ATAC-seq adipocita-specifico con tessuti adiposi mediante selezione del nucleo attivato dalla fluorescenza

Riepilogo

Presentiamo un protocollo per il dosaggio della cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alto rendimento (ATAC-seq) specificamente sugli adipociti utilizzando la selezione del nucleo con tessuti adiposi isolati da topi reporter transgenici con marcatura a fluorescenza nucleare.

Abstract

Il saggio per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alta produttività (ATAC-seq) è una tecnica robusta che consente la profilazione dell'accessibilità della cromatina a livello di genoma. Questa tecnica è stata utile per comprendere i meccanismi regolatori dell'espressione genica in una serie di processi biologici. Sebbene ATAC-seq sia stato modificato per diversi tipi di campioni, non ci sono state modifiche efficaci dei metodi ATAC-seq per i tessuti adiposi. Le sfide con i tessuti adiposi includono la complessa eterogeneità cellulare, il grande contenuto lipidico e l'elevata contaminazione mitocondriale. Per superare questi problemi, abbiamo sviluppato un protocollo che consente l'ATAC-seq adipocyte-specific utilizzando la selezione del nucleo attivata dalla fluorescenza con tessuti adiposi dal topo transgenico reporter Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP). Questo protocollo produce dati di alta qualità con letture di sequenziamento minime sprecate, riducendo al contempo la quantità di input del nucleo e reagenti. Questo articolo fornisce istruzioni dettagliate passo-passo per il metodo ATAC-seq convalidato per l'uso di nuclei di adipociti isolati da tessuti adiposi di topo. Questo protocollo aiuterà nello studio della dinamica della cromatina negli adipociti su diverse stimolazioni biologiche, che consentiranno nuove intuizioni biologiche.

Introduzione

Il tessuto adiposo, specializzato per immagazzinare l'energia in eccesso sotto forma di molecole lipidiche, è un organo chiave per la regolazione metabolica. Lo stretto controllo della formazione e del mantenimento degli adipociti è vitale per la funzione del tessuto adiposo e l'omeostasi energetica di tutto il corpo¹. Molti regolatori trascrizionali svolgono un ruolo critico nel controllo della differenziazione, della plasticità e della funzione degli adipociti; Alcuni di questi regolatori sono implicati nei disordini metabolici nell'uomo ^2,3. I recenti progressi nelle tecniche di sequenziamento ad alto rendimento per l'espressione genica e l'analisi epigenomica hanno ulteriormente facilitato la scoperta dei regolatori molecolari della biologia degli adipociti⁴. Gli studi di profilazione molecolare che utilizzano tessuti adiposi sono difficili da condurre a causa dell'eterogeneità di questi tessuti. Il tessuto adiposo è costituito principalmente da adipociti, che sono responsabili dell'accumulo di grasso, ma contiene anche vari altri tipi di cellule, come fibroblasti, cellule endoteliali e cellule immunitarie⁵. Inoltre, la composizione cellulare del tessuto adiposo è drasticamente alterata in risposta a cambiamenti fisiopatologici come la temperatura e lo stato nutrizionale⁶. Per superare questi problemi, abbiamo precedentemente sviluppato un topo reporter transgenico, chiamato Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), che produce ribosomi con GFP e nuclei biotinilati marcati con mCherry in modo dipendente dalla ricombinasi Cre⁷. Il sistema di doppia marcatura consente di eseguire analisi trascrittomiche ed epigenomiche specifiche per tipo cellulare con i tessuti. Utilizzando topi NuTRAP incrociati con linee adiponectina-Cre specifiche per adipociti (Adipoq-NuTRAP), abbiamo precedentemente caratterizzato i profili di espressione genica e gli stati di cromatina da popolazioni di adipociti puri in vivo e determinato come sono alterati durante l'obesità ^7,8. In precedenza, topi NuTRAP incrociati con linee Ucp1-Cre specifiche per adipociti marroni e beige (Ucp1-NuTRAP) ci hanno permesso di caratterizzare il rimodellamento epigenomico della rara popolazione di adipociti termogenici, gli adipociti beige, in risposta ai cambiamenti di temperatura⁹.

ATAC-seq è un metodo analitico ampiamente utilizzato per valutare l'accessibilità della cromatina a livello di genoma. La trasposasi Tn5 iper-reattiva utilizzata in ATAC-seq consente l'identificazione di regioni aperte della cromatina marcando adattatori di sequenziamento nella regione accessibile alla cromatina dei nuclei¹⁰. ATAC-seq è un metodo semplice, ma fornisce risultati robusti ed è altamente efficiente anche con campioni a basso input. È diventato, quindi, uno dei metodi di profilazione epigenomica più popolari e ha contribuito alla comprensione dei meccanismi regolatori dell'espressione genica all'interno di diversi contesti biologici. Da quando è stato creato il protocollo ATAC-seq originale, varie tecniche derivate da ATAC-seq sono state ulteriormente sviluppate per modificare e ottimizzare il protocollo per vari tipi di campioni. Ad esempio, Fast-ATAC è progettato per analizzare campioni di cellule del sangue¹¹, Omni-ATAC è un protocollo ottimizzato per campioni di tessuto congelato 12 e MiniATAC-seq è efficace per l'analisi embrionale in fase iniziale¹³. Tuttavia, l'applicazione del metodo ATAC-seq agli adipociti, in particolare da campioni di tessuto, è ancora impegnativa. Oltre all'eterogeneità del tessuto adiposo, il suo elevato contenuto lipidico può interferire con efficaci reazioni di ricombinazione da parte della trasposasi Tn5 anche dopo l'isolamento del nucleo. Inoltre, l'elevato contenuto mitocondriale negli adipociti, in particolare negli adipociti marroni e beige, causa un'elevata contaminazione del DNA mitocondriale e letture di sequenziamento sprecate. Questo documento descrive un protocollo per ATAC-seq adipocyte-specific utilizzando topi Adipoq-NuTRAP (Figura 1). Sfruttando la selezione dei nuclei marcati con fluorescenza, questo protocollo consente la raccolta di popolazioni pure di nuclei di adipociti lontano da altri tipi di cellule confondenti e l'efficiente rimozione di lipidi, mitocondri e detriti tissutali. Quindi, questo protocollo può generare dati di alta qualità specifici del tipo di cellula e ridurre al minimo gli sprechi dalle letture mitocondriali utilizzando una quantità ridotta di input e reagenti rispetto al protocollo standard.

Protocollo

La cura e la sperimentazione degli animali sono state eseguite secondo procedure approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Indiana University School of Medicine.

1. Preparativi prima di iniziare l'esperimento

1. Preparazione dei tessuti
   1. Per la marcatura del nucleo adipocitario, incrociare topi NuTRAP con linee adiponectina-Cre specifiche per adipociti (Adipoq-Cre) per generare topi Adipoq-NuTRAP, che sono emizigoti sia per Adipoq-Cre che per NuTRAP.
   2. Sezionare i tessuti adiposi di interesse dai topi Adipoq-NuTRAP come descritto in precedenza¹⁴.
   3. Congelare i tessuti in azoto liquido e conservarli a -80 °C fino all'uso.
      NOTA: Ogni cuscinetto adiposo può essere conservato nel suo insieme e i tessuti congelati possono essere successivamente tagliati su ghiaccio secco in pezzi più piccoli (~ 50 mg) per esperimenti. In alternativa, i tessuti grassi possono essere tagliati, aliquotati e congelati in provette per la conservazione (~ 50 mg per provetta). I campioni congelati non possono mai scongelarsi dopo il congelamento fino all'uso.
2. Preparazione del buffer
   NOTA: tenere i buffer sul ghiaccio per tutta la durata dell'esperimento.
   1. Preparare il tampone di preparazione del nucleo (NPB): 250 mM di saccarosio, 10 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂ e 0,1% NP40. Preparare 7 ml di NPB per campione. Aggiungere al NPB il cocktail di inibitori della proteasi 100x fresco (finale 1x), DTT (finale 1 mM) e Hoechst (finale 1 μg/ml) all'NPB.
      NOTA: Si consiglia di preparare NPB fresco, ma può essere conservato a 4 °C per un massimo di 1 mese.
   2. Preparare 1x soluzione salina tamponata con fosfato con 0,1% NP-40 (PBS-N).

2. Isolamento del nucleo

1. Raffreddare gli omogeneizzatori Dounce in vetro, con un bicchiere Dounce per campione, su ghiaccio. Quindi, aggiungere 7 ml della miscela NPB a ciascun bicchiere Dounce.
   NOTA: si consiglia di utilizzare fino a otto campioni in ogni esperimento. Lavorare con più di otto campioni ritarderebbe significativamente tutti i passaggi e potrebbe in particolare ridurre la qualità del nucleo durante la selezione.
2. Mettere il tessuto adiposo congelato (50-100 mg) nel bicchiere Dounce, e tagliarlo immediatamente in alcuni pezzi più piccoli usando un lungo paio di forbici. Colpisci 10x con un pestello sciolto per tutti i campioni, e poi 10x con un pestello stretto.
   NOTA: I tessuti adiposi sono morbidi, quindi tagliarli in pochi piccoli pezzi dovrebbe essere sufficiente. Per campioni rari, possono essere utilizzati pezzi più piccoli (10-20 mg), sebbene il numero di nucleo adipocitario raccolto possa variare.
3. Filtrare attraverso un filtro da 100 μm in un nuovo tubo da 50 ml. Spostare gli omogenati filtrati in un nuovo tubo da 15 mL versando. Centrifugare a 200 × g per 10 minuti a 4 °C in una centrifuga a secchio oscillante. Rimuovere il surnatante il più possibile.
   NOTA: aspirare prima con un aspiratore e quindi rimuovere il volume rimanente utilizzando una micropipetta.
4. Risospendere il pellet in 500 μL di PBS-N picchiettando delicatamente ma accuratamente.
   NOTA: evitare il pipettaggio, poiché ciò potrebbe danneggiare i nuclei.
5. Filtrare attraverso un filtro da 40 μm in un nuovo tubo da 50 mL utilizzando un pipettaggio delicato. Risciacquare il filtro con 250 μL di PBS-N. Trasferire la risospensione nucleare filtrata in un tubo di selezione cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) utilizzando una micropipetta.
   NOTA: Se disponibili, i tubi e i filtri per celle possono essere utilizzati per volumi più piccoli per ridurre al minimo la perdita di campione.

3. Ordinamento del nucleo

1. Preparazione del tubo di raccolta
   1. Aggiungere 500 μL di PBS-N ai nuovi tubi da 1,5 mL e capovolgere alcune volte per bagnare tutte le superfici interne con il tampone.
   2. Girare brevemente i tubi per far scendere tutto il liquido, quindi raffreddarli sul ghiaccio fino alla selezione.
2. FACS (Figura 2)
   1. Utilizzare il gating FSC-A/FSC-H per canottiere e FSC-A/SSC-A per la rimozione di detriti piccoli o grandi.
   2. Gate per la popolazione del nucleo adipocitario mCherry/GFP-positivo.
   3. Raccogliere 10.000 nuclei in ciascuna delle provette di raccolta preparate al punto 3.1.
3. Preparazione del nucleo post-smistamento
   1. Aggiungere 500 μL di PBS-N a ciascuna provetta di raccolta e capovolgere alcune volte per mescolare.
   2. Centrifugare i tubi di raccolta a 200 × g per 10 minuti a 4 °C in una centrifuga a benna oscillante. Rimuovere completamente il surnatante.
      NOTA: utilizzare prima un aspirapolvere per rimuovere le bolle, versare il surnatante e utilizzare salviette di carta per rimuovere completamente il liquido rimanente. Il pellet è invisibile a questo punto. Preparare la miscela madre Tn5 durante la fase di centrifugazione come descritto di seguito.

4. Tagmentazione Tn5 (Tabella 1)

1. Per preparare 25 μL di miscela madre Tn5, mescolare 12,5 μL di tampone DNA di tagmentazione 2x (tampone TD), 1,25 μL di trasposasi Tn5 (enzima TDE I) e 11,25 μL di acqua priva di nucleasi.
2. Aggiungere 25 μL di miscela madre Tn5 a ciascun pellet di nucleo e risospendere mediante pipettaggio delicato. Incubare a 600 giri/min per 30 minuti a 37 °C utilizzando un termomiscelatore.

5. Purificazione del DNA

NOTA: La seguente procedura utilizza il kit di purificazione PCR menzionato nella tabella dei materiali. È possibile utilizzare qualsiasi altro metodo di purificazione del DNA simile.

1. Aggiungere 25 μL di acqua esente da nucleasi ai 25 μL della miscela di risospensione del nucleo Tn5 ottenuta dopo la fase 4.2. Il volume finale è di 50 μL per campione.
2. Aggiungere 250 μL di tampone PB.
3. Aggiungere 5 μL di acetato di sodio 3 M (NaOAc) (pH 5,2).
4. Trasferire la miscela in una colonna (fornita con il kit di riferimento) e centrifugare a 17.900 × g per 1 minuto a temperatura ambiente (RT).
5. Eliminate il flusso e riposizionate la colonna di rotazione nello stesso tubo di raccolta. Aggiungere 750 μL di PE tampone contenente etanolo assoluto (EtOH) e centrifugare a 17.900 × g per 1 minuto a RT.
6. Scartare il flusso e riposizionare la colonna di rotazione nello stesso tubo di raccolta. Centrifugare a 17.900 × g per 1 minuto a RT ed eliminare il tubo di raccolta con il flusso passante.
7. Per eluire i frammenti di DNA, dotare la colonna di un nuovo tubo da 1,5 ml, aggiungere 10 μL di EB tampone e lasciare a RT per 3 minuti. Centrifugare a 17.900 × g per 1 minuto a RT.
   NOTA: I campioni possono essere conservati a 4 °C per giorni o a -20 °C per settimane.

6. Amplificazione PCR (Tabella 2)

NOTA: I primer utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella 3.

1. Per amplificare i frammenti di DNA trasposti, preparare la miscela master PCR senza aggiungere un primer per codici a barre Ad2.n unico (primer #2). Utilizzare 38 μL della miscela master PCR per campione: 11 μL di acqua priva di nucleasi, 2 μL di primer Ad1_noMX da 25 μM (primer #1) e 25 μL di 2x PCR Master Mix.
2. Aggiungere 38 μL della miscela principale PCR in una provetta da 0,2 mL di PCR.
3. Aggiungere 10 μL dei frammenti di DNA eluito del punto 5.7.
4. Aggiungere 2 μL di primer #2 da 25 μM, che deve essere specifico per ogni campione.
5. Eseguire la PCR secondo le condizioni ciclistiche indicate nella Tabella 2.

7. Test di PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) (Tabella 4)

NOTA: Questo passaggio mira a determinare i cicli aggiuntivi necessari per amplificare il DNA. È facoltativo ma altamente raccomandato, soprattutto per i nuovi esperimenti.

1. Preparare la miscela master qPCR senza aggiungere primer #2. Utilizzare 9,975 μL della miscela master qPCR per campione: 4,41 μL di acqua priva di nucleasi, 0,25 μL di primer #1 da 25 μM, 5 μL di 2x PCR Master Mix e 0,09 μL 100x SYBR Green I.
   NOTA: Per preparare 100x SYBR Green I, diluire il brodo 10.000x con acqua priva di nucleasi. Poiché il volume di 100x SYBR Green che ho usato per la miscela master qPCR è trascurabile, è più facile fare una miscela master aggiuntiva di 100x SYBR Green I diluito (ad esempio, per 8-10 campioni).
2. Aggiungere 9,975 μL della miscela principale qPCR in ciascun pozzetto di una piastra qPCR.
3. Aggiungere 0,25 μL di primer #2 da 25 μM in ciascun pozzetto.
   NOTA: Assicurarsi di aggiungere lo stesso primer #2 per abbinare ciò che è stato aggiunto a ciascun campione specifico nel passaggio 6.4.
4. Aggiungere 5 μL della reazione PCR ottenuta dopo l'amplificazione della PCR nella fase 6.5 e mescolare mediante pipettaggio.
   NOTA: I restanti 45 μL della reazione PCR saranno utilizzati per la seconda amplificazione PCR.
5. Eseguire la qPCR secondo le condizioni di ciclo indicate nella Tabella 5.
6. Controllare le curve di amplificazione e identificare il numero di cicli PCR aggiuntivi necessari stimando il numero di cicli che hanno raggiunto ~ 35% del massimo (Figura 3A).
   NOTA: In genere, 10.000 nuclei richiedono da cinque a otto cicli PCR aggiuntivi.

8. Amplificazione PCR aggiuntiva

1. Eseguire la PCR utilizzando tutti i restanti 45 μL della reazione PCR secondo i calcoli del punto 7.6 (Tabella 6).
   NOTA: Ogni campione potrebbe richiedere un numero diverso di cicli di amplificazione.

9. Seconda purificazione del DNA utilizzando il kit di purificazione PCR

1. Utilizzare le stesse procedure della sezione 5, ma eluire i frammenti di DNA amplificati con 20 μL di EB tampone.

10. Selezione della dimensione del frammento di DNA

NOTA: utilizzare sfere di immobilizzazione reversibili in fase solida, come descritto di seguito. Qualsiasi altra perla di purificazione del DNA simile può essere utilizzata secondo le istruzioni del produttore. La sospensione del tallone SPRI deve essere completamente risospesa e bilanciata a RT con rotazione prima dell'uso.

1. Trasferire il DNA eluito in una nuova provetta PCR e aggiungere 80 μL di EB tampone per ottenere un volume finale di 100 μL.
2. Aggiungere 55 μL di sfere SPRI (volume di campione 0,55x) e mescolare mediante pipettaggio. Incubare per 5 minuti a RT, quindi separare su un mini supporto magnetico per strisce PCR a 8 tubi per 5 minuti.
3. Trasferire 150 μL del surnatante in una nuova provetta PCR. Aggiungere 95 μL di perline SPRI e mescolare mediante pipettaggio.
   NOTA: Il surnatante contiene DNA di circa 500 bp o inferiore.
4. Incubare per 5 minuti a RT, quindi separare sul mini supporto magnetico per 5 minuti. Scartare il surnatante con attenzione.
5. Lavare le perline per 1 minuto con 200 μL di 70% di EtOH. Ripetere due volte per tre lavaggi in totale.
   NOTA: Non spostare i tubi PCR dal supporto magnetico durante i lavaggi.
6. Dopo il lavaggio finale, ruotare i tubi a 1.000 × g per 1 minuto e pipetare l'EtOH rimanente. Asciugare il pellet con il coperchio aperto a 37 °C per 2 minuti su una macchina PCR.
   NOTA: I pellet di perline dovrebbero mostrare solo alcune piccole crepe una volta asciugate. Evitare l'eccessiva asciugatura.
7. Risospendere il pellet con 20 μL di EB tampone mediante pipettaggio e incubare per 5 minuti a RT. Separare sul mini supporto magnetico per 5 minuti, quindi trasferire 18 μL del surnatante contenente la libreria finale in un nuovo tubo da 1,5 ml.
   NOTA La libreria può essere memorizzata a -20 °C durante l'esecuzione di un controllo di qualità.

11. Quantificazione del DNA mediante fluorometro

1. Per preparare la miscela principale, diluire il reagente 200x dsDNA ad alta sensibilità (HS) con tampone dsDNA HS fino a una concentrazione finale di 1x.
2. Per gli standard, aggiungere 190 μL della miscela master 1x e 10 μL dello standard 1 o dello standard 2 a un tubo fluorometrico.
   NOTA: Equilibrare gli standard di RT al buio prima di iniziare la quantificazione.
3. Per i campioni della libreria, aggiungere 198 μL della miscela master 1x e 2 μL di ciascun campione in un tubo fluorometrico separato.
   NOTA: se le quantità del campione sono limitate, il volume del campione può essere ridotto a 1 μL e il volume della miscela master 1x può essere aumentato a 199 μL.
4. Vortice o scuotere i tubi del fluorometro e lasciarli riposare per 5 minuti a RT al buio. Misurare la concentrazione di DNA utilizzando il saggio dsDNA HS del fluorometro.

12. Controllo della qualità della biblioteca mediante sistemi di elettroforesi ad alta sensibilità

1. Prendere la libreria ATAC-seq e diluire con acqua priva di nucleasi fino a una concentrazione finale di 1-5 ng/μL.
2. Analizza la distribuzione dimensionale delle librerie ATAC-seq utilizzando sistemi di elettroforesi automatizzati ad alta sensibilità che seguono i protocolli del produttore.

13. Controllo di qualità della libreria ATAC-seq utilizzando qPCR mirata

1. Prelevare 5-10 ng della libreria ATAC-seq e diluire con 50 μL di acqua priva di nucleasi.
2. Eseguire la qPCR utilizzando primer mirati ai promotori e agli enhancer noti per essere attivi negli adipociti in base alle condizioni cicliche indicate nella Tabella 7.
3. Utilizzare primer di controllo negativo mirati a regioni genomiche chiuse/silenziose (Tabella 7).
4. Calcolare l'arricchimento del promotore/potenziatore rispetto ai controlli negativi (Tabella 8).
   NOTA: Si prevede di vedere arricchimenti di ≥10-20 volte con campioni di successo.

14. Sequenziamento

1. Inviare le librerie ATAC-seq per la sequenziazione. Utilizzare il sequenziamento paired-end (2 x 34 bp, 2 x 50 bp o più) con numeri di lettura medi di 10-30 milioni di letture per campione.

Risultati

Per analizzare il tessuto adiposo utilizzando questo protocollo ATAC-seq, abbiamo generato topi Adipoq-NuTRAP che sono stati alimentati con diete chow; abbiamo quindi isolato i nuclei degli adipociti dal tessuto adiposo bianco epididimo (eWAT), dal tessuto adiposo bianco inguinale (iWAT) e dal tessuto adiposo bruno (BAT) utilizzando la citometria a flusso. I nuclei isolati sono stati utilizzati per la marcatura, seguita dalla purificazione del DNA, dall'amplificazione PCR, dalle fasi di controllo della qualità, dal sequ...

Discussione

In questo articolo, abbiamo presentato un protocollo ATAC-seq ottimizzato per valutare l'accessibilità della cromatina adipocita-specifica in vivo. Questo protocollo ATAC-seq che utilizza il mouse Adipoq-NuTRAP ha generato con successo profili di accessibilità della cromatina adipociti-specifici. Il fattore più critico per esperimenti ATAC-seq di successo e riproducibili è la qualità del nucleo. È fondamentale congelare immediatamente i tessuti adiposi sezionati in azoto liquido e conservarli in modo sicur...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals
Adiponectin-Cre mouse	The Jackson Laboratory	28020
NuTRAP mouse	The Jackson Laboratory	29899
Reagents & Materials
1.5 mL DNA-LoBind tubes	Eppendorf	86-923
100 µm cell strainer	Falcon	352-360
15 mL tubes	VWR	525-1071
2x TD buffer	Illumina	15027866
384-well PCR plate	Applied biosystem	4483285
40 µm cell strainer	Falcon	352-340
50 mL tubes	VWR	525-1077
AMPure XP reagent (SPRI beads)	Beckman Coulter	A63881
Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit	Agilent Technologies	5067-4626
Clear adhesive film	Applied biosystem	4306311
DNase/RNase-free distilled water	Invitrogen	10977015
Dounce tissue grinder	DWK Life Sciences	357542
DTT	Sigma	D9779
DynaMag-96 side skirted magnet	Thermo Fishers	12027
FACS tubes	Falcon	28719128
HEPES	Boston BioProducts	BBH-75
Hoechst 33342	Invitrogen	2134015
KCl (2 M)	Boston BioProducts	MT-252
Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips	EpiCypher	10-0008
MgCl2 (1 M)	Boston BioProducts	MT-200
MinElute PCR purification kit	Qiagen	28004
NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix	BioLabs	M0541S
NP40	Thermo Fishers	28324
PCR 8-tube strip	USA scientific	1402-4708
Protease inhibitor cocktail (100x)	Thermo Fishers	78439
Qubit dsDNA HS assay kit	Invitrogen	Q32851
Sucrose	Sigma	S0389-1KG
SYBR Green I (10,000x)	Invitrogen	S7563
TDE I enzyme	Illumina	15027865
Instruments
Flow cytometer	BD Biosciences	FACSAria Fusion
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q33226
Real-Time PCR system	Thermo Fishers	QuantStudio?5