ATAC-Seq específico de adipocitos con tejidos adiposos mediante clasificación de núcleos activados por fluorescencia

Resumen

Presentamos un protocolo para el ensayo de cromatina accesible a transposasa con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) específicamente en adipocitos utilizando clasificación de núcleos con tejidos adiposos aislados de ratones reporteros transgénicos con marcado de fluorescencia nuclear.

Resumen

El ensayo para cromatina accesible a transposasa con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) es una técnica robusta que permite la elaboración de perfiles de accesibilidad de cromatina en todo el genoma. Esta técnica ha sido útil para comprender los mecanismos reguladores de la expresión génica en una variedad de procesos biológicos. Aunque ATAC-seq se ha modificado para diferentes tipos de muestras, no ha habido modificaciones efectivas de los métodos ATAC-seq para tejidos adiposos. Los desafíos con los tejidos adiposos incluyen la compleja heterogeneidad celular, el gran contenido de lípidos y la alta contaminación mitocondrial. Para superar estos problemas, hemos desarrollado un protocolo que permite ATAC-seq específico de adipocitos mediante el empleo de la clasificación de núcleos activados por fluorescencia con tejidos adiposos del ratón transgénico reportero Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP). Este protocolo produce datos de alta calidad con lecturas de secuenciación desperdiciadas mínimas al tiempo que reduce la cantidad de entrada de núcleo y reactivos. Este documento proporciona instrucciones detalladas paso a paso para el método ATAC-seq validado para el uso de núcleos de adipocitos aislados de tejidos adiposos de ratón. Este protocolo ayudará en la investigación de la dinámica de la cromatina en adipocitos sobre diversas estimulaciones biológicas, lo que permitirá nuevos conocimientos biológicos.

Introducción

El tejido adiposo, que está especializado para almacenar el exceso de energía en forma de moléculas lipídicas, es un órgano clave para la regulación metabólica. El control estricto de la formación y mantenimiento de los adipocitos es vital para la función del tejido adiposo y la homeostasis energética de todo el cuerpo¹. Muchos reguladores transcripcionales desempeñan un papel crítico en el control de la diferenciación, plasticidad y función de los adipocitos; Algunos de estos reguladores están implicados en trastornos metabólicos en humanos ^2,3. Los avances recientes en técnicas de secuenciación de alto rendimiento para la expresión génica y el análisis epigenómico han facilitado aún más el descubrimiento de los reguladores moleculares de la biología de los adipocitos⁴. Los estudios de perfiles moleculares que utilizan tejidos adiposos son difíciles de realizar debido a la heterogeneidad de estos tejidos. El tejido adiposo consiste principalmente en adipocitos, que son responsables del almacenamiento de grasa, pero también contiene varios otros tipos de células, como fibroblastos, células endoteliales y células inmunes⁵. Además, la composición celular del tejido adiposo se altera dramáticamente en respuesta a cambios fisiopatológicos como la temperatura y el estado nutricional⁶. Para superar estos problemas, previamente desarrollamos un ratón reportero transgénico, llamado Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), que produce ribosomas marcados con GFP y núcleos biotinilados marcados con mCherry de una manera dependiente de la recombinasa Cre⁷. El sistema de doble etiquetado permite realizar análisis transcriptómicos y epigenómicos específicos del tipo de célula con tejidos. Utilizando ratones NuTRAP cruzados con líneas adiponectina-Cre específicas de adipocitos (Adipoq-NuTRAP), previamente caracterizamos perfiles de expresión génica y estados de cromatina de poblaciones de adipocitos puros in vivo y determinamos cómo se alteran durante la obesidad ^7,8. Anteriormente, los ratones NuTRAP cruzados con líneas Ucp1-Cre específicas de adipocitos marrones y beige (Ucp1-NuTRAP) nos permitieron caracterizar la remodelación epigenómica de la rara población de adipocitos termogénicos, los adipocitos beige, en respuesta a los cambios de temperatura⁹.

ATAC-seq es un método analítico ampliamente utilizado para evaluar la accesibilidad de la cromatina en todo el genoma. La transposasa Tn5 hiperreactiva utilizada en ATAC-seq permite la identificación de regiones de cromatina abiertas mediante el etiquetado de adaptadores de secuenciación en la región accesible a la cromatina de los núcleos¹⁰. ATAC-seq es un método simple, pero proporciona resultados robustos y es altamente eficiente incluso con muestras de baja entrada. Por lo tanto, se ha convertido en uno de los métodos de perfil epigenómico más populares y ha contribuido a la comprensión de los mecanismos reguladores de la expresión génica en diversos contextos biológicos. Desde que se creó el protocolo ATAC-seq original, se han desarrollado varias técnicas derivadas de ATAC-seq para modificar y optimizar el protocolo para varios tipos de muestras. Por ejemplo, Fast-ATAC está diseñado para analizar muestras de células sanguíneas¹¹, Omni-ATAC es un protocolo optimizado para muestras de tejido congelado 12 y MiniATAC-seq es eficaz para el análisis de embriones en etapa temprana¹³. Sin embargo, la aplicación del método ATAC-seq a los adipocitos, especialmente de muestras de tejido, sigue siendo un desafío. Además de la heterogeneidad del tejido adiposo, su alto contenido de lípidos puede interferir con reacciones de recombinación eficientes por la transposasa Tn5 incluso después del aislamiento del núcleo. Además, el alto contenido mitocondrial en los adipocitos, particularmente en los adipocitos marrones y beige, causa una alta contaminación del ADN mitocondrial y lecturas de secuenciación desperdiciadas. Este artículo describe un protocolo para ATAC-seq específico de adipocitos utilizando ratones Adipoq-NuTRAP (Figura 1). Al aprovechar la clasificación de núcleos marcados con fluorescencia, este protocolo permite la recolección de poblaciones puras de núcleos de adipocitos lejos de otros tipos de células de confusión y la eliminación eficiente de lípidos, mitocondrias y restos de tejidos. Por lo tanto, este protocolo puede generar datos de alta calidad específicos del tipo de célula y minimizar el desperdicio de las lecturas mitocondriales mientras se utiliza una cantidad reducida de entrada y reactivos en comparación con el protocolo estándar.

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Protocolo

El cuidado y la experimentación de los animales se realizaron de acuerdo con los procedimientos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Indiana.

1. Preparativos antes de comenzar el experimento

1. Preparación de tejidos
   1. Para el etiquetado del núcleo de los adipocitos, cruce ratones NuTRAP con líneas de adiponectina-Cre específicas de adipocitos (Adipoq-Cre) para generar ratones Adipoq-NuTRAP, que son hemicigotos tanto para Adipoq-Cre como para NuTRAP.
   2. Diseccionar los tejidos adiposos de interés de los ratones Adipoq-NuTRAP como se describió anteriormente¹⁴.
   3. Congele los tejidos en nitrógeno líquido y guárdelos a -80 °C hasta su uso.
      NOTA: Cada almohadilla de grasa se puede almacenar como un todo, y los tejidos congelados se pueden cortar más tarde en hielo seco en trozos más pequeños (~ 50 mg) para experimentos. Alternativamente, los tejidos grasos se pueden cortar, alícuota y congelar en tubos para su almacenamiento (~ 50 mg por tubo). Nunca se permite que las muestras congeladas se descongelen después de congelarlas hasta su uso.
2. Preparación del tampón
   NOTA: Mantenga los tampones en hielo durante todo el experimento.
   1. Preparar tampón de preparación del núcleo (NPB): 250 mM de sacarosa, 10 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂ y 0.1% NP40. Preparar 7 mL de NPB por muestra. Agregue un cóctel fresco de inhibidores de la proteasa 100x (1x final), DTT (1 mM final) y Hoechst (1 μg/ml final) al NPB antes de usarlo.
      NOTA: Se recomienda preparar NPB fresco, pero se puede almacenar a 4 °C hasta por 1 mes.
   2. Prepare 1x solución salina tamponada con fosfato con NP-40 al 0,1% (PBS-N).

2. Aislamiento del núcleo

1. Homogeneizadores de vidrio Chill Dounce, con un vidrio Dounce por muestra, sobre hielo. Luego, agregue 7 ml de la mezcla NPB a cada vaso Dounce.
   NOTA: Se recomienda utilizar hasta ocho muestras en cada experimento. Trabajar con más de ocho muestras retrasaría significativamente todos los pasos, y puede degradar especialmente la calidad del núcleo durante la clasificación.
2. Coloque el tejido adiposo congelado (50-100 mg) en el vaso y córtelo inmediatamente en unos trozos más pequeños con un par de tijeras largas. Carrera 10x con un mortero suelto para todas las muestras, y luego 10x con un mortero apretado.
   NOTA: Los tejidos adiposos son blandos, por lo que cortarlos en unos pocos trozos pequeños debería ser suficiente. Para muestras raras, se pueden usar piezas más pequeñas (10-20 mg), aunque el número de núcleos de adipocitos recolectados puede variar.
3. Filtrar a través de un filtro de 100 μm en un nuevo tubo de 50 ml. Mueva los homogeneizados filtrados a un nuevo tubo de 15 ml vertiéndolos. Girar a 200 × g durante 10 min a 4 °C en una centrífuga de cubo oscilante. Retire el sobrenadante tanto como sea posible.
   NOTA: Aspirar primero con una aspiradora y, a continuación, extraer el volumen restante con una micropipeta.
4. Resuspender el pellet en 500 μL de PBS-N golpeando suavemente pero minuciosamente los dedos.
   NOTA: Evite el pipeteo, ya que esto puede dañar los núcleos.
5. Filtrar a través de un filtro de 40 μm en un nuevo tubo de 50 ml utilizando un pipeteo suave. Enjuague el colador con 250 μL de PBS-N. Transfiera la resuspensión nuclear filtrada a un tubo de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando una micropipeta.
   NOTA: Si están disponibles, se pueden usar tubos y filtros celulares para volúmenes más pequeños para minimizar la pérdida de muestra.

3. Clasificación de núcleos

1. Preparación del tubo de recolección
   1. Agregue 500 μL de PBS-N a los tubos nuevos de 1.5 ml e invierta varias veces para humedecer todas las superficies internas con el tampón.
   2. Gire brevemente los tubos para bajar todo el líquido y luego enfríelos en hielo hasta que se clasifiquen.
2. FACS (Figura 2)
   1. Utilice la puerta FSC-A/FSC-H para singletes y FSC-A/SSC-A para la eliminación de residuos pequeños o grandes.
   2. Puerta para la población de núcleos de adipocitos mCherry/GFP-positivos.
   3. Recolectar 10.000 núcleos en cada uno de los tubos de recolección preparados en el paso 3.1.
3. Preparación del núcleo posterior a la clasificación
   1. Agregue 500 μL de PBS-N a cada tubo de recolección e invierta varias veces para mezclar.
   2. Girar los tubos de recogida a 200 × g durante 10 min a 4 °C en una centrífuga de cubo oscilante. Retire completamente el sobrenadante.
      NOTA: Use una aspiradora primero para eliminar las burbujas, vierta el sobrenadante y use toallitas de papel para eliminar el líquido restante por completo. El pellet es invisible en este punto. Prepare la mezcla maestra Tn5 durante la etapa de centrifugación como se describe a continuación.

4. Etiquetado Tn5 (Tabla 1)

1. Para preparar 25 μL de mezcla maestra de Tn5, mezcle 12,5 μL de tampón de ADN de etiquetado 2x (tampón TD), 1,25 μL de transposasa Tn5 (enzima TDE I) y 11,25 μL de agua libre de nucleasa.
2. Añadir 25 μL de mezcla maestra de Tn5 a cada pellet de núcleo, y resuspender mediante un pipeteo suave. Incubar a 600 rpm durante 30 min a 37 °C utilizando un termomezclador.

5. Purificación del ADN

NOTA: El siguiente procedimiento utiliza el kit de purificación de PCR mencionado en la Tabla de materiales. Se puede utilizar cualquier otro método similar de purificación del ADN.

1. Añadir 25 μL de agua libre de nucleasas a los 25 μL de la mezcla de resuspensión del núcleo Tn5 obtenida tras la etapa 4.2. El volumen final es de 50 μL por muestra.
2. Añadir 250 μL de tampón PB.
3. Añadir 5 μL de acetato de sodio 3 M (NaOAc) (pH 5.2).
4. Transfiera la mezcla a una columna (suministrada con el kit de referencia) y centrifugar a 17.900 × g durante 1 minuto a temperatura ambiente (RT).
5. Deseche el flujo y vuelva a colocar la columna de centrifugado en el mismo tubo de recolección. Añadir 750 μL de PE tampón que contenga etanol absoluto (EtOH) y centrifugar a 17.900 × g durante 1 min a RT.
6. Deseche el flujo y vuelva a colocar la columna de centrifugado en el mismo tubo de recolección. Centrifugar a 17.900 × g durante 1 min a RT, y desechar el tubo de recolección con el caudal.
7. Para eluyir los fragmentos de ADN, equipe la columna con un nuevo tubo de 1,5 ml, agregue 10 μL de tampón EB y déjelo en RT durante 3 minutos. Centrifugadora a 17.900 × g durante 1 min a RT.
   NOTA: Las muestras pueden almacenarse a 4 °C durante días o a -20 °C durante semanas.

6. Amplificación por PCR (Tabla 2)

NOTA: Los cebadores utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 3.

1. Para amplificar los fragmentos de ADN transpuestos, prepare la mezcla maestra de PCR sin agregar un cebador de código de barras Ad2.n único (cebador # 2). Utilice 38 μL de la mezcla maestra de PCR por muestra: 11 μL de agua libre de nucleasa, 2 μL de 25 μM Ad1_noMX cebador (cebador #1) y 25 μL de 2x PCR Master Mix.
2. Añadir 38 μL de la mezcla maestra de PCR en un tubo de PCR de 0,2 ml.
3. Añadir 10 μL de los fragmentos de ADN eluyentes del paso 5.7.
4. Agregue 2 μL de cebador #2 de 25 μM, que debe ser específico para cada muestra.
5. Ejecutar la PCR de acuerdo con las condiciones de ciclismo indicadas en la Tabla 2.

7. Prueba de PCR cuantitativa (qPCR) en tiempo real (Tabla 4)

NOTA: Este paso tiene como objetivo determinar los ciclos adicionales necesarios para amplificar el ADN. Es opcional pero muy recomendable, especialmente para nuevos experimentos.

1. Prepare la mezcla maestra de qPCR sin agregar la imprimación # 2. Utilice 9.975 μL de la mezcla maestra de qPCR por muestra: 4.41 μL de agua libre de nucleasa, 0.25 μL de 25 μM cebador #1, 5 μL de 2x PCR Master Mix y 0.09 μL 100x SYBR Green I.
   NOTA: Para preparar 100x SYBR Green I, diluya el caldo 10,000x con agua libre de nucleasa. Como el volumen de 100x SYBR Green I utilizado para la mezcla maestra de qPCR es insignificante, es más fácil hacer una mezcla maestra adicional de 100x SYBR Green I diluido (por ejemplo, para 8-10 muestras).
2. Agregue 9.975 μL de la mezcla maestra de qPCR en cada pocillo de una placa de qPCR.
3. Agregue 0.25 μL de cebador #2 de 25 μM en cada pocillo.
   NOTA: Asegúrese de agregar el mismo cebador #2 para que coincida con lo que se agregó a cada muestra específica en el paso 6.4.
4. Añadir 5 μL de la reacción de PCR obtenida tras la amplificación por PCR en el paso 6.5, y mezclar por pipeteo.
   NOTA: Los 45 μL restantes de la reacción de PCR se utilizarán para la segunda amplificación por PCR.
5. Ejecutar la qPCR de acuerdo con las condiciones de ciclismo indicadas en la Tabla 5.
6. Verifique las curvas de amplificación e identifique el número de ciclos de PCR adicionales necesarios estimando el número de ciclos que alcanzaron ~ 35% del máximo (Figura 3A).
   NOTA: Normalmente, 10.000 núcleos requieren de cinco a ocho ciclos de PCR adicionales.

8. Amplificación adicional de PCR

1. Ejecute la PCR utilizando todos los 45 μL restantes de la reacción de PCR de acuerdo con los cálculos del paso 7.6 (Tabla 6).
   NOTA: Cada muestra podría requerir un número diferente de ciclos de amplificación.

9. Segunda purificación del ADN utilizando el kit de purificación por PCR

1. Utilice los mismos procedimientos que en la sección 5, pero eluya los fragmentos de ADN amplificados con 20 μL de tampón EB.

10. Selección del tamaño del fragmento de ADN

NOTA: Utilice perlas de inmovilización reversibles en fase sólida, como se describe a continuación. Cualquier otra perla de purificación de ADN similar se puede utilizar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La suspensión de perlas SPRI debe resuspenderse completamente y equilibrarse en RT con rotación antes de su uso.

1. Transfiera el ADN eluyido a un nuevo tubo de PCR y agregue 80 μL de EB tampón para hacer un volumen final de 100 μL.
2. Añadir 55 μL de perlas SPRI (0,55x volumen de muestra) y mezclar por pipeteo. Incubar durante 5 min en RT, y luego separar en un mini soporte magnético para tiras de PCR de 8 tubos durante 5 min.
3. Transfiera 150 μL del sobrenadante a un nuevo tubo de PCR. Añadir 95 μL de perlas SPRI y mezclar por pipeteo.
   NOTA: El sobrenadante contiene ADN de aproximadamente 500 pb o menos.
4. Incubar durante 5 minutos en RT, y luego separar en el mini soporte magnético durante 5 min. Deseche el sobrenadante cuidadosamente.
5. Lave las perlas durante 1 minuto con 200 μL de EtOH al 70%. Repita dos veces para tres lavados en total.
   NOTA: No mueva los tubos de PCR del soporte magnético durante los lavados.
6. Después del lavado final, gire los tubos a 1.000 × g durante 1 minuto y elimine el EtOH restante. Secar el pellet con la tapa abierta a 37 °C durante 2 min en una máquina de PCR.
   NOTA: Los gránulos de cuentas deben mostrar solo algunas grietas menores una vez secas. Evite el secado excesivo.
7. Resuspender el pellet con 20 μL de tampón EB mediante pipeteo e incubar durante 5 min a RT. Separar en el mini soporte magnético durante 5 min, y luego transferir 18 μL del sobrenadante que contiene la biblioteca final a un nuevo tubo de 1,5 ml.
   NOTA La biblioteca se puede almacenar a -20 °C mientras se realiza un control de calidad.

11. Cuantificación del ADN mediante un fluorómetro

1. Para preparar la mezcla maestra, diluya el reactivo de alta sensibilidad (HS) 200x dsDNA con tampón dsDNA HS hasta una concentración final de 1x.
2. Para los estándares, agregue 190 μL de la mezcla maestra 1x y 10 μL de la mezcla estándar 1 o estándar 2 a un tubo fluorómetro.
   NOTA: Equilibre los estándares en RT en la oscuridad antes de comenzar la cuantificación.
3. Para las muestras de la biblioteca, agregue 198 μL de la mezcla maestra 1x y 2 μL de cada muestra a un tubo fluorómetro separado.
   NOTA: Si las cantidades de muestra son limitadas, el volumen de muestra puede reducirse a 1 μL, y el volumen de mezcla maestra 1x puede aumentarse a 199 μL.
4. Vortex o agite los tubos fluorómetros, y déjelos reposar durante 5 minutos en RT en la oscuridad. Mida la concentración de ADN utilizando el ensayo dsDNA HS del fluorómetro.

12. Control de calidad de la biblioteca mediante sistemas de electroforesis de alta sensibilidad

1. Tome la biblioteca ATAC-seq y diluya con agua libre de nucleasas hasta una concentración final de 1-5 ng / μL.
2. Analice la distribución de tamaños de las bibliotecas ATAC-seq utilizando sistemas de electroforesis automatizados de alta sensibilidad siguiendo los protocolos del fabricante.

13. Control de calidad de la biblioteca ATAC-seq mediante qPCR dirigida

1. Tome 5-10 ng de la biblioteca ATAC-seq y diluya con 50 μL de agua libre de nucleasa.
2. Ejecutar la qPCR utilizando cebadores dirigidos a los promotores y potenciadores conocidos por ser activos en los adipocitos de acuerdo con las condiciones de ciclo indicadas en la Tabla 7.
3. Utilizar cebadores de control negativo dirigidos a regiones genómicas cerradas/silenciosas (Tabla 7).
4. Calcular el enriquecimiento del promotor/potenciador sobre los controles negativos (Tabla 8).
   NOTA: Se espera ver enriquecimientos de ≥ 10-20 veces con muestras exitosas.

14. Secuenciación

1. Envíe las bibliotecas ATAC-seq para su secuenciación. Utilice la secuenciación de extremo pareado (2 x 34 pb, 2 x 50 pb o más) con números de lectura promedio de 10-30 millones de lecturas por muestra.

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Resultados

Para analizar el tejido adiposo utilizando este protocolo ATAC-seq, generamos ratones Adipoq-NuTRAP que fueron alimentados con dietas de comida; luego aislamos núcleos de adipocitos del tejido adiposo blanco epididimario (eWAT), tejido adiposo blanco inguinal (iWAT) y tejido adiposo marrón (BAT) mediante citometría de flujo. Los núcleos aislados se utilizaron para el marcado, seguido de purificación de ADN, amplificación por PCR, pasos de control de calidad, secuenciación y análisis de datos, como se describió a...

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Discusión

En este trabajo, hemos presentado un protocolo ATAC-seq optimizado para evaluar la accesibilidad de la cromatina específica de adipocitos in vivo. Este protocolo ATAC-seq que utiliza el ratón Adipoq-NuTRAP generó con éxito perfiles de accesibilidad de cromatina específicos de adipocitos. El factor más crítico para los experimentos ATAC-seq exitosos y reproducibles es la calidad del núcleo. Es fundamental congelar inmediatamente los tejidos adiposos disecados en nitrógeno líquido y almacenarlos de forma...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals
Adiponectin-Cre mouse	The Jackson Laboratory	28020
NuTRAP mouse	The Jackson Laboratory	29899
Reagents & Materials
1.5 mL DNA-LoBind tubes	Eppendorf	86-923
100 µm cell strainer	Falcon	352-360
15 mL tubes	VWR	525-1071
2x TD buffer	Illumina	15027866
384-well PCR plate	Applied biosystem	4483285
40 µm cell strainer	Falcon	352-340
50 mL tubes	VWR	525-1077
AMPure XP reagent (SPRI beads)	Beckman Coulter	A63881
Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit	Agilent Technologies	5067-4626
Clear adhesive film	Applied biosystem	4306311
DNase/RNase-free distilled water	Invitrogen	10977015
Dounce tissue grinder	DWK Life Sciences	357542
DTT	Sigma	D9779
DynaMag-96 side skirted magnet	Thermo Fishers	12027
FACS tubes	Falcon	28719128
HEPES	Boston BioProducts	BBH-75
Hoechst 33342	Invitrogen	2134015
KCl (2 M)	Boston BioProducts	MT-252
Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips	EpiCypher	10-0008
MgCl2 (1 M)	Boston BioProducts	MT-200
MinElute PCR purification kit	Qiagen	28004
NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix	BioLabs	M0541S
NP40	Thermo Fishers	28324
PCR 8-tube strip	USA scientific	1402-4708
Protease inhibitor cocktail (100x)	Thermo Fishers	78439
Qubit dsDNA HS assay kit	Invitrogen	Q32851
Sucrose	Sigma	S0389-1KG
SYBR Green I (10,000x)	Invitrogen	S7563
TDE I enzyme	Illumina	15027865
Instruments
Flow cytometer	BD Biosciences	FACSAria Fusion
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q33226
Real-Time PCR system	Thermo Fishers	QuantStudio?5