Адипоцит-специфический ATAC-Seq с жировыми тканями с использованием флуоресцентно-активированной сортировки ядер

Резюме

Мы представляем протокол анализа транспозаз-доступного хроматина с высокопроизводительным секвенированием (ATAC-seq), в частности, на адипоцитах с использованием сортировки ядер с жировыми тканями, выделенными от трансгенных репортерных мышей с ядерной флуоресцентной маркировкой.

Аннотация

Анализ на транспозаз-доступный хроматин с высокопроизводительным секвенированием (ATAC-seq) — это надежный метод, который позволяет профилировать доступность хроматина в масштабах всего генома. Этот метод был полезен для понимания регуляторных механизмов экспрессии генов в ряде биологических процессов. Несмотря на то, что ATAC-seq был модифицирован для различных типов образцов, эффективных модификаций методов ATAC-seq для жировых тканей не было. Проблемы с жировыми тканями включают сложную клеточную гетерогенность, большое содержание липидов и высокое загрязнение митохондрий. Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали протокол, который позволяет адипоцит-специфическому ATAC-seq с использованием флуоресцентно-активированной сортировки ядра жировыми тканями трансгенной репортерной мыши Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP). Этот протокол позволяет получать высококачественные данные с минимальными потерями при чтении секвенирования при одновременном уменьшении количества входных данных ядра и реагентов. В этой статье приведены подробные пошаговые инструкции по методу ATAC-seq, валидированному для использования ядер адипоцитов, выделенных из жировых тканей мышей. Этот протокол поможет в исследовании динамики хроматина в адипоцитах при различных биологических стимуляциях, что позволит получить новые биологические идеи.

Введение

Жировая ткань, которая специализируется на хранении избыточной энергии в виде липидных молекул, является ключевым органом для регуляции обмена веществ. Строгий контроль образования и поддержания адипоцитов жизненно важен для функции жировой ткани и энергетического гомеостаза всего организма¹. Многие транскрипционные регуляторы играют решающую роль в контроле дифференцировки, пластичности и функции адипоцитов; Некоторые из этих регуляторов участвуют в метаболических нарушениях у людей ^2,3. Последние достижения в области высокопроизводительных методов секвенирования экспрессии генов и эпигеномного анализа еще больше облегчили открытие молекулярных регуляторов биологии адипоцитов⁴. Исследования молекулярного профилирования с использованием жировых тканей сложно проводить из-за гетерогенности этих тканей. Жировая ткань состоит в основном из адипоцитов, которые отвечают за накопление жира, но также содержит различные другие типы клеток, такие как фибробласты, эндотелиальные клетки и иммунные клетки⁵. Кроме того, клеточный состав жировой ткани резко изменяется в ответ на патофизиологические изменения, такие как температура и состояние питания⁶. Чтобы преодолеть эти проблемы, мы ранее разработали трансгенную мышь-репортер, названную Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), которая продуцирует RFP-меченные GFP рибосомы и биотинилированные ядра, меченные mCherry, Cre-рекомбиназ-зависимым образом⁷. Система двойного мечения позволяет проводить специфический для типа клеток транскриптомный и эпигеномный анализ тканей. Используя мышей NuTRAP, скрещенных с адипоцит-специфическими линиями адипонектина-Cre (Adipoq-NuTRAP), мы ранее охарактеризовали профили экспрессии генов и состояния хроматина из чистых популяций адипоцитов in vivo и определили, как они изменяются при ожирении ^7,8. Ранее скрещивание мышей NuTRAP с коричневыми и бежевыми адипоцитарно-специфическими линиями Ucp1-Cre (Ucp1-NuTRAP) позволило охарактеризовать эпигеномное ремоделирование редкой термогенной популяции адипоцитов, бежевых адипоцитов, в ответ на изменения температуры⁹.

ATAC-seq является широко используемым аналитическим методом для оценки доступности хроматина в масштабах всего генома. Гиперреактивная транспозаза Tn5, используемая в ATAC-seq, позволяет идентифицировать открытые области хроматина путем маркировки адаптеров секвенирования в доступной для хроматина области ядер¹⁰. ATAC-seq — это простой метод, но он обеспечивает надежные результаты и высокую эффективность даже при использовании образцов с низким вводом. Таким образом, он стал одним из самых популярных методов эпигеномного профилирования и способствовал пониманию регуляторных механизмов экспрессии генов в различных биологических контекстах. С тех пор, как был создан оригинальный протокол ATAC-seq, были доработаны различные методы, производные от ATAC-seq, для модификации и оптимизации протокола для различных типов образцов. Например, Fast-ATAC предназначен для анализа образцов^{клеток крови 11}, Omni-ATAC является оптимизированным протоколом для замороженных образцов^{тканей 12}, а MiniATAC-seq эффективен для анализа эмбрионов на ранних стадиях¹³. Тем не менее, применение метода ATAC-seq к адипоцитам, особенно из образцов тканей, по-прежнему является сложной задачей. В дополнение к гетерогенности жировой ткани, ее высокое содержание липидов может мешать эффективным рекомбинационным реакциям транспозазы Tn5 даже после выделения ядра. Кроме того, высокое содержание митохондрий в адипоцитах, особенно в коричневых и бежевых адипоцитах, вызывает высокое загрязнение митохондриальной ДНК и нерациональное чтение секвенирования. В этой статье описывается протокол для специфического для адипоцитов ATAC-seq с использованием мышей Adipoq-NuTRAP (рис. 1). Используя преимущества сортировки ядер, меченных флуоресценцией, этот протокол позволяет собирать чистые популяции ядер адипоцитов вдали от других смешанных типов клеток и эффективно удалять липиды, митохондрии и тканевый мусор. Следовательно, этот протокол может генерировать высококачественные данные для конкретных типов клеток и минимизировать отходы от митохондриальных считываний, используя при этом меньшее количество входных данных и реагентов по сравнению со стандартным протоколом.

протокол

Уход за животными и эксперименты проводились в соответствии с процедурами, утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинской школы Университета Индианы.

1. Подготовка к началу эксперимента

1. Подготовка тканей
   1. Для мечения ядра адипоцитов скрещивайте мышей NuTRAP со специфическими для адипоцитов линиями адипонектина-Cre (Adipoq-Cre) для получения мышей Adipoq-NuTRAP, которые являются гемизиготными как для Adipoq-Cre, так и для NuTRAP.
   2. Препарируйте интересующие жировые ткани мышей Adipoq-NuTRAP, как описано ранее¹⁴.
   3. Заморозьте ткани в жидком азоте и храните их при температуре -80 °C до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая жировая прокладка может храниться целиком, а замороженные ткани могут быть позже разрезаны на сухом льду на более мелкие кусочки (~ 50 мг) для экспериментов. В качестве альтернативы, жировые ткани могут быть разрезаны, алицитированы и заморожены в пробирках для хранения (~ 50 мг на пробирку). Замороженные образцы никогда не размораживаются после замораживания до использования.
2. Подготовка буфера
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите буферы на льду на протяжении всего эксперимента.
   1. Приготовьте буфер для подготовки ядра (NPB): 250 мМ сахарозы, 10 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl₂ и 0,1% NP40. Приготовьте 7 мл NPB на образец. Перед использованием добавьте в NPB свежий коктейль ингибитора протеазы 100x (последний 1x), DTT (конечный 1 мМ) и Hoechst (конечный 1 мкг / мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется готовить свежий NPB, но его можно хранить при температуре 4 ° C до 1 месяца.
   2. Приготовьте 1x фосфатно-буферный физиологический раствор с 0,1% NP-40 (PBS-N).

2. Изоляция ядра

1. Гомогенизаторы Dounce для охлаждения, по одному стакану Dounce на образец, на льду. Затем добавьте 7 мл смеси NPB в каждый стакан Dounce.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В каждом эксперименте рекомендуется использовать до восьми образцов. Работа с более чем восемью образцами значительно задержит все этапы, и это может особенно ухудшить качество ядра во время сортировки.
2. Положите замороженную жировую ткань (50-100 мг) в стакан Dounce и сразу же разрежьте его на несколько более мелких кусочков с помощью длинных ножниц. Погладьте 10 раз рыхлым пестиком для всех образцов, а затем 10 раз тугим пестиком.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Жировые ткани мягкие, поэтому достаточно разрезать их на несколько небольших кусочков. Для редких образцов можно использовать более мелкие кусочки (10-20 мг), хотя количество собранных ядер адипоцитов может варьироваться.
3. Отфильтруйте через сетчатый фильтр 100 мкм в новую пробирку объемом 50 мл. Перелейте отфильтрованные гомогенаты в новую пробирку объемом 15 мл. Отжим при 200 × г в течение 10 мин при 4 °C в центрифуге с поворотным ведром. Удалите надосадочную жидкость настолько, насколько это возможно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала аспирируйте с помощью пылесоса, а затем удалите оставшийся объем с помощью микропипетки.
4. Ресуспендируйте гранулу в 500 мкл PBS-N легким, но тщательным постукиванием пальцами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пипетки, так как это может повредить ядра.
5. Отфильтруйте через сетчатое фильтр 40 мкм в новую пробирку объемом 50 мл с помощью щадящего пипетирования. Промойте сетчатый фильтр 250 мкл PBS-N. Перенесите отфильтрованную ядерную ресуспендию в пробирку для сортировки клеток, активируемой флуоресценцией (FACS), с помощью микропипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии пробирки и сетчатые фильтры можно использовать для небольших объемов, чтобы свести к минимуму потери образца.

3. Сортировка ядра

1. Подготовка сборной пробирки
   1. Добавьте 500 мкл PBS-N в новые пробирки объемом 1,5 мл и несколько раз переверните, чтобы смочить все внутренние поверхности буфером.
   2. Коротко раскрутите трубки, чтобы сбить всю жидкость, а затем охладите их на льду до сортировки.
2. СУИМ (рис. 2)
   1. Используйте стробирование FSC-A/FSC-H для синглетов и FSC-A/SSC-A для удаления мелкого или крупного мусора.
   2. Ворота для популяции ядра адипоцитов mCherry/GFP.
   3. Соберите по 10 000 ядер в каждую из пробирок для сбора, приготовленных на шаге 3.1.
3. Подготовка ядра после сортировки
   1. Добавьте 500 мкл PBS-N в каждую сборную пробирку и несколько раз перемешайте.
   2. Отжимают сборные пробирки при 200 × г в течение 10 мин при 4 °С в центрифуге с поворотным ведром. Полностью удалите надосадочную жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала используйте пылесос, чтобы удалить пузырьки, слейте надосадочную жидкость и используйте бумажные салфетки, чтобы полностью удалить оставшуюся жидкость. В этот момент гранула невидима. Приготовьте основную смесь Tn5 на этапе центрифугирования, как описано ниже.

4. Тагментация Tn5 (таблица 1)

1. Чтобы приготовить 25 мкл основной смеси Tn5, смешайте 12,5 мкл 2-кратного буфера ДНК с тагментацией (буфер TD), 1,25 мкл транспозазы Tn5 (фермент TDE I) и 11,25 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
2. Добавьте 25 мкл основной смеси Tn5 к каждой грануле ядра и ресуспендируйте путем осторожного пипетирования. Инкубировать при 600 об/мин в течение 30 мин при 37 °C с помощью термомиксера.

5. Очистка ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: В следующей процедуре используется набор для очистки ПЦР, указанный в таблице материалов. Можно использовать любые другие подобные методы очистки ДНК.

1. Добавьте 25 мкл безнуклеазной воды к 25 мкл смеси ресуспензии ядер Tn5, полученной после стадии 4.2. Конечный объем составляет 50 мкл на образец.
2. Добавьте 250 мкл буферного PB.
3. Добавьте 5 мкл 3 М ацетата натрия (NaOAc) (рН 5,2).
4. Переложите смесь в колонку (поставляется с указанным набором) и центрифугу при 17 900 × г в течение 1 мин при комнатной температуре (RT).
5. Откажитесь от проточной части и поместите спиновую колонну обратно в ту же сборную трубу. Добавьте 750 мкл буферного полиэтилена, содержащего абсолютный этанол (EtOH), и центрифугу при 17 900 × г в течение 1 мин при RT.
6. Откажитесь от проточной части и поместите спиновую колонну обратно в ту же сборную трубку. Центрифугу при 17 900 × г в течение 1 мин при ЛТ и выбросьте сборную пробирку с проточным отверстием.
7. Чтобы разбавить фрагменты ДНК, оборудуйте колонку новой пробиркой объемом 1,5 мл, добавьте 10 мкл буфера EB и оставьте в режиме RT на 3 мин. Центрифуга при 17 900 × г в течение 1 мин при ЛТ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить при температуре 4 °C в течение нескольких дней или при температуре -20 °C в течение нескольких недель.

6. ПЦР-амплификация (табл. 2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Праймеры, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице 3.

1. Для амплификации транспонированных фрагментов ДНК приготовьте мастер-смесь для ПЦР без добавления уникального праймера штрих-кодирования Ad2.n (праймер #2). Используйте 38 мкл основной смеси для ПЦР на образец: 11 мкл воды, не содержащей нуклеазы, 2 мкл праймера Ad1_noMX 25 мкМ (праймер #1) и 25 мкл 2x мастер-смеси для ПЦР.
2. Добавьте 38 мкл основной смеси для ПЦР в пробирку для ПЦР объемом 0,2 мл.
3. Добавьте 10 мкл элюированных фрагментов ДНК из шага 5.7.
4. Добавьте 2 мкл 25 мкМ праймера #2, который должен быть специфичным для каждого образца.
5. Запустите ПЦР в соответствии с условиями циклирования, указанными в таблице 2.

7. Количественный ПЦР-тест в реальном времени (кПЦР) (таблица 4)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг направлен на определение дополнительных циклов, необходимых для амплификации ДНК. Это необязательно, но настоятельно рекомендуется, особенно для новых экспериментов.

1. Приготовьте мастер-смесь для кПЦР без добавления праймера #2. Используйте 9,975 мкл основной смеси для кПЦР на образец: 4,41 мкл воды, не содержащей нуклеаз, 0,25 мкл 25 мкМ праймера #1, 5 мкл 2x PCR Master Mix и 0,09 мкл 100x SYBR Green I.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы приготовить 100x SYBR Green I, разбавьте 10 000x бульон водой, не содержащей нуклеаз. Поскольку объем 100x SYBR Green I, используемый для мастер-смеси qPCR, незначителен, легче сделать дополнительную мастер-смесь из разбавленной 100x SYBR Green I (например, для 8-10 образцов).
2. Добавьте 9,975 мкл основной смеси для кПЦР в каждую лунку планшета для кПЦР.
3. Добавьте 0,25 мкл грунтовки #2 25 мкМ в каждую лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно добавьте один и тот же праймер #2, чтобы он соответствовал тому, что было добавлено к каждому конкретному образцу на шаге 6.4.
4. Добавьте 5 мкл реакции ПЦР, полученной после амплификации ПЦР на этапе 6,5, и перемешайте пипеткой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшиеся 45 мкл реакции ПЦР будут использованы для второй амплификации ПЦР.
5. Запустите кПЦР в соответствии с условиями циклирования, указанными в таблице 5.
6. Проверьте кривые амплификации и определите количество необходимых дополнительных циклов ПЦР, оценив количество циклов, достигших ~ 35% от максимума (рис. 3A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, для 10 000 ядер требуется от пяти до восьми дополнительных циклов ПЦР.

8. Дополнительная ПЦР-амплификация

1. Запустите ПЦР, используя все оставшиеся 45 мкл реакции ПЦР в соответствии с расчетами из шага 7.6 (таблица 6).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого образца может потребоваться разное количество циклов усиления.

9. Вторая очистка ДНК с использованием набора для очистки ПЦР

1. Используйте те же процедуры, что и в разделе 5, но разбавьте амплифицированные фрагменты ДНК 20 мкл буфера EB.

10. Выбор размера фрагмента ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте твердофазные обратимые иммобилизующие шарики, как описано ниже. Любые другие подобные шарики для очистки ДНК можно использовать в соответствии с инструкциями производителя. Перед использованием суспензия шарика SPRI должна быть полностью ресуспендирована и уравновешена при RT с вращением.

1. Перенесите элюированную ДНК в новую пробирку для ПЦР и добавьте 80 мкл буферного ЭБ, чтобы получить окончательный объем 100 мкл.
2. Добавьте 55 мкл шариков SPRI (0,55x объем образца) и перемешайте пипеткой. Инкубировать в течение 5 мин при ЛТ, а затем отделить на мини-магнитной подставке для ПЦР 8-пробирочные полоски в течение 5 мин.
3. Перенесите 150 мкл надосадочной жидкости в новую ПЦР-пробирку. Добавьте 95 мкл шариков SPRI и перемешайте пипеткой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Надосадочная жидкость содержит ДНК примерно 500.н. или меньше.
4. Инкубируйте в течение 5 минут при RT, а затем отделите на мини-магнитной подставке в течение 5 минут. Тщательно выбросьте надосадочную жидкость.
5. Промойте шарики в течение 1 минуты с 200 мкл 70% EtOH. Повторите два раза в общей сложности три стирки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не перемещайте пробирки для ПЦР с магнитной подставки во время стирки.
6. После окончательной промывки открутите пробирки при дозе 1000 × г в течение 1 минуты и удалите оставшийся EtOH. Высушите гранулы с открытой крышкой при температуре 37 °C в течение 2 минут на ПЦР-машине.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы бисера должны иметь только некоторые незначительные трещины после высыхания. Избегайте пересушивания.
7. Ресуспендируют гранулу с 20 мкл буферного ЭБ путем пипетки и инкубируют в течение 5 мин при ЛТ. Отделите на мини-магнитной подставке в течение 5 минут, а затем перенесите 18 мкл надосадочной жидкости, содержащей конечную библиотеку, в новую пробирку объемом 1,5 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Библиотека может храниться при температуре -20 °C при выполнении проверки качества.

11. Количественное определение ДНК с помощью флуорометра

1. Чтобы приготовить основную смесь, разбавьте 200-кратный высокочувствительный реагент дцДНК (HS) буфером dsDNA HS до конечной концентрации 1x.
2. Для стандартов добавьте 190 мкл 1x основной смеси и 10 мкл стандарта 1 или стандарта 2 в трубку флуорометра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Уравновесьте стандарты в RT в темноте, прежде чем начинать количественную оценку.
3. Для библиотечных образцов добавьте 198 мкл 1x основной смеси и 2 мкл каждого образца в отдельную пробирку флуорометра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если количество образца ограничено, объем образца может быть уменьшен до 1 мкл, а объем 1x основной смеси может быть увеличен до 199 мкл.
4. Встряхните или встряхните трубки флуорометра и оставьте их на 5 минут при RT в темноте. Измерьте концентрацию ДНК с помощью анализа dsDNA HS флуорометра.

12. Проверка качества библиотеки высокочувствительными системами электрофореза

1. Возьмите библиотеку ATAC-seq и разбавьте водой, не содержащей нуклеаз, до конечной концентрации 1-5 нг/мкл.
2. Проанализируйте распределение библиотек ATAC-seq по размерам с помощью высокочувствительных автоматизированных систем электрофореза в соответствии с протоколами производителя.

13. Проверка качества библиотеки ATAC-seq с помощью таргетной кПЦР

1. Возьмите 5-10 нг библиотеки ATAC-seq и разбавьте 50 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
2. Запустите кПЦР с использованием праймеров, нацеленных на промоторы и энхансеры, которые, как известно, активны в адипоцитах, в соответствии с условиями цикла, указанными в таблице 7.
3. Используйте отрицательные контрольные праймеры, нацеленные на закрытые/молчаливые области генома (таблица 7).
4. Рассчитайте обогащение промотора/энхансеров по сравнению с отрицательным контролем (таблица 8).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается ≥10-20-кратное обогащение с успешными образцами.

14. Последовательность действий

1. Отправьте библиотеки ATAC-seq для виртуализации. Используйте парное секвенирование (2 x 34.н., 2 x 50.н. или более) со средним числом считываний 10–30 миллионов чтений на выборку.

Результаты

Для анализа жировой ткани с использованием этого протокола ATAC-seq мы создали мышей Adipoq-NuTRAP, которых кормили диетами чау-чау; Затем мы выделили ядра адипоцитов из белой жировой ткани придатка яичка (eWAT), паховой белой жировой ткани (iWAT) и коричневой жировой ткани (BAT) с помощью проточной цито...

Обсуждение

В этой статье мы представили оптимизированный протокол ATAC-seq для оценки доступности специфического хроматина для адипоцитов in vivo. Этот протокол ATAC-seq с использованием мыши Adipoq-NuTRAP успешно сгенерировал профили доступности хроматина, специфичные для адипоцитов. Наиболее важным фак?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals
Adiponectin-Cre mouse	The Jackson Laboratory	28020
NuTRAP mouse	The Jackson Laboratory	29899
Reagents & Materials
1.5 mL DNA-LoBind tubes	Eppendorf	86-923
100 µm cell strainer	Falcon	352-360
15 mL tubes	VWR	525-1071
2x TD buffer	Illumina	15027866
384-well PCR plate	Applied biosystem	4483285
40 µm cell strainer	Falcon	352-340
50 mL tubes	VWR	525-1077
AMPure XP reagent (SPRI beads)	Beckman Coulter	A63881
Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit	Agilent Technologies	5067-4626
Clear adhesive film	Applied biosystem	4306311
DNase/RNase-free distilled water	Invitrogen	10977015
Dounce tissue grinder	DWK Life Sciences	357542
DTT	Sigma	D9779
DynaMag-96 side skirted magnet	Thermo Fishers	12027
FACS tubes	Falcon	28719128
HEPES	Boston BioProducts	BBH-75
Hoechst 33342	Invitrogen	2134015
KCl (2 M)	Boston BioProducts	MT-252
Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips	EpiCypher	10-0008
MgCl2 (1 M)	Boston BioProducts	MT-200
MinElute PCR purification kit	Qiagen	28004
NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix	BioLabs	M0541S
NP40	Thermo Fishers	28324
PCR 8-tube strip	USA scientific	1402-4708
Protease inhibitor cocktail (100x)	Thermo Fishers	78439
Qubit dsDNA HS assay kit	Invitrogen	Q32851
Sucrose	Sigma	S0389-1KG
SYBR Green I (10,000x)	Invitrogen	S7563
TDE I enzyme	Illumina	15027865
Instruments
Flow cytometer	BD Biosciences	FACSAria Fusion
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q33226
Real-Time PCR system	Thermo Fishers	QuantStudio?5