسوم (NuTRAP). ينتج هذا البروتوكول بيانات عالية الجودة مع الحد الأدنى من قراءات التسلسل المهدرة مع تقليل كمية مدخلات النواة والكواشف. تقدم هذه الورقة إرشادات مفصلة خطوة بخطوة لطريقة ATAC-seq التي تم التحقق من صحتها لاستخدام نوى الخلايا الشحمية المعزولة من الأنسجة الدهنية للفئران. سيساعد هذا البروتوكول في التحقيق في ديناميكيات الكروماتين في الخلايا الشحمية عند المحفزات البيولوجية المتنوعة ، مما سيسمح برؤى بيولوجية جديدة.

Introduction

الأنسجة الدهنية ، المتخصصة في تخزين الطاقة الزائدة في شكل جزيئات دهنية ، هي عضو رئيسي لتنظيم التمثيل الغذائي. يعد التحكم الصارم في تكوين الخلايا الشحمية وصيانتها أمرا حيويا لوظيفة الأنسجة الدهنية وتوازن طاقة الجسم بالكامل1. تلعب العديد من منظمات النسخ دورا مهما في التحكم في تمايز الخلايا الشحمية واللدونة والوظيفة. بعض هذه المنظمات متورطة في اضطرابات التمثيل الغذائي لدى البشر 2,3. سهلت التطورات الحديثة في تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية للتعبير الجيني والتحليل فوق الجيني اكتشاف المنظمين الجزيئيين لبيولوجيا الخلايا الشحمية4. من الصعب إجراء دراسات التنميط الجزيئي باستخدام الأنسجة الدهنية بسبب عدم تجانس هذه الأنسجة. تتكون الأنسجة الدهنية بشكل أساسي من الخلايا الشحمية ، المسؤولة عن تخزين الدهون ، ولكنها تحتوي أيضا على أنواع مختلفة من الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا الليفية والخلايا البطانية والخلايا المناعية5. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تغيير التركيب الخلوي للأنسجة الدهنية بشكل كبير استجابة للتغيرات الفيزيولوجية المرضية مثل درجة الحرارة والحالة التغذوية6. للتغلب على هذه المشاكل ، قمنا سابقا بتطوير فأر مراسل معدل وراثيا ، يسمى الوسم النووي وترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (NuTRAP) ، والذي ينتج الريبوسومات الموسومة ب GFP ونوى البيوتينيل الموسومة ب mCherry بطريقة تعتمد على Crerecombinase 7. يمكن نظام وضع العلامات المزدوجة المرء من إجراء تحليل نسخي وفوق جيني خاص بنوع الخلية مع الأنسجة. باستخدام فئران NuTRAP المتقاطعة مع خطوط adiponectin-Cre الخاصة بالخلايا الشحمية (Adipoq-NuTRAP) ، قمنا سابقا بتمييز ملفات تعريف التعبير الجيني وحالات الكروماتين من مجموعات الخلايا الدهنية النقية في الجسم الحي وحددنا كيفية تغييرها أثناء السمنة 7,8. في السابق ، عبرت الفئران NuTRAP مع خطوط Ucp1-Cre الخاصة بالخلايا الشحمية البنية والبيج (Ucp1-NuTRAP) سمحت لنا بتوصيف إعادة تشكيل epigenomic لسكان الخلايا الدهنية الحرارية النادرة ، الخلايا الشحمية البيج ، استجابة للتغيرات في درجات الحرارة9.

ATAC-seq هي طريقة تحليلية مستخدمة على نطاق واسع لتقييم إمكانية الوصول إلى الكروماتين على مستوى الجينوم. يسمح ترانسبوزاز Tn5 شديد التفاعل المستخدم في ATAC-seq بتحديد مناطق الكروماتين المفتوحة عن طريق وضع علامات على محولات التسلسل في المنطقة التي يمكن الوصول إليها من الكروماتين في النوى10. ATAC-seq هي طريقة بسيطة ، لكنها توفر نتائج قوية وكفاءة عالية حتى مع عينات منخفضة المدخلات. وبالتالي ، فقد أصبحت واحدة من أكثر طرق التنميط فوق الجيني شيوعا وساهمت في فهم الآليات التنظيمية للتعبير الجيني في سياقات بيولوجية متنوعة. منذ إنشاء بروتوكول ATAC-seq الأصلي ، تم تطوير العديد من التقنيات المشتقة من ATAC لتعديل وتحسين البروتوكول لأنواع مختلفة من العينات. على سبيل المثال ، تم تصميم Fast-ATAC لتحليل عينات خلايا الدم11 ، و Omni-ATAC هو بروتوكول محسن لعينات الأنسجة المجمدة12 ، و MiniATAC-seq فعال لتحليل الأجنة في المراحل المبكرة13. ومع ذلك ، فإن تطبيق طريقة ATAC-seq على الخلايا الشحمية ، وخاصة من عينات الأنسجة ، لا يزال يمثل تحديا. بالإضافة إلى عدم تجانس الأنسجة الدهنية ، قد يتداخل محتواها العالي من الدهون مع تفاعلات إعادة التركيب الفعالة بواسطة ترانسبوزاز Tn5 حتى بعد عزل النواة. علاوة على ذلك ، فإن المحتوى العالي من الميتوكوندريا في الخلايا الشحمية ، خاصة في الخلايا الشحمية البنية والبيج ، يسبب تلوثا عاليا للحمض النووي للميتوكوندريا وقراءات تسلسل مهدرة. تصف هذه الورقة بروتوكولا ل ATAC-seq الخاص بالخلايا الشحمية باستخدام فئران Adipoq-NuTRAP (الشكل 1). من خلال الاستفادة من فرز النواة المسمى بالفلورة ، يسمح هذا البروتوكول بجمع مجموعات نقية من نوى الخلايا الشحمية بعيدا عن أنواع الخلايا المربكة الأخرى والإزالة الفعالة للدهون والميتوكوندريا وحطام الأنسجة. وبالتالي ، يمكن لهذا البروتوكول إنشاء بيانات عالية الجودة خاصة بنوع الخلية وتقليل النفايات من قراءات الميتوكوندريا أثناء استخدام كمية أقل من المدخلات والكواشف مقارنة بالبروتوكول القياسي.

Protocol

تم إجراء رعاية الحيوان والتجريب وفقا للإجراءات المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في كلية الطب بجامعة إنديانا.

1. الاستعدادات قبل بدء التجربة

  1. تحضير الأنسجة
    1. لوضع العلامات على نواة الخلايا الشحمية ، قم بعبور الفئران NuTRAP مع خطوط adiponectin-Cre الخاصة بالخلايا الشحمية (Adipoq-Cre) لتوليد فئران Adipoq-NuTRAP ، والتي تكون نصف متماثلة لكل من Adipoq-Cre و NuTRAP.
    2. تشريح الأنسجة الدهنية ذات الأهمية من الفئران Adipoq-NuTRAP كما هو موضح سابقا14.
    3. قم بتجميد الأنسجة في النيتروجين السائل ، وقم بتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: يمكن تخزين كل وسادة دهنية ككل ، ويمكن قطع الأنسجة المجمدة لاحقا على الثلج الجاف إلى قطع أصغر (~ 50 مجم) لإجراء التجارب. بدلا من ذلك ، يمكن قطع الأنسجة الدهنية وتجميدها وتجميدها في أنابيب للتخزين (~ 50 مجم لكل أنبوب). لا يسمح أبدا للعينات المجمدة بالذوبان بعد التجميد حتى الاستخدام.
  2. إعداد العازلة
    ملاحظة: احتفظ بالمخازن المؤقتة على الجليد طوال التجربة.
    1. تحضير المخزن المؤقت لإعداد النواة (NPB): 250 mM السكروز ، 10 mM HEPES (درجة الحموضة 7.5) ، 10 mM KCl ، 1.5 mM MgCl2 ، و 0.1٪ NP40. تحضير 7 مل من NPB لكل عينة. أضف كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني 100x (النهائي 1x) ، DTT (النهائي 1 mM) ، و Hoechst (النهائي 1 ميكروغرام / مل) إلى NPB قبل الاستخدام.
      ملاحظة: يوصى بإعداد NPB طازج ، ولكن يمكن تخزينه في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
    2. تحضير 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات مع 0.1٪ NP-40 (PBS-N).

2. عزل النواة

  1. زجاج التبريد ترتد المجانسات ، مع كوب واحد ترتد لكل عينة ، على الجليد. ثم أضف 7 مل من مزيج NPB إلى كل كوب Dounce.
    ملاحظة: يوصى باستخدام ما يصل إلى ثماني عينات في كل تجربة. إن العمل مع أكثر من ثماني عينات من شأنه أن يؤخر بشكل كبير جميع الخطوات ، وقد يقلل بشكل خاص من جودة النواة أثناء الفرز.
  2. ضع الأنسجة الدهنية المجمدة (50-100 ملغ) في الزجاج Dounce ، وقم بتقطيعها على الفور إلى بضع قطع أصغر باستخدام مقص طويل. السكتة الدماغية 10x مع مدقة فضفاضة لجميع العينات ، ثم 10x مع مدقة ضيقة.
    ملاحظة: الأنسجة الدهنية ناعمة ، لذا يجب أن يكون تقطيعها إلى بضع قطع صغيرة كافيا. بالنسبة للعينات النادرة ، يمكن استخدام قطع أصغر (10-20 مجم) ، على الرغم من أن عدد نواة الخلايا الشحمية التي تم جمعها قد يختلف.
  3. قم بالتصفية من خلال مصفاة 100 ميكرومتر في أنبوب جديد سعة 50 مل. انقل التجانسات المفلترة إلى أنبوب جديد سعة 15 مل عن طريق الصب. تدور عند 200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي متأرجح. إزالة طاف قدر الإمكان.
    ملاحظة: نضح أولا باستخدام فراغ، ثم قم بإزالة وحدة التخزين المتبقية باستخدام ماصة ميكروية.
  4. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من PBS-N عن طريق النقر بإصبع لطيف ولكن شامل.
    ملاحظة: تجنب سحب الخاصات، لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف النوى.
  5. قم بالتصفية من خلال مصفاة 40 ميكرومتر في أنبوب جديد سعة 50 مل باستخدام ماصة لطيفة. شطف مصفاة مع 250 ميكرولتر من PBS-N. انقل إعادة التعليق النووي المصفى إلى أنبوب فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) باستخدام ماصة ميكروية.
    ملاحظة: إذا كان ذلك متاحا ، يمكن استخدام الأنابيب ومصافي الخلايا لأحجام أصغر لتقليل فقد العينة.

3. فرز النواة

  1. إعداد أنبوب التجميع
    1. أضف 500 ميكرولتر من PBS-N إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 مل ، واقلبها عدة مرات لتبليل جميع الأسطح الداخلية بالتخزين المؤقت.
    2. قم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة لإسقاط كل السائل ، ثم قم بتبريدها على الجليد حتى الفرز.
  2. FACS (الشكل 2)
    1. استخدم بوابة FSC-A / FSC-H للمفردات و FSC-A / SSC-A لإزالة الحطام الصغير أو الكبير.
    2. بوابة لسكان نواة الخلايا الشحمية الإيجابية mCherry / GFP.
    3. اجمع 10000 نواة في كل أنبوب من أنابيب التجميع المعدة في الخطوة 3.1.
  3. تحضير نواة ما بعد الفرز
    1. أضف 500 ميكرولتر من PBS-N إلى كل أنبوب تجميع ، واقلبه عدة مرات للخلط.
    2. قم بتدوير أنابيب التجميع عند 200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي متأرجح. تماما إزالة طاف.
      ملاحظة: استخدم مكنسة كهربائية أولا لإزالة الفقاعات ، واسكب المادة الطافية ، واستخدم مناديل ورقية لإزالة السائل المتبقي تماما. الحبيبات غير مرئية في هذه المرحلة. قم بإعداد الخليط الرئيسي Tn5 أثناء خطوة الطرد المركزي كما هو موضح أدناه.

4. علامات Tn5 (الجدول 1)

  1. لتحضير 25 ميكرولتر من الخليط الرئيسي Tn5 ، امزج 12.5 ميكرولتر من محلول الحمض النووي للعلامات 2x (TD buffer) ، و 1.25 ميكرولتر من Tn5 transposase (إنزيم TDE I) ، و 11.25 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز.
  2. أضف 25 ميكرولتر من الخليط الرئيسي Tn5 إلى كل نواة بيليه ، وأعد تعليقها عن طريق السحب اللطيف. احتضان في 600 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية باستخدام خلاط حراري.

5. تنقية الحمض النووي

ملاحظة: يستخدم الإجراء التالي مجموعة تنقية PCR المذكورة في جدول المواد. يمكن استخدام أي طرق أخرى مماثلة لتنقية الحمض النووي.

  1. أضف 25 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز إلى 25 ميكرولتر من خليط إعادة تعليق نواة Tn5 الذي تم الحصول عليه بعد الخطوة 4.2. الحجم النهائي هو 50 ميكرولتر لكل عينة.
  2. أضف 250 ميكرولتر من PB المخزن المؤقت.
  3. أضف 5 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم 3 M (NaOAc) (درجة الحموضة 5.2).
  4. انقل الخليط إلى عمود (مرفق مع المجموعة المرجعية) ، وأجهزة الطرد المركزي عند 17900 × جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  5. تخلص من التدفق ، وضع عمود الدوران مرة أخرى في نفس أنبوب التجميع. أضف 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت PE المحتوي على الإيثانول المطلق (EtOH) ، وأجهزة الطرد المركزي عند 17,900 × جم لمدة 1 دقيقة في RT.
  6. تخلص من التدفق ، وضع عمود الدوران مرة أخرى في نفس أنبوب التجميع. أجهزة الطرد المركزي في 17900 × غرام لمدة 1 دقيقة في RT ، وتجاهل أنبوب التجميع مع التدفق.
  7. لاستئصال شظايا الحمض النووي ، جهز العمود بأنبوب جديد سعة 1.5 مل ، وأضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت EB ، واتركه في RT لمدة 3 دقائق. أجهزة الطرد المركزي في 17900 × غرام لمدة 1 دقيقة في RT.
    ملاحظة: يمكن تخزين العينات في درجة حرارة 4 درجات مئوية لعدة أيام أو عند -20 درجة مئوية لأسابيع.

6. تضخيم PCR (الجدول 2)

ملاحظة: يتم سرد الاشعال المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 3.

  1. لتضخيم شظايا الحمض النووي المنقولة ، قم بإعداد خليط PCR الرئيسي دون إضافة برايمر تشفير شريطي Ad2.n فريد (التمهيدي # 2). استخدم 38 ميكرولتر من الخليط الرئيسي PCR لكل عينة: 11 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، 2 ميكرولتر من 25 ميكرومتر Ad1_noMX التمهيدي (التمهيدي #1) ، و 25 ميكرولتر من 2x PCR Master Mix.
  2. أضف 38 ميكرولتر من خليط PCR الرئيسي في أنبوب PCR سعة 0.2 مل.
  3. أضف 10 ميكرولتر من شظايا الحمض النووي المستخلصة من الخطوة 5.7.
  4. أضف 2 ميكرولتر من 25 ميكرومتر التمهيدي # 2 ، والذي يجب أن يكون محددا لكل عينة.
  5. قم بتشغيل PCR وفقا لظروف ركوب الدراجات الموضحة في الجدول 2.

7. اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qPCR) (الجدول 4)

ملاحظة: تهدف هذه الخطوة إلى تحديد الدورات الإضافية اللازمة لتضخيم الحمض النووي. إنه اختياري ولكن يوصى به بشدة ، خاصة للتجارب الجديدة.

  1. تحضير خليط qPCR الرئيسي دون إضافة التمهيدي # 2. استخدم 9.975 ميكرولتر من الخليط الرئيسي qPCR لكل عينة: 4.41 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، 0.25 ميكرولتر من 25 ميكرومتر التمهيدي # 1 ، 5 ميكرولتر من 2x PCR Master Mix ، و 0.09 ميكرولتر 100x SYBR Green I.
    ملاحظة: لتحضير 100x SYBR Green I ، قم بتخفيف مخزون 10000x بالماء الخالي من النيوكلياز. نظرا لأن حجم 100x SYBR Green الذي استخدمته للخليط الرئيسي qPCR لا يكاد يذكر ، فمن الأسهل عمل خليط رئيسي إضافي من 100x SYBR Green I المخفف (على سبيل المثال ، ل 8-10 عينات).
  2. أضف 9.975 ميكرولتر من الخليط الرئيسي qPCR في كل بئر من لوحة qPCR.
  3. أضف 0.25 ميكرولتر من 25 ميكرومتر التمهيدي # 2 في كل بئر.
    ملاحظة: تأكد من إضافة نفس التمهيدي # 2 لمطابقة ما تمت إضافته إلى كل عينة محددة في الخطوة 6.4.
  4. أضف 5 ميكرولتر من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي تم الحصول عليه بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في الخطوة 6.5 ، واخلطه عن طريق الماصة.
    ملاحظة: سيتم استخدام 45 ميكرولتر المتبقية من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني.
  5. قم بتشغيل qPCR وفقا لظروف ركوب الدراجات الموضحة في الجدول 5.
  6. تحقق من منحنيات التضخيم ، وحدد عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل الإضافية المطلوبة من خلال تقدير عدد الدورات التي وصلت ~ 35٪ من الحد الأقصى (الشكل 3 أ).
    ملاحظة: عادة ، تتطلب 10000 نواة من خمس إلى ثماني دورات PCR إضافية.

8. تضخيم PCR إضافي

  1. قم بتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام كل ال 45 ميكرولتر المتبقية من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل وفقا للحسابات من الخطوة 7.6 (الجدول 6).
    ملاحظة: قد تتطلب كل عينة عددا مختلفا من دورات التضخيم.

9. تنقية الحمض النووي الثانية باستخدام مجموعة تنقية PCR

  1. استخدم نفس الإجراءات كما في القسم 5 ، ولكن قم بإزالة شظايا الحمض النووي المضخمة ب 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت EB.

10. اختيار حجم جزء الحمض النووي

ملاحظة: استخدم حبات تثبيت عكسية ذات طور صلب ، كما هو موضح أدناه. يمكن استخدام أي حبات أخرى مماثلة لتنقية الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يجب إعادة تعليق تعليق حبة SPRI بالكامل وموازنتها عند RT مع الدوران قبل الاستخدام.

  1. انقل الحمض النووي المستخلص إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الجديد ، وأضف 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت EB لعمل حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر.
  2. أضف 55 ميكرولتر من حبات SPRI (حجم عينة 0.55x) ، واخلطها عن طريق الماصة. احتضان لمدة 5 دقائق في RT ، ثم افصله على حامل مغناطيسي صغير لشرائط PCR ذات 8 أنابيب لمدة 5 دقائق.
  3. نقل 150 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب PCR جديد. أضف 95 ميكرولتر من حبات SPRI ، واخلطها عن طريق الماصة.
    ملاحظة: يحتوي العنصر الطافي على حمض نووي يبلغ حوالي 500 نقطة أساس أو أصغر.
  4. احتضان لمدة 5 دقائق في RT ، ثم افصلها على الحامل المغناطيسي الصغير لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية بعناية.
  5. اغسل الخرز لمدة 1 دقيقة مع 200 ميكرولتر من 70٪ EtOH. كرر مرتين لمدة ثلاث غسلات في المجموع.
    ملاحظة: لا تحرك أنابيب PCR من الحامل المغناطيسي أثناء الغسيل.
  6. بعد الغسيل النهائي ، قم بتدوير الأنابيب عند 1000 × جم لمدة دقيقة واحدة ، وقم بسحب EtOH المتبقي. جفف الحبيبات مع فتح الغطاء عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة على جهاز PCR.
    ملاحظة: يجب أن تعرض كريات الخرز بعض الشقوق الطفيفة فقط بمجرد تجفيفها. تجنب الإفراط في التجفيف.
  7. أعد تعليق الحبيبات ب 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت EB عن طريق السحب ، واحتضانها لمدة 5 دقائق في RT. افصلها على الحامل المغناطيسي الصغير لمدة 5 دقائق ، ثم انقل 18 ميكرولتر من المادة الطافية التي تحتوي على المكتبة النهائية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
    ملاحظة يمكن تخزين المكتبة في -20 درجة مئوية أثناء إجراء فحص الجودة.

11. قياس كمية الحمض النووي باستخدام مقياس الفلور

  1. لتحضير الخليط الرئيسي ، قم بتخفيف كاشف 200x dsDNA عالي الحساسية (HS) باستخدام المخزن المؤقت dsDNA HS إلى تركيز نهائي قدره 1x.
  2. بالنسبة للمعايير ، أضف 190 ميكرولتر من الخليط الرئيسي 1x و 10 ميكرولتر من المعيار 1 أو المعيار 2 إلى أنبوب مقياس الفلور.
    ملاحظة: قم بموازنة المعايير في RT في الظلام قبل البدء في القياس الكمي.
  3. بالنسبة لعينات المكتبة ، أضف 198 ميكرولتر من الخليط الرئيسي 1x و 2 ميكرولتر من كل عينة إلى أنبوب مقياس فلوري منفصل.
    ملاحظة: إذا كانت كميات العينة محدودة ، فيمكن تقليل حجم العينة إلى 1 ميكرولتر ، ويمكن زيادة حجم الخليط الرئيسي 1x إلى 199 ميكرولتر.
  4. دوامة أو هز أنابيب الفلورومتر ، واتركها تجلس لمدة 5 دقائق في RT في الظلام. قم بقياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقايسة dsDNA HS لمقياس الفلورومتر.

12. فحص جودة المكتبة بواسطة أنظمة الرحلان الكهربائي عالية الحساسية

  1. خذ مكتبة ATAC-seq ، وقم بتخفيفها بالماء الخالي من النيوكلياز إلى تركيز نهائي يبلغ 1-5 نانوغرام / ميكرولتر.
  2. تحليل توزيع حجم مكتبات ATAC-seq باستخدام أنظمة الرحلان الكهربائي الآلية عالية الحساسية التي تتبع بروتوكولات الشركة المصنعة.

13. فحص جودة مكتبة ATAC-seq باستخدام qPCR المستهدف

  1. خذ 5-10 نانوغرام من مكتبة ATAC-seq ، وقم بتخفيفها ب 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز.
  2. قم بتشغيل qPCR باستخدام الباشيلي الذي يستهدف المروجين والمعززات المعروفة بأنها نشطة في الخلايا الشحمية وفقا لظروف الدورة المشار إليها في الجدول 7.
  3. استخدم بادئات التحكم السلبية التي تستهدف المناطق الجينومية المغلقة / الصامتة (الجدول 7).
  4. احسب إثراء المروج / المعززات على الضوابط السلبية (الجدول 8).
    ملاحظة: من المتوقع أن نرى ≥10-20 ضعفا مع عينات ناجحة.

14. التسلسل

  1. أرسل مكتبات ATAC-seq للتسلسل. استخدم تسلسل النهاية المزدوجة (2 × 34 نقطة أساس ، 2 × 50 نقطة أساس أو أكثر) بمتوسط أرقام قراءة يتراوح بين 10 و 30 مليون قراءة لكل عينة.

النتائج

لتحليل الأنسجة الدهنية باستخدام بروتوكول ATAC-seq هذا ، قمنا بإنشاء فئران Adipoq-NuTRAP التي تم تغذيتها على وجبات الطعام. ثم قمنا بعزل نوى الخلايا الشحمية من الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية (eWAT) والأنسجة الدهنية البيضاء الأربية (iWAT) والأنسجة الدهنية البنية (BAT) باستخدام قياس التدفق الخلوي. تم استخد...

Discussion

في هذه الورقة ، قدمنا بروتوكول ATAC-seq محسن لتقييم إمكانية الوصول إلى الكروماتين الخاص بالخلايا الشحمية في الجسم الحي. نجح بروتوكول ATAC-seq هذا باستخدام ماوس Adipoq-NuTRAP في إنشاء ملفات تعريف إمكانية الوصول إلى الكروماتين الخاصة بالخلايا الشحمية. العامل الأكثر أهمية لتجارب ATAC-seq الناجحة والقا?...

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية ذات صلة أو مادية تتعلق بالبحث الموصوف في هذه الورقة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل الصندوق الاستئماني لأبحاث IUSM Showalter (إلى HCR) ، وهو مركز IUSM لمرض السكري وأمراض التمثيل الغذائي التجريبي ومنحة الجدوى (إلى HCR) ، والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (R01DK129289 إلى HCR) ، وجائزة أعضاء هيئة التدريس المبتدئين لجمعية السكري الأمريكية (7-21-JDF-056 إلى HCR).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Animals
Adiponectin-Cre mouseThe Jackson Laboratory28020
NuTRAP mouseThe Jackson Laboratory29899
Reagents & Materials
1.5 mL DNA-LoBind tubesEppendorf86-923
100 µm cell strainerFalcon352-360
15 mL tubesVWR525-1071
2x TD bufferIllumina15027866
384-well PCR plateApplied biosystem4483285
40 µm cell strainerFalcon352-340
50 mL tubesVWR525-1077
AMPure XP reagent (SPRI beads)Beckman CoulterA63881
Bioanalyzer High Sensitivity DNA kitAgilent Technologies5067-4626
Clear adhesive filmApplied biosystem4306311
DNase/RNase-free distilled waterInvitrogen10977015
Dounce tissue grinderDWK Life Sciences357542
DTTSigmaD9779
DynaMag-96 side skirted magnetThermo Fishers12027
FACS tubesFalcon 28719128
HEPESBoston BioProductsBBH-75
Hoechst 33342Invitrogen2134015
KCl (2 M)Boston BioProductsMT-252
Magnetic separation rack for PCR 8-tube stripsEpiCypher10-0008
MgCl2 (1 M)Boston BioProductsMT-200
MinElute PCR purification kitQiagen28004
NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mixBioLabsM0541S
NP40Thermo Fishers28324
PCR 8-tube stripUSA scientific1402-4708
Protease inhibitor cocktail (100x)Thermo Fishers78439
Qubit dsDNA HS assay kitInvitrogenQ32851
SucroseSigmaS0389-1KG
SYBR Green I (10,000x)InvitrogenS7563
TDE I enzymeIllumina15027865
Instruments
Flow cytometerBD BiosciencesFACSAria Fusion
Qubit fluorometerInvitrogenQ33226
Real-Time PCR systemThermo FishersQuantStudio?5

References

  1. Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
  2. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
  3. Bielczyk-Maczynska, E. White adipocyte plasticity in physiology and disease. Cells. 8 (12), 1507 (2019).
  4. Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies. Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).
  5. Esteve Rafols, M. Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity. Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).
  6. Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications. Experimental and Molecular Medicine. 48, e215 (2016).
  7. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  8. Roh, H. C., et al. Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPARγ activity and elevated TGFβ-SMAD signaling. Molecular Metabolism. 42, 101086 (2020).
  9. Roh, H. C., et al. Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity. Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).
  10. Buenrostro, J. D., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  11. Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
  12. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  13. Wu, J., et al. Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA. Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).
  14. Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
  15. So, J., et al. Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility. Molecular Metabolism. 66, 101619 (2022).
  16. Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing. STAR Protocols. 2 (3), 100805 (2021).
  17. Heyward, F. D., et al. Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin's hunger-suppressing effects. bioRxiv. , (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved