JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتضمن البروتوكول المقترح إرشادات حول كيفية تجنب التلوث بالذيفان الداخلي أثناء عزل الحويصلات خارج الخلية من طافات زراعة الخلايا ، وكيفية تقييمها بشكل صحيح.

Abstract

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي مجموعة غير متجانسة من الحويصلات الغشائية التي تطلقها الخلايا في المختبر وفي الجسم الحي. إن وجودها في كل مكان ودورها الهام كحاملين للمعلومات البيولوجية يجعلها كائنات دراسة مثيرة للاهتمام ، وتتطلب بروتوكولات موثوقة ومتكررة لعزلها. ومع ذلك ، فإن تحقيق إمكاناتهم الكاملة أمر صعب حيث لا تزال هناك العديد من العقبات التقنية المتعلقة بأبحاثهم (مثل الاستحواذ المناسب). تقدم هذه الدراسة بروتوكولا لعزل المركبات الكهربائية الصغيرة (وفقا لتسمية MISEV 2018) من طاف الثقافة لخطوط الخلايا السرطانية على أساس الطرد المركزي التفاضلي. يتضمن البروتوكول إرشادات حول كيفية تجنب التلوث بالسموم الداخلية أثناء عزل المركبات الكهربائية وكيفية تقييمها بشكل صحيح. يمكن أن يؤدي تلوث السموم الداخلية للمركبات الكهربائية إلى إعاقة التجارب اللاحقة بشكل كبير أو حتى إخفاء آثارها البيولوجية الحقيقية. من ناحية أخرى ، قد يؤدي التغاضي عن وجود السموم الداخلية إلى استنتاجات غير صحيحة. هذا له أهمية خاصة عند الإشارة إلى خلايا الجهاز المناعي ، بما في ذلك الخلايا الوحيدة ، لأن الوحيدات تشكل مجموعة حساسة بشكل خاص لبقايا السموم الداخلية. لذلك ، يوصى بشدة بفحص EVs بحثا عن تلوث السموم الداخلية ، خاصة عند العمل مع الخلايا الحساسة للسموم الداخلية مثل الخلايا الوحيدة أو الضامة أو الخلايا المثبطة المشتقة من النخاع أو الخلايا المتغصنة.

Introduction

الحويصلات خارج الخلية (EVs) ، وفقا لتسمية MISEV 2018 ، هي مصطلح جماعي يصف أنواعا فرعية مختلفة من الحويصلات الغشائية التي تفرزها الخلايا والتي تلعب أدوارا حاسمة في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية 1,2. علاوة على ذلك ، تظهر المركبات الكهربائية واعدة كمؤشرات حيوية جديدة لمختلف الأمراض ، بالإضافة إلى العوامل العلاجية ووسائل توصيل الأدوية. ومع ذلك ، فإن تحقيق إمكاناتها الكاملة أمر صعب حيث لا تزال هناك العديد من العقبات الفنية المتعلقة بالاستحواذ عليها3. أحد هذه التحديات هو عزل المركبات الكهربائية الخالية من السموم الداخلية ، والتي تم إهمالها في كثير من الحالات. واحدة من السموم الداخلية الأكثر شيوعا هي عديد السكاريد الدهني (LPS) ، وهو مكون رئيسي لجدران الخلايا البكتيرية سالبة الجرام ويمكن أن يسبب استجابة التهابية حادة ، بسبب إطلاق عدد كبير من السيتوكينات الالتهابية بواسطة خلايا مختلفة 4,5. يحفز LPS استجابة عن طريق الارتباط ببروتين ربط LPS ، يليه التفاعل مع مركب CD14 / TLR4 / MD2 على الخلايا النخاعية. يؤدي هذا التفاعل إلى تنشيط مسارات الإشارات المعتمدة على MyD88 و TRIF ، والتي بدورها تؤدي إلى العامل النووي kappa B (NFkB). يؤدي نقل NFkB إلى النواة إلى بدء إنتاج السيتوكينات6. تعتبر الخلايا الوحيدة والبلاعم شديدة الحساسية ل LPS ، ويؤدي تعرضها ل LPS إلى إطلاق السيتوكينات الالتهابية والكيموكينات (على سبيل المثال ، IL-6 و IL-12 و CXCL8 و TNF-α)7,8. يتيح هيكل CD14 ربط أنواع LPS المختلفة ذات التقارب المماثل ويعمل كمستقبل مشارك للمستقبلات الأخرى الشبيهة بالحصيلة (TLR1 و 2 و 3 و 4 و 6 و 7 و 9) 6. لا يزال عدد الدراسات التي أجريت حول تأثيرات المركبات الكهربائية على الخلايا الوحيدة / الضامة يتزايد9،10،11. خاصة من منظور دراسة وظائف الخلايا الوحيدة ، ومجموعاتها الفرعية ، والخلايا المناعية الأخرى ، فإن وجود السموم الداخلية وحتى وجودها المقنع في المركبات الكهربائية له أهمية كبيرة12. قد يؤدي التلوث الذي يتم التغاضي عنه للمركبات الكهربائية بالسموم الداخلية إلى استنتاجات مضللة وإخفاء نشاطها البيولوجي الحقيقي. وبعبارة أخرى ، فإن العمل مع الخلايا الوحيدة يتطلب الثقة في غياب تلوث السموم الداخلية13. يمكن أن تكون المصادر المحتملة للسموم الداخلية هي الماء ، والوسائط والأمصال التي تم الحصول عليها تجاريا ، ومكونات الوسائط والمواد المضافة ، والأواني الزجاجية المختبرية ، والأواني البلاستيكية5،14،15.

لذلك ، تهدف هذه الدراسة إلى تطوير بروتوكول لعزل المركبات الكهربائية منخفضة السموم الداخلية. يوفر البروتوكول تلميحات بسيطة حول كيفية تجنب تلوث السموم الداخلية أثناء عزل المركبات الكهربائية بدلا من إزالة السموم الداخلية من المركبات الكهربائية. في السابق ، تم تقديم العديد من البروتوكولات حول كيفية إزالة السموم الداخلية من ، على سبيل المثال ، الجسيمات النانوية المهندسة المستخدمة في الطب النانوي. ومع ذلك ، لا يوجد أي منها مفيد للهياكل البيولوجية مثل المركبات الكهربائية. يمكن إجراء إزالة الحرارة الفعالة للجسيمات النانوية عن طريق شطف الإيثانول أو حمض الخليك ، أو التسخين عند 175 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ، أو تشعيع γ ، أو معالجة Triton X-100 ؛ ومع ذلك ، فإن هذه الإجراءات تؤدي إلى تدمير المركبات الكهربائية16,17.

البروتوكول المقدم هو دراسة رائدة تركز على تجنب شوائب السموم الداخلية في المركبات الكهربائية ، على عكس الدراسات السابقة حول تأثير EVs على الخلايا الوحيدة9. قد يساعد تطبيق المبادئ المقترحة على الممارسة المختبرية في الحصول على نتائج بحثية موثوقة ، والتي يمكن أن تكون حاسمة عند النظر في الاستخدام المحتمل للمركبات الكهربائية كعوامل علاجية فيالعيادة 12.

Protocol

1. إعداد أنابيب الطرد المركزي الفائقة

  1. استخدم أنابيب معقمة تستخدم مرة واحدة. إذا لم يكن ذلك ممكنا ، فأعد استخدام أنابيب الطرد المركزي الفائقة بعد غسلها بمنظف باستخدام ماصة باستور معقمة أو غيرها من أدوات التطبيق ذات الاستخدام الواحد. تذكر أن أنابيب الطرد المركزي الفائقة يجب أن تكون مخصصة لنوع واحد من مواد الطرد المركزي (طاف زراعة الخلايا / المصل / البلازما) والأنواع (الإنسان / الفأر / إلخ).
  2. بعد غسل المنظفات ، اشطف أنابيب الطرد المركزي الفائقة بماء منزوع الأيونات وخالي من LPS 3x.
    ملاحظة: لا تستخدم مياه منخفضة الجودة.
  3. جفف أنابيب الطرد المركزي الفائقة ، ثم املأها بنسبة 70٪ من الإيثانول. اترك الأنابيب مع 70 ٪ من الإيثانول للتطهير بين عشية وضحاها. قم بإزالة الإيثانول وتجفيف الأنابيب مرة أخرى.
  4. ضع الأنابيب والأغطية في عبوة التعقيم وأغلقها بإحكام. استخدم طريقة تعقيم البلازما أو الغاز (أكسيد الإيثيلين)18,19. قم بتخزين أنابيب الطرد المركزي الفائقة المغلقة في عبوة التعقيم في مكان جاف ، واستخدمها قبل تاريخ انتهاء الصلاحية.
    ملاحظة: قم بإجراء مراقبة شهرية لمستوى LPS في محلول ملحي مخزن للفوسفات (PBS) والمياه المستخدمة لعزل المركبات الكهربائية. يجب أن تشمل المراقبة الأنابيب أيضا (على سبيل المثال ، عن طريق اختبار الماء [التحكم في الغسيل] الذي تم تخزينه في أنابيب الطرد المركزي الفائقة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة [RT]).

2. تحضير مصل بقري جنيني منخفض الذيفان الداخلي مستنفد (EE-FBS)

  1. تأكد من استخدام FBS منخفض للغاية من السموم الداخلية (متوفر تجاريا ؛ انظر جدول المواد ؛ <0.1 EU / mL).
  2. ضع زجاجة من FBS منخفض للغاية في حمام مائي واحتضانها على حرارة 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. هذه الخطوة مطلوبة لإلغاء تنشيط النظام التكميلي.
  3. ماصة FBS المعطلة إلى أنابيب الطرد المركزي الفائقة وأجهزة الطرد المركزي عند 100000 × جم لمدة 4 ساعات عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية في أنابيب معقمة سعة 50 مل ، مع ضمان عدم تجاوز 45 مل لكل أنبوب لتجنب تلوث الغطاء وترطيب حلقة الأنبوب.
  4. قم بتخزين سيروم EE-FBS المحضر بهذه الطريقة في درجة حرارة -20 درجة مئوية. تحقق من تركيز LPS في EE-FBS (الخطوة 6). يجب أن يكون تركيز LPS عند نفس المستوى كما كان قبل الطرد المركزي الفائق.

3. ثقافة الخلية

  1. في هذه الدراسة ، تم استزراع خطوط خلايا SW480 و SW620 في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع 4.5 جم / لتر من الجلوكوز ، L- الجلوتامين ، بيروفات الصوديوم ، والجنتاميسين (50 ميكرولتر / مل) مع 10٪ EE-FBS وفقا لذلك في قوارير استزراع 75 سم2 باستخدام تقنية التعقيم. بذر ما يقرب من 4.5 × 10 6 خلايا و6.5 × 106 خلايا لكل قارورة ل SW480 و SW620 ، على التوالي.
  2. اجمع المواد الطافية مرتين في الأسبوع (~ 10 مل لكل قارورة) عندما تصل الخلايا إلى التقاء كامل (~ 13.5 × 10 6 و 20 × 106 خلايا لكل قارورة ل SW480 و SW620 ، على التوالي) ، وتقسيمها. تأكد من أن صلاحية الخلايا لا تقل عن 99٪ وأن الخلايا مستزرعة عند 37 درجة مئوية في جو CO2 بنسبة 5٪.
  3. اجمع المواد الطافية من مزرعة الخلايا في أنابيب سعة 15 مل تحمل علامات مناسبة. أجهزة الطرد المركزي للطاف التي تم جمعها عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في RT لإزالة حطام الخلية.
  4. اجمع المواد الطافية بعناية ، وتجنب شفط الحطام ، وضعها في أنابيب مصنفة ، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 3200 × جم لمدة 12 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  5. اجمع المواد الطافية من خطوة الطرد المركزي الثانية إلى أنابيب معقمة تحمل علامة 50 مل. تجنب ترطيب حواف الأنابيب. تأكد من أن حجم المادة الطافية لا يتجاوز 45 مل وأن الأنابيب محفوظة عموديا.
  6. لف غطاء الأنبوب بغشاء شفاف معقم وقم بتخزين المواد الطافية في الوضع الرأسي عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: إجراء التحكم الشهري في الميكوبلازما spp. وتلوث LPS في طاف الثقافة الطازجة (الخطوة 6). إذا تجاوز مستوى السموم الداخلية في المواد الطافية 0.05 EU / mL ، فتحقق من المرحلة التي قد يكون التلوث قد حدث فيها وأعد تشغيل العملية من البداية. إذا تلوث ثقافة الخلية بواسطة الميكوبلازما النيابة. تم الكشف عنها ، يجب إيقاف عزل المركبات الكهربائية عن هذه المواد الطافية.

4. عزل EVs من طافات زراعة الخلايا

  1. إعداد مرشحات حقنة 0.22 ميكرومتر والمحاقن ذات الحجم المناسب. تحضير أنبوبين مع طافات الثقافة (90 مل).
  2. املأ المحقنة بالمادة الطافية وقم بتوصيل المرشح بمحول الإبرة. ضع المحقنة المملوءة بالفلتر فوق أنبوب سعة 50 مل. اضغط على شفة المكبس واجمع ~ 90 مل من الترشيح.
  3. ماصة المرشح (7 مل) إلى أنابيب الطرد المركزي الفائقة (ضمان سحب نفس الحجم إلى كل أنبوب لتحقيق التوازن المناسب) وأجهزة الطرد المركزي عند 100000 × جم لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: تعتمد كفاءة تكوير المركبات الكهربائية على العديد من العوامل (على سبيل المثال, نوع الدوار, عامل k, طول مسار الهجرة, لزوجة الوسط, إلخ), والتي تحتاج إلى تحسين لاستعادة أفضل للمركبات الكهربائية20.
  4. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة باستور المعقمة. اجمع الكريات المتبقية باستخدام أطراف ماصة طويلة ومفلترة وقم بتجميعها في أنبوبي طرد مركزي فائقين. املأها حتى 7 مل باستخدام برنامج تلفزيوني مصفى خال من السموم الداخلية لشطف المركبات الكهربائية.
  5. أجهزة الطرد المركزي الكريات المعاد تعليقها بواسطة PBS عند 100000 × جم لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية تماما باستخدام ماصة باستور معقمة ، وأضف 200 ميكرولتر من PBS المصفى والخالي من السموم الداخلية إلى كلا الأنبوبين لإعادة تعليق المركبات الكهربائية. ماصة بلطف بيليه المركبات الكهربائية لجمع كل المركبات الكهربائية.
  6. انقل تعليق المركبات الكهربائية إلى أنبوب اختبار معقم سعة 1.5 مل (إن أمكن ، استخدم أنبوب ربط منخفض البروتين). احتفظ ب 10 ميكرولتر من معلق EV لإعداد التخفيف لتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) ولأغراض أخرى (على سبيل المثال ، قياس تركيز البروتين).
  7. قم بتخفيف المركبات الكهربائية باستخدام PBS المصفى (1: 1,000) للقياسات بواسطة NTA ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتأمين أنابيب EV عن طريق لف الغطاء بفيلم شفاف معقم. قم بتخزين المركبات الكهربائية في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

5. الكشف عن علامات محددة عن طريق النشاف الغربي

  1. تحديد مستوى البروتين في العينات (على سبيل المثال ، بواسطة فحص برادفورد) ، وإعداد العينات (20 ميكروغرام) مع تحميل المخزن المؤقت. قم بإعداد مخزن التحميل المؤقت عن طريق خلط 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة (4x) و 2 ميكرولتر من عامل اختزال العينة (10x) إلى حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر. احتضان العينات عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  2. تحضير المواد الهلامية بولي أكريلاميد مع SDS (10 ٪ -14 ٪) وتحميل 20 ميكروغرام من EVs إلى كل بئر.
  3. قم بتشغيل الكهربائي مع تشغيل المخزن المؤقت (30 جم من Tris ، 144 جم من الجلايسين ، 10٪ SDS لكل 1 لتر) لمدة 45 دقيقة عند 150 فولت.
  4. إجراء نقل شبه جاف للبروتينات من الجل إلى غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيليدين (PVDF) في آلة نقل مع مخزن توبين المؤقت (1.51 جم من تريس ، 7.2 جم من الجلايسين ، 10٪ ميثانول لكل 0.5 لتر) عند 25 فولت لمدة 1 ساعة.
  5. ضع الغشاء في محلول TBST (1 مل من توين ، 100 مل من محلول ملحي مخزن تريس (TBS 10x) لكل 1 لتر) للحجب باستخدام 1٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) في المخزن المؤقت TBST ، واحتضانه لمدة ساعة واحدة على الروك في RT.
  6. أضف الأجسام المضادة المخففة (1: 1,000) ، أو anti-CD9 1 (clone # D8O1A) أو anti-Alix 1 (clone # 3A9) ، في1٪ BSA واحتضانها بالغشاء طوال الليل عند 4 درجات مئوية على الروك. إزالة الأجسام المضادة وغسل الغشاء 3x مع 10 مل من 1x TBST لمدة 10 دقائق.
  7. أضف الأجسام المضادة للأرانب الماعز أو الماعز المضادة للفأر (التخفيف: 1: 2,000) الجسم المضاد الثانوي المترافق مع بيروكسيديز الفجل ، اعتمادا على الجسم المضاد الأساسي على الغشاء ، واحتضان لمدة 1 ساعة على الروك في RT. إزالة الأجسام المضادة وغسل الغشاء 3x مع 10 مل من 1x TBST لمدة 10 دقائق.
  8. امزج الركيزة واللومينول بنسبة 1: 1 للحصول على محلول 1 مل. صب الحل على الغشاء. ضع الغشاء على الفور في غرفة القياس لنظام التصوير ، واختر وحدة التلألؤ الكيميائي ، وتصور أشرطة البروتين على الشاشة.

6. قياس مستوى الذيفان الداخلي عن طريق اختبار Limulus Amebocyte Lysate (LAL)

  1. إجراء قياس LAL كروموجينيك لمستوى السموم الداخلية ، وفقا لتوصية الشركة المصنعة. باختصار ، استخدم الطريقة القائمة على تفاعل الذيفان الداخلي مع تحلل الخلايا الأميبية (LAL). حد الكشف عن هذه الطريقة هو 0.005 EU / mL.
    ملاحظة: لا يزال اختبار LAL ، على الرغم من قيوده ، حاليا الطريقة القياسية للكشف عن تلوث السموم الداخلية وقياسه في أنواع مختلفة من المحاليل والمنتجات الأخرى المستخدمة في العلوم أو الطب8. العامل المحدد لهذه المجموعة هو استقرار محلول تحلل الخلايا الأميبية المعاد تشكيله ، وهو مستقر لمدة 1 أسبوع فقط عند -20 درجة مئوية إذا تم تجميده مباشرة بعد إعادة التكوين.
  2. استخدم تخفيفا بمقدار عشرة أضعاف من المركبات الكهربائية والعينات الأخرى وتخفيفا بمقدار 50 ضعفا من المصل. لمزيد من التجارب ، استخدم فقط الكواشف منخفضة السموم الداخلية مثل EE-FBS و DMEM و PBS و RPMI (<0.005 EU / mL) وطافات الثقافة الخالية من LPS.

7. الكشف عن جين 16S rRNA بدائية النواة في عينات EV

  1. عزل الحمض النووي من عينات EV. حاول الحفاظ على الكواشف وموقع العزل معقما. قياس تركيز الحمض النووي وجودته (على سبيل المثال ، باستخدام مقياس الطيف الضوئي).
  2. أداء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) ، كما هو موضح سابقا21. تحضير 1.5٪ هلام الأغاروز مع بروميد الإيثيديوم أو SYBR الأخضر لتصور منتجات PCR في الأشعة فوق البنفسجية (UV).
  3. قم بتشغيل الرحلان الكهربائي للعينة وعلامة الوزن باستخدام المخزن المؤقت TRIS-acetate-EDTA عند 75 فولت لمدة 45 دقيقة. تصور أشرطة الحمض النووي باستخدام نظام التصوير.

8. تحديد تركيز LPS الفعال للتحفيز في نموذج وحيدات الإنسان

  1. قم بإعداد 2 × 106 حيدات / مل من معلق الوحيدات في RPMI 1640 المكمل ب L-glutamine والجلوكوز و 2٪ EE-FBS. أضف 50 ميكرولتر من المعلق لكل بئر من لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 96 بئرا22.
  2. أضف حجما مناسبا من LPS أو وسط الاستزراع للحصول على التركيزات النهائية التالية: 0 بيكوغرام / مل (تحكم) ، 10 بيكوغرام / مل ، 50 بيكوغرام / مل ، 100 بيكوغرام / مل ، 1 نانوغرام / مل ، و 100 نانوغرام / مل ، في الحجم الكلي 100 ميكرولتر من تعليق الخلية. اصنع ثلاث نسخ من كل تركيز LPS.
  3. استزراع الخلايا لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2. جمع طاف .
  4. أدر المادة الطافية عند 2,000 × جم لمدة 5 دقائق. نقل المواد الطافية إلى أنابيب جديدة. قم بقياس تركيز TNF 8,23 و IL-1023 في المواد الطافية المجمعة باستخدام مجموعة السيتوكين البشرية لمصفوفة الخرز الخلوي (CBA) ، وفقا لإجراء الشركة المصنعة ، باستخدام مقياس التدفق الخلوي.

النتائج

الشرط الأساسي أو الخطوة الإلزامية لهذا البروتوكول هي استبعاد التلوث المحتمل للسموم الداخلية من الكواشف. يجب أن تكون جميع الكواشف المستخدمة ، مثل FBS و DMEM و RPMI و PBS وحتى أنابيب الطرد المركزي الفائقة ، خالية من السموم الداخلية (<0.005 EU / mL). إن الحفاظ على نظام عدم التلوث بالذيفان الداخلي ليس بالأم...

Discussion

في السنوات القليلة الماضية ، أصبحت طرق عزل المركبات الكهربائية المناسبة ذات أهمية متزايدة ، مما يتيح إجراء مزيد من التحليلات الموثوقة ، على سبيل المثال ، في سياق الحصول على بيانات أوميكس وبيانات وظيفية موثوقة24. بناء على الخبرة البحثية السابقة ، يبدو أنه ليس فقط نوع طريقة الع?...

Disclosures

يعلن المؤلفون أن البحث قد أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن بناؤها كتضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المركز الوطني للعلوم ، بولندا ، رقم المنحة 2019/33 / B / NZ5 / 00647. نود أن نشكر البروفيسور توماس جوسيفسكي وأغنيسكا كراوتشيك من قسم علم الأحياء الدقيقة الطبية الجزيئية ، كلية الطب بجامعة جاجيلونيان على مساعدتهم التي لا تقدر بثمن في الكشف عن الحمض النووي البكتيري في المركبات الكهربائية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
 Alix (3A9) Mouse mAb Cell Signaling Technology2171
1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-PyrogenicGoogLab ScientificGBFT1250-R-NS
BD FACSCanto II Flow CytometrBD Biosciences
CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit IIBD Biosciences551809
CD9 (D8O1A) Rabbit mAbCell Signaling Technology13174
ChemiDoc Imaging SystemBio-Rad Laboratories, Inc. 17001401
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Corning10-013-CV
ELX800NB, Universal Microplate ReaderBIO-TEK INSTRUMENTS, INC
Fetal Bovine SerumGibco16000044
Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin Biowest S1860-500
Gentamicin, 50 mg/mL PAN – BiotechP06-13100
Goat anti-Mouse IgG- HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2004
Goat anti-Rabbit IgG- HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2005
Immun-Blot PVDF MembraneBio-Rad Laboratories, Inc. 1620177
LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) Enzo Life Sciences, Inc.ALX-581-009-L002
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer CellBio-Rad Laboratories, Inc. 1703930
Nanoparticle Tracking Analysis Malvern Instruments Ltd
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) Invitrogen NP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) InvitrogenNP0004
ParafilmSigma AldrichP7793transparent film
Perfect 100-1000 bp DNA LadderEURxE3141-01 
PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant KitThermo ScientificA39552
PP Oak Ridge Tube with sealing capsThermo Scientific3929, 03613
RPMI 1640RPMI-1640 (Gibco)11875093
SimpliAmp Thermal CyclerApplied BiosystemA24811
Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotorThermo Scientific75000100
Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis SystemBio-Rad Laboratories, Inc. 1704401
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent SubstrateThermo Scientific34577
SW480 cell lineAmerican Type Culture Collection(ATCC)
SW480 cell lineAmerican Type Culture Collection (ATCC)
Syringe filter 0.22 umTPP99722
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer CellBio-Rad Laboratories, Inc. 1703940Transfer machine
Transfer pipette, 3.5 mLSARSTEDT86.1171.001

References

  1. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  2. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
  3. van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).
  4. Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling. Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).
  5. Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells. PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).
  6. Zanoni, I., Granucci, F. Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).
  7. Takashiba, S., et al. Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB. Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).
  8. Schwarz, H., et al. Biological activity of masked endotoxin. Scientific Reports. 7, 44750 (2017).
  9. Danesh, A., et al. Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients. Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).
  10. Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles. The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).
  11. Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells. Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).
  12. Soekmadji, C., et al. The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).
  13. Gioannini, T. L., et al. Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).
  14. Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test. Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).
  15. Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization. Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).
  16. Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).
  17. Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).
  18. Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).
  19. Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).
  20. Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  21. Salamon, D., et al. Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome. Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).
  22. Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes. Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).
  23. Chaiwut, R., Kasinrerk, W. Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes. BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).
  24. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).
  25. Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
  26. Pham, C. V., et al. Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised. Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).
  27. Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).
  28. Álvarez, E., et al. A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins. Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).
  29. Busatto, S., et al. Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid. Cells. 7 (12), 273 (2018).
  30. Gałuszka, A., et al. Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).
  31. Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies. Critical Care. 10 (1), 27 (2006).
  32. Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved