Isolierung von extrazellulären Vesikeln mit niedrigem Endotoxingehalt, die aus Krebszelllinien stammen

Zusammenfassung

Das vorgeschlagene Protokoll enthält Richtlinien, wie eine Kontamination mit Endotoxin während der Isolierung von extrazellulären Vesikeln aus Zellkulturüberständen vermieden und richtig bewertet werden kann.

Zusammenfassung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind eine heterogene Population von Membranvesikeln, die von Zellen in vitro und in vivo freigesetzt werden. Ihre Allgegenwart und ihre bedeutende Rolle als Träger biologischer Informationen machen sie zu faszinierenden Studienobjekten, die zuverlässige und sich wiederholende Protokolle für ihre Isolierung erfordern. Es ist jedoch schwierig, ihr volles Potenzial auszuschöpfen, da es immer noch viele technische Hindernisse im Zusammenhang mit ihrer Forschung gibt (wie z.B. die richtige Beschaffung). Diese Studie stellt ein Protokoll für die Isolierung kleiner EVs (gemäß der MISEV 2018-Nomenklatur) aus dem Kulturüberstand von Tumorzelllinien vor, das auf differentieller Zentrifugation basiert. Das Protokoll enthält Richtlinien, wie eine Kontamination mit Endotoxinen während der Isolierung von Elektrofahrzeugen vermieden und richtig bewertet werden kann. Eine Endotoxin-Kontamination von EVs kann nachfolgende Experimente erheblich behindern oder sogar ihre wahren biologischen Auswirkungen verschleiern. Andererseits kann das übersehene Vorhandensein von Endotoxinen zu falschen Schlussfolgerungen führen. Dies ist von besonderer Bedeutung, wenn es um Zellen des Immunsystems, einschließlich Monozyten, geht, da Monozyten eine Population darstellen, die besonders empfindlich auf Endotoxinrückstände reagiert. Daher wird dringend empfohlen, EVs auf Endotoxinkontamination zu untersuchen, insbesondere wenn mit endotoxinempfindlichen Zellen wie Monozyten, Makrophagen, myeloischen Suppressorzellen oder dendritischen Zellen gearbeitet wird.

Einleitung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind nach der Nomenklatur MISEV 2018 ein Sammelbegriff, der verschiedene Subtypen von zellsezernierten membranösen Vesikeln beschreibt, die bei zahlreichen physiologischen und pathologischen Prozessen eine entscheidende Rolle spielen ^1,2. Darüber hinaus sind Elektrofahrzeuge als neuartige Biomarker für verschiedene Krankheiten sowie als Therapeutika und Vehikel für die Verabreichung von Medikamenten vielversprechend. Es ist jedoch schwierig, ihr volles Potenzial auszuschöpfen, da es immer noch viele technische Hindernisse im Zusammenhang mit ihrer Anschaffung^{gibt 3}. Eine solche Herausforderung ist die Isolierung von endotoxinfreien Elektrofahrzeugen, die in vielen Fällen vernachlässigt wurde. Eines der häufigsten Endotoxine ist das Lipopolysaccharid (LPS), das ein Hauptbestandteil gramnegativer bakterieller Zellwände ist und aufgrund der Freisetzung einer großen Anzahl von entzündlichen Zytokinen durch verschiedene Zellen eine akute Entzündungsreaktion hervorrufen kann ^4,5. LPS induziert eine Reaktion durch Bindung an das LPS-bindende Protein, gefolgt von einer Interaktion mit dem CD14/TLR4/MD2-Komplex auf myeloischen Zellen. Diese Wechselwirkung führt zur Aktivierung von MyD88- und TRIF-abhängigen Signalwegen, was wiederum den Kernfaktor Kappa B (NFkB) auslöst. Die Translokation von NFkB in den Zellkern initiiert die Produktion von Zytokinen⁶. Monozyten und Makrophagen reagieren sehr empfindlich auf LPS, und ihre Exposition gegenüber LPS führt zu einer Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen (z. B. IL-6, IL-12, CXCL8 und TNF-α)^7,8. Die CD14-Struktur ermöglicht die Bindung verschiedener LPS-Spezies mit ähnlicher Affinität und dient als Co-Rezeptor für andere Toll-like-Rezeptoren (TLRs) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 und 9)⁶. Die Zahl der Studien, die zu den Auswirkungen von EVs auf Monozyten/Makrophagen durchgeführt werden, nimmt immer noch zu 9,10,11. Insbesondere im Hinblick auf die Untersuchung der Funktionen von Monozyten, ihren Subpopulationen und anderen Immunzellen ist das Vorhandensein von Endotoxin und sogar ihre maskierte Anwesenheit in EVs von großer Bedeutung¹². Die übersehene Kontamination von Elektrofahrzeugen mit Endotoxinen kann zu irreführenden Schlussfolgerungen führen und ihre wahre biologische Aktivität verschleiern. Mit anderen Worten, die Arbeit mit monozytären Zellen erfordert Vertrauen in die Abwesenheit einer Endotoxinkontamination¹³. Mögliche Quellen für Endotoxine können Wasser, kommerziell erhältliche Medien und Seren, Medienkomponenten und -additive, Laborglaswaren und Kunststoffwaren 5,14,15 sein.

Daher zielte diese Studie darauf ab, ein Protokoll für die Isolierung von niedrig endotoxinhaltigen EVs zu entwickeln. Das Protokoll enthält einfache Hinweise, wie eine Endotoxinkontamination während der Isolierung von Elektrofahrzeugen vermieden werden kann, anstatt Endotoxine aus Elektrofahrzeugen zu entfernen. Zuvor wurden viele Protokolle vorgestellt, wie Endotoxine beispielsweise aus technisch hergestellten Nanopartikeln entfernt werden können, die in der Nanomedizin verwendet werden. Keiner von ihnen ist jedoch für biologische Strukturen wie EVs nützlich. Die effektive Depyrogenisierung von Nanopartikeln kann durch Ethanol- oder Essigsäurespülen, Erhitzen auf 175 °C für 3 h, γ Bestrahlung oder Triton-X-100-Behandlung erfolgen; Diese Verfahren führen jedoch zur Zerstörung von Elektrofahrzeugen^16,17.

Das vorgestellte Protokoll ist eine bahnbrechende Studie, die sich auf die Vermeidung von Endotoxinverunreinigungen in EVs konzentriert, im Gegensatz zu früheren Studien zur Wirkung von EVs auf Monozyten⁹. Die Anwendung der vorgeschlagenen Prinzipien auf die Laborpraxis kann dazu beitragen, zuverlässige Forschungsergebnisse zu erhalten, was entscheidend sein kann, wenn die mögliche Verwendung von EVs als Therapeutika in der Klinik in Betracht gezogen wird¹².

Protokoll

1. Vorbereitung von Ultrazentrifugenröhrchen

1. Verwenden Sie sterile Einwegröhrchen. Wenn dies nicht möglich ist, verwenden Sie die Ultrazentrifugenröhrchen wieder, nachdem Sie sie mit einem Reinigungsmittel mit einer sterilen Pasteurpipette oder anderen Einwegapplikatoren gewaschen haben. Denken Sie daran, dass Ultrazentrifugenröhrchen für eine Art von zentrifugiertem Material (Zellkulturüberstand/Serum/Plasma) und Spezies (Mensch/Maus/etc.) bestimmt sein sollten.
2. Spülen Sie die Ultrazentrifugenröhrchen nach einer Waschmittelwäsche 3x mit entionisiertem, LPS-freiem Wasser aus.
   HINWEIS: Verwenden Sie kein minderwertiges Wasser.
3. Trocknen Sie die Ultrazentrifugenröhrchen und füllen Sie sie dann mit 70% Ethanol. Lassen Sie die Röhrchen mit 70% Ethanol zur Desinfektion über Nacht stehen. Entfernen Sie das Ethanol und trocknen Sie die Röhrchen erneut.
4. Legen Sie die Röhrchen und Kappen in die Sterilisationsverpackung und verschließen Sie sie fest. Verwenden Sie die Plasma- oder Gassterilisationsmethode (Ethylenoxid)^18,19. Lagern Sie die in der Sterilisationsverpackung enthaltenen Ultrazentrifugenröhrchen an einem trockenen Ort und verwenden Sie sie vor dem Verfallsdatum.
   HINWEIS: Führen Sie eine monatliche Überwachung des LPS-Gehalts in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und des für die Isolierung von Elektrofahrzeugen verwendeten Wassers durch. Die Überwachung sollte auch die Röhrchen einbeziehen (z. B. durch Prüfung des Wassers [Waschsteuerung], das über Nacht bei Raumtemperatur [RT] in den Ultrazentrifugenröhrchen gelagert wurde).

2. Herstellung von EV-abgereichertem fetalem Rinderserum mit niedrigem Endotoxingehalt (EE-FBS)

1. Stellen Sie sicher, dass Sie FBS mit extrem niedrigem Endotoxingehalt verwenden (im Handel erhältlich; siehe Materialtabelle; <0,1 EU/ml).
2. Stellen Sie eine Flasche FBS mit extrem niedrigem Endotoxingehalt in ein Wasserbad und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 56 °C. Dieser Schritt ist erforderlich, um das Komplementsystem zu deaktivieren.
3. Das inaktivierte FBS wird in Ultrazentrifugenröhrchen pipettiert und bei 100.000 x g für 4 h bei 4 °C zentrifugiert. Sammeln Sie den Überstand in sterilen 50-ml-Röhrchen und achten Sie darauf, dass 45 ml pro Röhrchen nicht überschritten werden, um eine Kontamination der Kappe und eine Benetzung des Röhrchenrings zu vermeiden.
4. Lagern Sie das so aufbereitete EE-FBS-Serum bei -20 °C. Überprüfen Sie die LPS-Konzentration in EE-FBS (Schritt 6). Die LPS-Konzentration sollte auf dem gleichen Niveau wie vor der Ultrazentrifugation liegen.

3. Zellkultur

1. Für diese Studie wurden SW480- und SW620-Zelllinien in Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) mit 4,5 g/L Glucose, L-Glutamin, Natriumpyruvat und Gentamicin (50 μl/ml) entsprechend mit 10% EE-FBS in 75 cm² Kulturflaschen unter Verwendung der aseptischen Technik kultiviert. Säen Sie fast 4,5 x 10 6 Zellen und 6,5 x 10⁶ Zellen pro Kolben für SW480 bzw. SW620.
2. Sammeln Sie die Überstände zweimal pro Woche (~ 10 ml pro Kolben), wenn die Zellen die volle Konfluenz erreichen (~ 13,5 x 10 6 und 20 x 10⁶ Zellen pro Kolben für SW480 bzw. SW620) und teilen Sie sie. Stellen Sie sicher, dass die Lebensfähigkeit der Zellen mindestens 99 % beträgt und dass die Zellen bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5 % CO₂ kultiviert werden.
3. Sammeln Sie Überstände aus der Zellkultur in entsprechend gekennzeichneten 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die gesammelten Überstände bei 500 x g für 5 min bei RT, um Zelltrümmer zu entfernen.
4. Sammeln Sie die Überstände sorgfältig, vermeiden Sie das Ansaugen von Schmutz, legen Sie sie in beschriftete Röhrchen und zentrifugieren Sie sie erneut bei 3.200 x g für 12 min bei 4 °C.
5. Sammeln Sie Überstände aus dem zweiten Zentrifugationsschritt in sterilen, beschrifteten 50-ml-Röhrchen. Vermeiden Sie es, die Ränder von Rohren zu benetzen. Stellen Sie sicher, dass das Volumen des Überstands 45 ml nicht überschreitet und dass die Röhrchen vertikal gehalten werden.
6. Wickeln Sie die Kappe des Röhrchens mit einer sterilen transparenten Folie ein und lagern Sie die Überstände in vertikaler Position bei -80 °C.
   HINWEIS: Führen Sie eine monatliche Kontrolle von Mycoplasma spp. durch. und LPS-Kontamination in Frischkulturüberständen (Schritt 6). Wenn der Endotoxingehalt in den Überständen 0,05 EU/ml überschreitet, überprüfen Sie, in welchem Stadium eine Kontamination aufgetreten sein könnte, und starten Sie den Prozess von vorne. Bei Kontamination der Zellkultur durch Mycoplasma spp. festgestellt wird, sollte die Isolierung der Elektrofahrzeuge von solchen Überständen abgebrochen werden.

4. Isolierung von EVs aus Zellkulturüberständen

1. Bereiten Sie 0,22-μm-Spritzenvorsatzfilter und Spritzen mit dem richtigen Volumen vor. Bereiten Sie zwei Röhrchen mit Kulturüberständen (90 ml) vor.
2. Füllen Sie die Spritze mit dem Überstand und befestigen Sie den Filter am Nadeladapter. Legen Sie die gefüllte Spritze mit dem Filter über ein 50-ml-Röhrchen. Drücken Sie auf den Kolbenflansch und sammeln Sie ~90 ml Filtrat.
3. Das Filtrat (7 ml) wird in die Ultrazentrifugenröhrchen pipettiert (wobei darauf zu achten ist, dass das gleiche Volumen in jedes Röhrchen pipettiert wird, um ein ausgewogenes Gleichgewicht zu gewährleisten) und bei 100.000 x g 2 h bei 4 °C zentrifugiert.
   HINWEIS: Die Effizienz der Pelletierung von Elektrofahrzeugen hängt von vielen Faktoren ab (z. B. Rotortyp, k-Faktor, Migrationsweglänge, Viskosität des Mediums usw.), die für eine bessere Rückgewinnung von Elektrofahrzeugen^{optimiert werden müssen 20}.
4. Entsorgen Sie den Überstand mit einer sterilen Pasteurpipette. Sammeln Sie die restlichen Pellets mit langen, filtrierten Pipettenspitzen und füllen Sie sie in zwei Ultrazentrifugenröhrchen auf. Füllen Sie sie bis zu 7 ml mit gefiltertem endotoxinfreiem PBS, um die EVs zu spülen.
5. Zentrifugieren Sie die PBS-resuspendierten Pellets bei 100.000 x g für 2 h bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand mit einer sterilen Pasteurpipette vollständig und geben Sie 200 μl gefiltertes, endotoxinfreies PBS in beide Röhrchen, um die EVs zu resuspendieren. Pipettieren Sie das Pellet des Elektrofahrzeugs vorsichtig, um alle Elektrofahrzeuge zu sammeln.
6. Übertragen Sie die EVs-Suspension in ein steriles 1,5-ml-Reagenzglas (wenn möglich, verwenden Sie ein Röhrchen mit geringer Proteinbindung). Bewahren Sie 10 μl der EV-Suspension zur Herstellung einer Verdünnung für die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) und für andere Zwecke (z. B. Proteinkonzentrationsmessung) auf.
7. Verdünnen Sie die Elektrofahrzeuge mit gefiltertem PBS (1:1.000) für Messungen durch NTA gemäß den Anweisungen des Herstellers. Sichern Sie die EV-Schläuche, indem Sie die Kappe mit einer sterilen transparenten Folie umwickeln. Lagern Sie die Elektrofahrzeuge bei -80 °C.

5. Nachweis spezifischer Marker durch Western Blot

1. Bestimmen Sie den Proteingehalt in den Proben (z. B. durch Bradford-Assay) und bereiten Sie die Proben (20 μg) mit Ladepuffer vor. Bereiten Sie den Beladungspuffer vor, indem Sie 5 μl Probenpuffer (4x) und 2 μl Probenreduktionsmittel (10x) zu einem Gesamtvolumen von 20 μl mischen. Inkubieren Sie die Proben bei 70 °C für 10 min.
2. Bereiten Sie Polyacrylamidgele mit SDS (10%-14%) vor und laden Sie die 20 μg EVs in jede Vertiefung.
3. Führen Sie die Elektrophorese mit laufendem Puffer (30 g Tris, 144 g Glycin, 10 % SDS pro 1 l) für 45 min bei 150 V durch.
4. Führen Sie eine halbtrockene Übertragung von Proteinen aus dem Gel auf die Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran in einer Transfermaschine mit Towbin-Puffer (1,51 g Tris, 7,2 g Glycin, 10% Methanol pro 0,5 l) bei 25 V für 1 h durch.
5. Legen Sie die Membran in TBST-Puffer (1 ml Tween, 100 ml Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS 10x) pro 1 l) zum Blockieren mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in TBST-Puffer und inkubieren Sie sie 1 h lang auf der Wippe bei RT.
6. Verdünnte (1:1.000) Antikörper, Anti-CD9 1 (Klon # D8O1A) oder Anti-Alix 1 (Klon # 3A9) in¹% BSA zugeben und mit der Membran über Nacht bei 4 °C auf der Wippe inkubieren. Entfernen Sie Antikörper und waschen Sie die Membran 3x mit 10 ml 1x TBST für 10 Minuten.
7. Fügen Sie je nach primärem Antikörper auf der Membran einen mit Meerrettichperoxidase konjugierten Sekundärantikörper gegen Kaninchen oder Ziegen (Verdünnung: 1:2.000) hinzu und inkubieren Sie ihn 1 h lang auf der Wippe bei RT. Entfernen Sie die Antikörper und waschen Sie die Membran 3x mit 10 ml 1x TBST für 10 Minuten.
8. Mischen Sie das Substrat und das Luminol im Verhältnis 1:1, um eine 1-ml-Lösung zu erhalten. Gießen Sie die Lösung auf die Membran. Platzieren Sie die Membran sofort in der Messkammer des Bildgebungssystems, wählen Sie das Chemilumineszenzmodul und visualisieren Sie die Proteinbanden auf dem Bildschirm.

6. Messung des Endotoxinspiegels durch Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test (LAL)

1. Führen Sie eine chromogene LAL-Messung des Endotoxinspiegels gemäß der Empfehlung des Herstellers durch. Verwenden Sie kurz gesagt die Methode, die auf der Wechselwirkung des Endotoxins mit dem Limulus-Amöbozytenlysat (LAL) basiert. Die Nachweisgrenze dieser Methode liegt bei 0,005 EU/ml.
   ANMERKUNG: Der LAL-Assay ist trotz seiner Einschränkungen derzeit nach wie vor die Standardmethode zum Nachweis und zur Quantifizierung der Endotoxinkontamination in verschiedenen Arten von Lösungen und anderen Produkten, die in Wissenschaft oder Medizin verwendet werden⁸. Der limitierende Faktor dieses Kits ist die Stabilität der rekonstituierten Amöbozytenlysatlösung, die bei -20 °C nur 1 Woche stabil ist, wenn sie unmittelbar nach der Rekonstitution eingefroren wird.
2. Verwenden Sie eine zehnfache Verdünnung von EVs und anderen Proben und eine 50-fache Verdünnung des Serums. Verwenden Sie für weitere Experimente nur Reagenzien mit niedrigem Endotoxingehalt wie EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI (<0,005 EU/ml) und LPS-freie Kulturüberstände.

7. Nachweis des prokaryotischen 16S-rRNA-Gens in EV-Proben

1. Isolieren Sie DNA aus den EV-Proben. Versuchen Sie, die Reagenzien und den Ort der Isolierung aseptisch zu halten. Messen Sie die DNA-Konzentration und -Qualität (z. B. mit einem Spektralphotometer).
2. Führen Sie eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durch, wie zuvor beschrieben²¹. Bereiten Sie 1,5% Agarosegel mit Ethidiumbromid oder SYBR-Grün vor, um die PCR-Produkte im ultravioletten Licht (UV) sichtbar zu machen.
3. Elektrophorese der Probe und des Gewichtsmarkers mit TRIS-Acetat-EDTA-Puffer bei 75 V für 45 min. Visualisieren Sie DNA-Banden mit dem Bildgebungssystem.

8. Bestimmung der effektiven LPS-Konzentration zur Stimulation im humanen Monozytenmodell

1. Bereiten Sie 2 x 10⁶ Monozyten/ml Monozytensuspension in RPMI 1640 vor, ergänzt mit L-Glutamin, Glucose und 2% EE-FBS. 50 μl der Suspension pro Vertiefung einer 96-Well-Gewebekulturplatte²² werden zugegeben.
2. Fügen Sie ein geeignetes Volumen LPS oder Kulturmedium hinzu, um die folgenden Endkonzentrationen zu erhalten: 0 pg/ml (Kontrolle), 10 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 1 ng/ml und 100 ng/ml in 100 μl Gesamtvolumen der Zellsuspension. Verdreifachen Sie jede LPS-Konzentration.
3. Die Zellen werden 18 h lang bei 37 °C, 5% CO₂ kultiviert. Sammle den Überstand.
4. Den Überstand bei 2.000 x g 5 min herunterschleudern. Übertragen Sie die Überstände in neue Röhrchen. Messen Sie die Konzentration von TNF ^8,23 und IL-10 ²³ in gesammelten Überständen mit dem humanen Zytokin-Kit (CBA) des zytometrischen Beads-Arrays (CBA) gemäß dem Verfahren des Herstellers mit einem Durchflusszytometer.

Ergebnisse

Voraussetzung oder obligatorischer Schritt für dieses Protokoll ist der Ausschluss einer möglichen Endotoxinkontamination aus Reagenzien. Alle verwendeten Reagenzien wie FBS, DMEM, RPMI, PBS und sogar Ultrazentrifugenröhrchen müssen endotoxinfrei sein (<0,005 EU/ml). Es ist nicht einfach, das Regime ohne Endotoxinkontamination aufrechtzuerhalten, da z. B. das Normal-/Standardserum für die Zellkultur eine reichhaltige Quelle sein kann (0,364 EU/ml; siehe Tabelle 1).

Obwohl...

Diskussion

In den letzten Jahren haben Methoden zur ordnungsgemäßen Isolierung von Elektrofahrzeugen zunehmend an Bedeutung gewonnen, um weitere zuverlässige Analysen zu ermöglichen, z. B. im Zusammenhang mit der Gewinnung zuverlässiger Omics- und Funktionsdaten²⁴. Basierend auf früheren Forschungserfahrungen scheint es, dass nicht nur die Art der Isolationsmethode, sondern auch andere Bedingungen während dieses Verfahrens wichtig sein können. Die Verwendung von EV-abgereichertem FBS wird weithin als...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alix (3A9) Mouse mAb	Cell Signaling Technology	2171
1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic	GoogLab Scientific	GBFT1250-R-NS
BD FACSCanto II Flow Cytometr	BD Biosciences
CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II	BD Biosciences	551809
CD9 (D8O1A) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	13174
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad Laboratories, Inc.	17001401
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)	Corning	10-013-CV
ELX800NB, Universal Microplate Reader	BIO-TEK INSTRUMENTS, INC
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044
Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin	Biowest	S1860-500
Gentamicin, 50 mg/mL	PAN – Biotech	P06-13100
Goat anti-Mouse IgG- HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004
Goat anti-Rabbit IgG- HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005
Immun-Blot PVDF Membrane	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1620177
LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE)	Enzo Life Sciences, Inc.	ALX-581-009-L002
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1703930
Nanoparticle Tracking Analysis	Malvern Instruments Ltd
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Invitrogen	NP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)	Invitrogen	NP0004
Parafilm	Sigma Aldrich	P7793	transparent film
Perfect 100-1000 bp DNA Ladder	EURx	E3141-01
PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit	Thermo Scientific	A39552
PP Oak Ridge Tube with sealing caps	Thermo Scientific	3929, 03613
RPMI 1640	RPMI-1640 (Gibco)	11875093
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystem	A24811
Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor	Thermo Scientific	75000100
Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1704401
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34577
SW480 cell line	American Type Culture Collection(ATCC)
SW480 cell line	American Type Culture Collection (ATCC)
Syringe filter 0.22 um	TPP	99722
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1703940	Transfer machine
Transfer pipette, 3.5 mL	SARSTEDT	86.1171.001