分离来自癌细胞系的低内毒素含量细胞外囊泡

摘要

拟议的方案包括有关如何在从细胞培养上清液中分离细胞外囊泡以及如何正确评估它们期间避免内毒素污染的指南。

摘要

细胞外囊泡（EV）是细胞在 体外 和 体内释放的膜囊泡的异质群。它们作为生物信息载体的无所不在和重要作用使它们成为有趣的研究对象，需要可靠和重复的方案来分离它们。然而，充分发挥他们的潜力是困难的，因为他们的研究仍然存在许多技术障碍（如适当的收购）。本研究提出了一种基于差异离心从肿瘤细胞系培养上清液中分离小型 EV（根据 MISEV 2018 命名法）的方案。该协议包括有关如何在分离电动汽车期间避免内毒素污染以及如何正确评估它们的指南。电动汽车的内毒素污染会严重阻碍后续实验，甚至掩盖其真正的生物效应。另一方面，被忽视的内毒素的存在可能会导致错误的结论。当提到免疫系统细胞（包括单核细胞）时，这一点尤其重要，因为单核细胞构成了对内毒素残基特别敏感的群体。因此，强烈建议筛查 EV 的内毒素污染，尤其是在处理内毒素敏感细胞（如单核细胞、巨噬细胞、髓源性抑制细胞或树突状细胞）时。

引言

根据MISEV 2018命名法，细胞外囊泡（EV）是一个统称，描述了细胞分泌的膜囊泡的各种亚型，这些囊泡在许多生理和病理过程中起着至关重要的作用^1，2。此外，电动汽车有望成为各种疾病的新型生物标志物，以及治疗剂和药物输送载体。然而，充分发挥其潜力是困难的，因为与获取它们相关的技术障碍仍然存在许多³.其中一个挑战是分离无内毒素的电动汽车，这在许多情况下被忽视了。最常见的内毒素之一是脂多糖（LPS），它是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，由于各种细胞释放大量炎^{性细胞因子}，可引起急性炎症反应4^，5。LPS通过与LPS结合蛋白结合诱导反应，然后与骨髓细胞上的CD14 / TLR4 / MD2复合物相互作用。这种相互作用导致MyD88和TRIF依赖性信号通路的激活，进而触发核因子κB（NFkB）。NFkB易位到细胞核启动细胞因子的^产生6。单核细胞和巨噬细胞对 LPS 高度敏感，暴露于 LPS 会导致炎症细胞因子和趋化因子（例如 IL-6、IL-12、CXCL8 和 TNF-α^）的释放7^，8。CD14结构能够结合具有相似亲和力的不同LPS物种，并作为其他toll样受体（TLR）（TLR1，2，3，4，6，7和^9）的辅助受体6。关于EV对单核细胞/巨噬细胞影响的研究数量^{仍在增加9}，^10，11。特别是从研究单核细胞、其亚群和其他免疫细胞的功能的角度来看，内毒素的存在，甚至它们在EV中的掩盖存在非常重要¹²。被忽视的电动汽车内毒素污染可能会导致误导性结论并掩盖其真正的生物活性。换句话说，使用单核细胞需要对没有内毒素污染的信心¹³。内毒素的潜在来源可以是水、商业获得的培养基和血清、培养基成分和添加剂、实验室玻璃器皿和塑料器皿⁵，^14，15。

因此，本研究旨在制定一种分离低内毒素电动汽车的方案。该协议提供了有关如何在EV分离过程中避免内毒素污染而不是从EV中去除内毒素的简单提示。以前，已经提出了许多关于如何从例如纳米医学中使用的工程纳米颗粒中去除内毒素的方案;然而，它们都对电动汽车等生物结构没有用。纳米颗粒的有效去热原可以通过乙醇或乙酸漂洗，在175°C加热3h，γ照射或Triton X-100处理进行;然而，这些程序导致电动汽车的破坏^16，17。

所提出的协议是一项开创性研究，专注于避免 EV 中的内毒素杂质，这与之前关于 EV 对单核细胞影响的研究不同⁹. 将拟议的原则应用于实验室实践可能有助于获得可靠的研究结果，这在考虑电动汽车作为临床治疗剂的潜在用途时至关重要¹²。

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研究方案

1. 超速离心管的制备

1. 使用无菌一次性试管。如果无法做到这一点，请在使用无菌巴斯德移液管或其他一次性涂抹器用洗涤剂清洗后重复使用超速离心管。请记住，超速离心管应专用于一种类型的离心材料（细胞培养上清液/血清/血浆）和物种（人/小鼠/等）。
2. 洗涤剂洗涤后，用去离子的无LPS水冲洗超速离心管3次。
   注意:请勿使用劣质水。
3. 干燥超速离心管，然后用70%乙醇填充它们。将试管与70%乙醇一起放置过夜消毒。取出乙醇并再次干燥试管。
4. 将管子和盖子放入灭菌包装中并紧紧关闭。采用等离子体或气体（环氧乙烷）灭菌的方法^18、19。将灭菌包装中封闭的超速离心管存放在干燥处，并在有效期前使用。
   注意:每月监测磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的LPS水平和用于EV分离的水。监测还应包括试管（例如，通过测试在室温 [RT] 下储存在超速离心管中过夜的水 [洗涤对照]）。

2. EV耗竭低内毒素胎牛血清（EE-FBS）的制备

1. 确保使用超低内毒素FBS（市售;见 材料表;<0.1 EU/mL）。
2. 将一瓶超低内毒素FBS放入水浴中，并在56°C下孵育30分钟。需要此步骤才能使补体系统失活。
3. 将灭活的FBS移液到超速离心管中，并在4°C下以100，000× g 离心4小时。 将上清液收集到无菌的 50 mL 管中，确保每管不超过 45 mL，以避免盖子污染并润湿管环。
4. 将以这种方式制备的EE-FBS血清储存在-20°C。 检查EE-FBS中LPS的浓度（步骤6）。LPS浓度应与超速离心前的水平相同。

3. 细胞培养

1. 在本研究中，使用无菌技术在 75 cm² 培养瓶中相应地补充 10% EE-FBS 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中的 SW480 和 SW620 细胞系，并相应地补充有 10% EE-FBS。分别为每个烧瓶接种近4.5 x 10 6个细胞和^6.5 x 10⁶ 个细胞，用于SW480和SW620。
2. 当细胞达到完全汇合时，每周收集两次上清液（每个烧瓶~10 mL）（SW480和SW620分别为~13.5 x 10 6和20 x 10⁶个细胞），并分裂。确保细胞的活力不低于99%，并且细胞在37°C的5%CO₂气氛中培养。
3. 将细胞培养物中的上清液收集到适当标记的 15 mL 管中。将收集的上清液在室温下以500× g 离心5分钟以除去细胞碎片。
4. 小心收集上清液，避免吸入碎片，放入标记的管中，并在4°C下以3，200× g 再次离心12分钟。
5. 将来自第二个离心步骤的上清液收集到无菌标记的 50 mL 管中。避免弄湿管子的边缘。确保上清液体积不超过45mL，并且管保持垂直。
6. 用无菌透明薄膜包裹管盖，并将上清液储存在-80°C的垂直位置。
   注意:每月对 支原体进行控制。和新鲜培养物上清液中的LPS污染（步骤6）。如果上清液中的内毒素水平超过 0.05 EU/mL，请验证可能发生污染的阶段并从头开始该过程。如果细胞培养物被 支原体菌污染。检测到，应停止从此类上清液中分离EV。

4. 从细胞培养上清液中分离EVs的

1. 准备0.22μm注射器过滤器和适当体积的注射器。用培养上清液（90 mL）制备两个试管。
2. 用上清液填充注射器并将过滤器连接到针头适配器。将带有过滤器的填充注射器放在 50 mL 管上。推动柱塞法兰并收集~90 mL滤液。
3. 将滤液（7mL）移液到超速离心管中（确保将相同体积移液到每个管中以适当平衡），并在4°C下以100，000× g 离心2小时。
   注意:EV 造粒的效率取决于许多因素（例如，转子类型、k 因子、迁移路径长度、介质粘度等），需要优化这些因素才能更好地回收 EV²⁰。
4. 使用无菌巴斯德移液管弃去上清液。使用长而过滤的移液器吸头收集剩余的颗粒，并将它们汇集到两个超速离心管中。用过滤的无内毒素 PBS 填充最多 7 mL 以冲洗 EV。
5. 在4°C下以100，000× g 离心PBS重悬的颗粒2小时。 使用无菌巴斯德移液器完全去除上清液，并向两个试管中加入 200 μL 过滤的无内毒素 PBS 以重悬 EV。轻轻移液 EV 颗粒以收集所有 EV。
6. 将 EVs 悬浮液转移到无菌 1.5 mL 试管中（如果可能，使用低蛋白结合管）。保留 10 μL 的 EV 悬浮液，用于制备用于纳米颗粒跟踪分析 （NTA） 和其他目的（例如蛋白质浓度测量）的稀释液。
7. 根据制造商的说明，用过滤后的PBS（1:1，000）稀释EV，以便通过NTA进行测量。用无菌透明薄膜包裹盖子来固定 EV 管。将电动汽车储存在-80°C。

5. 蛋白质印迹检测特异性标志物

1. 确定样品中的蛋白质水平（例如，通过Bradford测定），并用上样缓冲液制备样品（20μg）。通过将 5 μL 样品缓冲液 （4x） 和 2 μL 样品还原剂 （10x） 混合至总体积为 20 μL 来制备上样缓冲液。 将样品在70°C孵育10分钟。
2. 用SDS（10%-14%）制备聚丙烯酰胺凝胶，并将20μgEV加载到每个孔中。
3. 用电泳缓冲液（30gTris，144g甘氨酸，每1L10%SDS）在150V下运行电泳45分钟。
4. 在带有Towbin缓冲液（1.51gTris，7.2g甘氨酸，每0.5L10%甲醇）的转印机中将蛋白质从凝胶半干转印到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，在25V下1小时。
5. 将膜置于TBST缓冲液（1mL吐温，每1L100mLTris缓冲盐水（TBS 10x））中，用TBST缓冲液中的1%牛血清白蛋白（BSA）封闭，并在室温下在摇臂上孵育1小时。
6. 在1%BSA中加入稀释的（1:1，000）抗体，抗CD9¹ （克隆#D8O1A）或抗Alix¹ （克隆#3A9），并在摇臂上与膜在4°C下孵育过夜。去除抗体并用 10 mL 的 1x TBST 洗涤膜 3 次，持续 10 分钟。
7. 根据膜上的一抗，加入与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔或山羊抗小鼠（稀释度:1:2，000）二抗，并在室温下在摇杆上孵育1小时。 去除抗体并用10 mL的1x TBST洗涤膜3次，持续10分钟。
8. 以 1:1 的比例混合底物和鲁米诺，以获得 1 mL 溶液。将溶液倒在膜上。立即将膜放入成像系统的测量室中，选择化学发光模块，并在屏幕上可视化蛋白质条带。

6. 通过鲎变形细胞裂解物试验（LAL）测量内毒素水平

1. 根据制造商的建议对内毒素水平进行显色LAL测量。简而言之，使用基于内毒素与鲎变形细胞裂解物（LAL）相互作用的方法。该方法的检测限为 0.005 EU/mL。
   注意:LAL测定尽管有其局限性，但目前仍然是检测和量化科学或医学中使用的不同种类溶液和其他产品中的内毒素污染的标准方法⁸。该试剂盒的限制因素是重构变形细胞裂解物溶液的稳定性，如果在复溶后立即冷冻，其在-20°C下仅稳定1周。
2. 使用10倍稀释的EV和其他样品以及50倍稀释的血清。对于进一步的实验，仅使用低内毒素试剂，如EE-FBS、DMEM、PBS、RMI（<0.005 EU/mL）和无LPS的培养上清液。

7. EV样品中原核16S rRNA基因的检测

1. 从 EV 样品中分离 DNA。尽量保持试剂和分离部位无菌。测量DNA浓度和质量（例如，使用分光光度计）。
2. 进行聚合酶链反应（PCR），如前所述²¹。用溴化乙锭或SYBR绿制备1.5%琼脂糖凝胶，以在紫外光（UV）下可视化PCR产物。
3. 用TRIS-乙酸酯-EDTA缓冲液在75V下对样品和重量标记物进行电泳45分钟。使用成像系统可视化 DNA 条带。

8. 测定人单核细胞模型中用于刺激的有效LPS浓度

1. 在补充有 L-谷氨酰胺、葡萄糖和 2% EE-FBS 的 RPMI 1640 中制备 2 x 10⁶ 单核细胞/mL 单核细胞悬液。每孔加入 50 μL 的 96 孔组织培养板²² 的悬浮液。
2. 加入适量的LPS或培养基以获得以下最终浓度:0 pg/mL（对照）、10 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、1 ng/mL和100 ng/mL，在100 μL总体积的细胞悬液中。将每种LPS浓度一式三份。
3. 将细胞在37°C，5%CO₂下培养18小时。收集上清液。
4. 将上清液以2，000×g旋转5分钟。将上清液转移到新管中。根据制造商的程序，使用流式细胞仪使用细胞仪微球阵列（CBA）人细胞因子试剂盒测量收集的上清液中的TNF^8，23和IL-10 ²³浓度。

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结果

该方案的先决条件或强制性步骤是从试剂中排除可能的内毒素污染。所有使用的试剂，如FBS、DMEM、RPMI、PBS，甚至超速离心管，都必须不含内毒素（<0.005 EU/mL）。维持无内毒素污染并不容易，因为例如，用于细胞培养的常规/标准血清可能是其丰富的来源（0.364 EU/mL;见 表1）。

尽管该协议旨在分离内毒素含量低的EV，但表征分离的EV非常重要。在这项研究中，从两种...

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讨论

在过去几年中，正确分离电动汽车的方法变得越来越重要，使其能够进一步进行可靠的分析，例如，在获得可靠的组学和功能数据的背景下²⁴。根据以前的研究经验，似乎不仅隔离方法的类型，而且该过程期间的其他条件都可能很重要。使用耗尽电动汽车的FBS被广泛认为是必需品^25，26;然而，对电动汽车内毒素污染的监测往往被忽视。<...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alix (3A9) Mouse mAb	Cell Signaling Technology	2171
1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic	GoogLab Scientific	GBFT1250-R-NS
BD FACSCanto II Flow Cytometr	BD Biosciences
CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II	BD Biosciences	551809
CD9 (D8O1A) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	13174
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad Laboratories, Inc.	17001401
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)	Corning	10-013-CV
ELX800NB, Universal Microplate Reader	BIO-TEK INSTRUMENTS, INC
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044
Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin	Biowest	S1860-500
Gentamicin, 50 mg/mL	PAN – Biotech	P06-13100
Goat anti-Mouse IgG- HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004
Goat anti-Rabbit IgG- HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005
Immun-Blot PVDF Membrane	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1620177
LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE)	Enzo Life Sciences, Inc.	ALX-581-009-L002
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1703930
Nanoparticle Tracking Analysis	Malvern Instruments Ltd
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Invitrogen	NP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)	Invitrogen	NP0004
Parafilm	Sigma Aldrich	P7793	transparent film
Perfect 100-1000 bp DNA Ladder	EURx	E3141-01
PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit	Thermo Scientific	A39552
PP Oak Ridge Tube with sealing caps	Thermo Scientific	3929, 03613
RPMI 1640	RPMI-1640 (Gibco)	11875093
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystem	A24811
Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor	Thermo Scientific	75000100
Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1704401
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34577
SW480 cell line	American Type Culture Collection(ATCC)
SW480 cell line	American Type Culture Collection (ATCC)
Syringe filter 0.22 um	TPP	99722
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1703940	Transfer machine
Transfer pipette, 3.5 mL	SARSTEDT	86.1171.001