JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يعد البروتوكول الحالي ويقيم الخصائص الفيزيائية والاستجابة المناعية والتأثير الوقائي في الجسم الحي للقاح مساعد مستحلب نانوي جديد.

Abstract

جذبت اللقاحات المساعدة للمستحلب النانوي اهتماما واسعا بسبب صغر حجم الجسيمات واستقرارها الحراري العالي وقدرتها على تحفيز استجابات مناعية صحيحة. ومع ذلك ، فإن إنشاء سلسلة من البروتوكولات الشاملة لتقييم الاستجابة المناعية للقاح مساعد مستحلب نانوي جديد أمر حيوي. لذلك ، تحتوي هذه المقالة على إجراء صارم لتحديد الخصائص الفيزيائية والكيميائية للقاح (عن طريق المجهر الإلكتروني النافذ [TEM] ، ومجهر القوة الذرية [AFM] ، وتشتت الضوء الديناميكي [DLS]) ، واستقرار مستضد اللقاح والنظام (عن طريق اختبار الطرد المركزي عالي السرعة ، واختبار الاستقرار الديناميكي الحراري ، و SDS-PAGE ، واللطخة الغربية) ، والاستجابة المناعية المحددة (IgG1 ، IgG2a و IgG2b). باستخدام هذا النهج ، يمكن للباحثين تقييم دقيق للتأثير الوقائي للقاح مساعد مستحلب نانوي جديد في نموذج فأر MRSA252 قاتل. باستخدام هذه البروتوكولات ، يمكن تحديد مساعد اللقاح النانوي الواعد من حيث إمكانات المساعدة الفعالة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تساعد الطرق في تحسين اللقاحات الجديدة للتطوير المستقبلي.

Introduction

المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين (MRSA) هي أحد مسببات الأمراض الانتهازية مع واحدة من أعلى معدلات الإصابة في أجنحة وحدة العناية المركزة(ICU) 1 وأقسام أمراض القلب وأقسام الحروق في جميع أنحاء العالم. تظهر MRSA معدلات عالية من العدوى والوفيات ومقاومة واسعة للأدوية ، مما يمثل صعوبات كبيرة في العلاج السريري2. في قائمة الأولويات العالمية للبكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية الصادرة عن منظمة الصحة العالمية (WHO) في عام 2017 ، تم إدراج MRSA في الفئة3 الأكثر أهمية. لذلك هناك حاجة ماسة إلى لقاح ضد عدوى MRSA.

تم استخدام مادة الألومنيوم المساعدة لفترة طويلة ، والآلية المساعدة المساعدة واضحة نسبيا وآمنة وفعالة وجيدة التحمل4. المواد المساعدة الألومنيوم هي حاليا نوع من المواد المساعدة المستخدمة على نطاق واسع. يعتقد عموما أن المستضدات الممتصة على جزيئات ملح الألومنيوم يمكن أن تحسن الاستقرار وتعزز قدرة موقع الحقن على امتصاص المستضدات ، مما يوفر امتصاصا جيدا وإطلاقا بطيئا5. في الوقت الحالي ، يتمثل العيب الرئيسي للمواد المساعدة المصنوعة من الألومنيوم في أنها تفتقر إلى تأثير مساعد أو تظهر فقط تأثيرا مساعدا ضعيفا على بعض المستضدات المرشحة للقاح6. بالإضافة إلى ذلك ، تحفز المواد المساعدة المصنوعة من الألومنيوم تفاعلات فرط الحساسية بوساطة IgE5. لذلك ، من الضروري تطوير مواد مساعدة جديدة لتحفيز استجابة مناعية أقوى.

المواد المساعدة للمستحلب النانوي هي أنظمة تشتت غروية تتكون من الزيت والماء والمواد الخافضة للتوتر السطحي والمواد الخافضة للتوتر السطحي7. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المواد المساعدة مستقرة ديناميكيا حراريا ومتباينة الخواص ، ويمكن تعقيمها أو تثبيتها عن طريق الطرد المركزي عالي السرعة ، ويمكن تشكيلها تلقائيا في ظل ظروف تحضير معتدلة. العديد من المواد المساعدة للمستحلب (مثل MF59 ، سلسلة NB001-002 ، سلسلة AS01-04 ، إلخ) موجودة حاليا في السوق أو في مرحلة البحث السريري ، لكن أحجام جسيماتها أكبر من 160 نانومتر8. لذلك ، لا يمكن استغلال مزايا المستحضرات الطبية النانوية (1-100 نانومتر) (أي مساحة سطح محددة كبيرة ، وحجم الجسيمات الصغير ، وتأثير السطح ، والطاقة السطحية العالية ، وتأثير الحجم الصغير ، وتأثير الأنفاق الكمومية الكلية) بشكل كامل. في البروتوكول الحالي ، تم الإبلاغ عن مادة مساعدة جديدة تعتمد على تقنية المستحلب النانوي بحجم قطر 1-100 نانومتر لإظهار نشاط مساعد جيد9. اختبرنا بروتين مستضد لقاح الوحدة الفرعية لإعادة التركيب HI (α-hemolysin mutant [Hla] وعامل تحديد سطح أيون الحديد B [IsdB] الوحدة الفرعية N2 بروتين اندماج الشظايا النشط) ؛ تم وضع سلسلة من الإجراءات لفحص الخصائص الفيزيائية والاستقرار ، وتقييم استجابة الأجسام المضادة المحددة بعد الإعطاء العضلي ، واختبار التأثير الوقائي للقاح باستخدام نموذج العدوى الجهازية للفئران.

Protocol

أجريت التجارب على الحيوانات بناء على دليل استخدام ورعاية التجارب وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية وأخلاقيات المختبر التابعة للجامعة الطبية العسكرية الثالثة. تم استخدام إناث الفئران Balb / c ، بعمر 6-8 أسابيع ، في هذه الدراسة. تم الحصول على الحيوانات من مصادر تجارية (انظر جدول المواد).

1. تحضير بروتين مستضد MRSA HI

  1. الحصول على استنساخ IsdB و Hla من مصادر تجارية (انظر جدول المواد) ، وإجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم جينات IsdB و Hla ، وربط منتجاتها ببلازميد PGEX-6P-2 (تم الحصول عليها تجاريا ؛ انظر جدول المواد). الشاشة مع المتجه Xl / سلالة زرقاء من الإشريكية القولونية10.
  2. تحويل الاستنساخ الإيجابي إلى خلايا E. coli BL21 المختصة (انظر جدول المواد) وتضخيمها باستخدام ثقافة سمك القرش10.
  3. التعبير عن المستضد وعزله بعد الحث باستخدام مجموعات عزل الأيزوبروبيل-β-D-1-mercaptogalactopyranoside والكروماتوغرافيا متعددة الوسائط (MMC)11 (انظر جدول المواد).
  4. قم بتوصيف بروتين المستضد وتنقيته باستخدام جهاز تنقية كامل الأتمتة11.
    1. تقارب تنقية غوتاثيون S-transferase (GST) - البروتينات الموسومة من المحللين الذين تم تطهيرهم باستخدام راتنج كروماتوغرافيا التقارب المتاح تجاريا (انظر جدول المواد).
    2. تنقية البروتينات المؤتلفة بواسطة MMC11.
    3. قم بإزالة الذيفان الداخلي بطريقة فصل الطور Triton X-11411. باختصار ، امزج 1٪ Triton X-114 مع محلول البروتين المؤتلف عند 0 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لضمان محلول متجانس ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للسماح بتكوين مرحلتين.
  5. استخدم طريقة اختبار السموم الداخلية البكتيرية11 مع مجموعات السلاحف (انظر جدول المواد) للكشف عن تركيز السموم الداخلية. السم الداخلي لمستضد البروتين هو 0.06 EU / μg ، أقل من المعيار الدولي (1.5 EU / μg)10.
    1. قم بإجراء اختبار التداخل للقضاء على التأثير المحتمل لمنتج الاختبار على اكتشاف السموم الداخلية11.
      ملاحظة: وفقا للملحق 2020 من دستور الأدوية الصيني12 ، يجب أن يكون محتوى السموم الداخلية أقل من 5 EU / جرعة. تم حساب حساسية Limulus lysate (λ0.25 EU / mL) والحد الأقصى لنسبة التخفيف الفعال البالغة 33.312 بناء على MVD = cL / λ ، حيث L هي القيمة الحدية للذيفان الداخلي البكتيري لمادة الاختبار ، c هو تركيز محلول مادة الاختبار ، وعندما يتم التعبير عن L في EU / m ، c يساوي 1.0 مجم / مل. λ هي الحساسية المسماة (EU / mL) لكاشف سلطعون حدوة الحصان في طريقة الهلام.
  6. أعد تجميع المستضد (48 كيلو دالتون ، يحدده 12٪ صوديوم دوديسيل سلفات بولي أكريلاميد جل الكهربائي [SDS-PAGE]) عند 1.5 مجم / مل في ماء معقم بدون ذيفان داخلي أو محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (طريقة ثنائي كلورات الصوديوم) 11.
    ملاحظة: كان وقت ذروة البروتين 13.843 دقيقة ، وكان النقاء 99.4٪ (طريقة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء) ، وتم تخزين البروتين عند -70 درجة مئوية10. تم استخدام الحمض النووي الجينومي المستخرج من سلالة S. aureus MRSA252 (انظر جدول المواد) كقالب PCR. تم تضخيم جين IsdB باستخدام التمهيدي الأمامي 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
    C-39 والتمهيدي العكسي 59-TTTTCCTTTTGCGG
    CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC-39. تم تضخيم جين Hla باستخدام التمهيدي الأمامي PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC) والتمهيدي العكسي PHLAR (TAAGCGGCCGCTTAT
    CAATTTGTCATTTCTTC).

2. تحضير لقاح المستحلب النانوي

  1. وفقا لنسبة الكتلة 1: 6: 3 (وزن / وزن) ، أضف ثلاثة أنواع من السواغات بالتسلسل (إيزوبروبيل ميريستات ، زيت الخروع بولي أوكسي إيثيلين ، والبروبيلين جليكول ؛ انظر جدول المواد) إلى محلول بروتين مستضد HI (10 مجم / مل) وحركه جيدا. ثم أضيفي الماء النقي المعقم تدريجيا للوصول إلى حجم نهائي قدره 10 مل وقلبي عند 500 دورة في الدقيقة و 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تقريبا.
    ملاحظة: المستحلب النانوي المحضر في هذا البروتوكول له حجم 10 مل ، وكتل السواغات الثلاثة هي 0.34 جم و 2 جم و 1 جم على التوالي. محلول البروتين هنا هو محلول العمل ، 10 أضعاف تركيز المحلول النهائي.
  2. تحضير اللقاح المساعد للمستحلب النانوي (1 مجم / مل بروتين) بطرق استحلاب منخفضة الطاقة13 للحصول على محلول سائل واضح وشفاف.
    ملاحظة: تم تحضير المستحلب النانوي الفارغ (BNE) بطرق مماثلة ، باستثناء أنه تم استبدال الماء ب HI. تتضمن طريقة الاستحلاب المعتادة تسخين المراحل الخارجية والداخلية إلى حوالي 80 درجة مئوية للاستحلاب ثم تحريكها وتبريدها تدريجيا. في هذه العملية ، يتم استهلاك كمية كبيرة من الطاقة ، وأخيرا ، يتم الحصول على المستحلب.

3. التوصيف الفيزيائي واستقرار اللقاح المساعد للمستحلب النانوي

  1. حجم الجسيمات وجهد زيتا وتوصيف مؤشر تشتت البوليمر (PDI).
    1. تحضير 100 ميكرولتر من اللقاح المساعد للمستحلب النانوي وتخفيف 50 ضعفا بالماء للحقن. أضف 2 مل من العينة للكشف.
    2. راقب أحجام الجسيمات وإمكانات زيتا و PDI عند 25 درجة مئوية باستخدام Nano Zetasizer (ZS ؛ انظر جدول المواد).
  2. المجهر الإلكتروني النافذ (TEM)
    1. قم بتخفيف 10 ميكرولتر من لقاح المستحلب النانوي 50 ضعفا بالماء ، وضعه على شبكة نحاسية 100 شبكة مطلية بالكربون ، وصبغه بحمض الفوسفوتونجستيك 1٪ (انظر جدول المواد) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. قم بإزالة محلول حمض الفوسفوتونجستيك الزائد باستخدام ورق الترشيح.
    3. راقب التشكل تحت المجهر الإلكتروني النافذ (انظر جدول المواد). افحص ما إذا كانت المنتجات النهائية مستقرة ودائرية تقريبا داخل مجال رؤية المجهر الإلكتروني وما إذا كانت تظهر تشتتا جيدا.
  3. المجهر الإلكتروني الماسح (SEM)
    1. قم بتخفيف 10 ميكرولتر من اللقاح المساعد للمستحلب النانوي 50 ضعفا بالماء ، وقم بإسقاط 10 ميكرولتر من العينات المخففة مسبقا على رقاقة السيليكون ، وضعها في حاضنة يتم التحكم فيها بواسطة ترموستات 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    2. رش البلاتين المحضر على السيليكون لمدة 40 ثانية ويبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
    3. راقب الخصائص المورفولوجية للعينات المحضرة تحت المجهر الإلكتروني الماسح عالي الدقة (انظر جدول المواد). حدد إذا ما كانت العينات شبه مستقرة وكروية ومنتشرة جيدا داخل مجال الرؤية تحت المجهر الإلكتروني.
  4. الاستقرار المورفولوجي
    1. ضع 1 مل من عينات لقاح المستحلب النانوي في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، وقم بتقييم استقرار العينات الطازجة عن طريق الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة عند 13000 × جم في درجة حرارة الغرفة (25 درجة).
    2. راقب مظهر هذه العينات الطازجة ثم قم بإجراء اختبار الثبات الديناميكي الحراري لست دورات درجة حرارة (دورة واحدة: يخزن في 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة ، و 25 درجة مئوية لمدة 48 ساعة ، و 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة).
    3. بعد الطرد المركزي ، اترك العينات تقف لمدة 15 دقيقة لتحديد ما إذا كان هناك تأثير تيندال (ما إذا كانت العينة واضحة وشفافة تحت الضوء) وما إذا كانت إزالة الاستحلاب قد حدثت (كما هو موضح في التقسيم الطبقي الواضح بعد إزالة الاستحلاب).
  5. SDS-PAGE واللطخة الغربية
    1. رج العينات ، وامزج محلول 0.6 مل من الإيثانول المطلق و 0.3 مل من اللقاح ، وأجهزة الطرد المركزي (13000 × جم ، 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، 25 درجة مئوية).
    2. انقل طاف المحلول إلى أنبوب نظيف وقم بإذابة الراسب ب 0.3 mL من الماء. احصل على المحاليل الطافية والمترسبة (كل من المستحلب النانوي الفارغ واللقاح) بعد المعالجة بالإيثانول المطلق ومحلول الماء المقطر ، وقم بإجراء نفس التخفيف بمقدار 50 ضعفا.
    3. امزج 2.5 مل من هلام الفصل A و 2.5 مل من هلام الفصل B (انظر جدول المواد) ، وأضف 50 ميكرولتر من 10٪ بيرسلفات الأمونيوم ، وضع المحلول بسرعة في الصفيحة الزجاجية باستخدام ماصة. امزج 1 مل من الجل المركز A و 1 مل من الجل المركز B ، وأضف 20 ميكرولتر من 10٪ بيرسلفات الأمونيوم في اللوحة الزجاجية ، وأدخل مشطا بحجم مناسب ، وانتظر التصلب.
    4. أضف ما مجموعه 5 ميكرولتر من محلول عازلة لتحميل البروتين 5x إلى العينة المخففة التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.5.2 ، وقم بغلي العينة لمدة 5 دقائق.
    5. أضف 10 ميكرولتر من البروتين الساخن إلى البئر المقابل ، وأضف 5 ميكرولتر من علامة البروتين إلى بئر العلامة.
    6. قم بتوصيل القطب ، وقم بتشغيل مقياس الرحلان الكهربائي (انظر جدول المواد) ، واضبط الجهد على 300 فولت. قم بإيقاف تشغيل الطاقة عندما يصل الرحلان الكهربائي إلى 1 سم بعيدا عن الجزء السفلي من مطاط PAGE.
    7. قم بإزالة الجل واشطفه باستخدام ddH2O. أضف محلول تلطيخ Coomassie الأزرق الفاتح G-250 (انظر جدول المواد) لمدة 10 دقائق. اسكب محلول التلوين ، وشطف الجل مرتين باستخدام ddH2O.
    8. أضف محلول إزالة اللون المتاح تجاريا وقم بتسخين الجل في الميكروويف لمدة 1 دقيقة. هز الجل لمدة 10 دقائق ، وقم بتغيير محلول إزالة اللون بشكل متكرر حتى تصبح خلفية الجل واضحة. بعد ذلك ، قم بإجراء تصوير الجل (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: تمت معالجة اللطخة الغربية مسبقا، كما هو موضح في الخطوات 3-5-1-3-5-6.
    9. انقع ثلاث كتل من ورق الترشيح مع مخزن مؤقت لنقل الرحلان الكهربائي. انقع غشاء فلوريد البولي فينيليدين (PVDF) في الميثانول لمدة 30 ثانية وانقله باستخدام أداة نقل هلام شبه جاف (طبقتان من ورق الترشيح ، غشاء PVDF ، هلام كهربائي ، وطبقة واحدة من ورق الترشيح). استخدم جهدا 23 فولت لنقل الغشاء لمدة 23 دقيقة.
    10. قم بإزالة غشاء PVDF واغسله مرة واحدة باستخدام محلول ملحي ثلاثي المخزن - توين 20 (TBST) بعد النقل.
    11. ضع غشاء PVDF في محلول مانع للتسرب (محلول مسحوق حليب منزوع الدسم 5٪) وأغلقه طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    12. قم بإزالة غشاء PVDF واغسله ثلاث مرات باستخدام TBST أو 10 دقائق لكل منهما.
    13. احتضان مع الجسم المضاد الأساسي (من الفئران المحصنة مع مصل إيجابي). قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي11 (انظر جدول المواد) ليتم اختباره 500 ضعف (100 ضعف) مع TBST. ضع غشاء PVDF المسدود في الجسم المضاد الأساسي واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    14. قم بإزالة غشاء PVDF واغسله ثلاث مرات باستخدام TBST لمدة 10 دقائق لكل منهما.
    15. احتضان مع الجسم المضاد الثانوي (انظر جدول المواد). تمييع الفوسفاتيز القلوي المسمى (AP) المسمى الماعز الجسم المضاد الثانوي للفأر 5000 ضعف مع TBST. ضع غشاء PVDF في الجسم المضاد الثانوي واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
    16. قم بإزالة غشاء PVDF واغسله أربع مرات باستخدام TBST لمدة 10 دقائق لكل منهما.
    17. اغمر أغشية PVDF في خليط (يكفي فقط لامتصاص الغشاء) من ركيزة AP نيترو بلو تيترازول (NBT) و BCIP (5-برومو-4-كلورو-3'-ملح إندوليفوسفات p-toluidine) (انظر جدول المواد) للتلطيخ. النتيجة الإيجابية هي اللون الأرجواني.
      ملاحظة: يجب أن تكون النتائج شريطا أرجوانيا واضحا ، ويجب أن يكون شريط العينة والوزن الجزيئي للمستضد في نفس الموضع المسمى.

4. تقييم الاستجابة المناعية للأجسام المضادة لهذا اللقاح بعد تناوله عن طريق الحقن العضلي

ملاحظة: تم تحصين الفئران عن طريق الحقن العضلي للقاح المستحلب النانوي بعد تقرير منشور11. تم إعطاء الفئران برنامج تلفزيوني كعنصر تحكم سلبي. في أسبوع واحد بعد الانتهاء من ثلاثة تطعيمات ، تم جمع المصل من الفئران11. تم تحديد مستويات مصل IgG والفئات الفرعية من IgG1 و IgG2a و IgG2b كميا بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).

  1. طلاء المستضد: قم بتخفيف مستضد بروتين HI إلى 10 ميكروغرام / مل بمحلول طلاء وأضفه إلى لوحة ELISA عند 100 ميكرولتر / بئر. احتضان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: يتم تحضير محلول الطلاء عن طريق إذابة 1.6 جم من كربونات الصوديوم اللامائية و 2.9 جم من بيكربونات الصوديوم في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات.
  2. الختم: اغسل اللوحة (ثلاث دورات ، كل دورة 300 ميكرولتر). أضف 300 ميكرولتر من محلول الختم إلى كل بئر ، وأغلق الآبار لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يتم تحضير محلول الختم بإضافة Tween-20 وألبومين مصل الأبقار (BSA) إلى PBS. محتوى BSA في حل PBST هو 1٪.
  3. تخفيف المصل: قم بتخفيف مصل عينة الفئران 100 مرة باستخدام PBST (خذ 3 ميكرولتر من المصل وأضفه إلى 297 ميكرولتر من PBST والدوامة) ، واستخدم 100 ميكرولتر لكل عينة مصل. قم بتخفيف المصل الإيجابي ومصل التحكم السلبي 100 مرة باستخدام PBST بإضافة 4 ميكرولتر إلى 396 ميكرولتر من PBST ، ثم الخلط عن طريق الدوامة.
  4. تخفيف النسبة المزدوجة: أضف 200 ميكرولتر من المصل التجريبي المخفف أعلاه إلى الصف الأول من لوحة ELISA المطلية ، وأضف 100 ميكرولتر من PBST إلى جميع الآبارباستثناء الصفين الأول و 12. قم بإجراء تخفيف 1: 2 على التوالي من الصف الأول: اضبط الماصة على 100 ميكرولتر ، وانقل 100 ميكرولتر من الصف الأول إلى الصف الثاني ، واخلطها مع الماصة 10 مرات.
  5. خفف المصل إلى الصف 11 بنسب متعددة وتخلص من 100 ميكرولتر من السائل.
  6. أضف المصل السلبي والإيجابي المخفف إلى الآبار المقابلة في الصف 12 وفقا لنموذج العينة (انظر الجدول 1) -100 ميكرولتر / بئر.
  7. ختم لوحات ELISA مع غلاف بلاستيكي واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  8. تمييع الأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأر IgG-HRP (انظر جدول المواد) مع PBST في 1: 10,000.
  9. اغسل اللوحة (ثلاث دورات ، كل دورة 300 ميكرولتر). ثم أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف إلى كل بئر ، واحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
  10. تلطيخ وإنهاء: اغسل اللوحة (خمس دورات ، كل دورة 300 ميكرولتر). أضف محلول تلطيخ 3،3،5،5′-رباعي ميثيل بنزيدين (TMB) (100 ميكرولتر ؛ انظر جدول المواد) إلى كل بئر. ضع الألواح على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بعيدا عن الضوء ، ثم قم بإنهاء التفاعل على الفور ب 50 ميكرولتر من 2 M H2SO4.
  11. كشف قيمة الكثافة البصرية (OD 450) بواسطة علامة الإنزيم (اقرأ قيمة OD450 في غضون 15 دقيقة بعد الإنهاء).

5. تقييم الآثار في الجسم الحي للقاحات المساعدة الجديدة

ملاحظة: تم تقييم التأثير الوقائي لهذا اللقاح المستحلب النانوي في نموذج فأر MRSA252 مميت تم الحصول عليه تجاريا (انظر جدول المواد). وفقا للنتائج السابقة لمجموعتنا البحثية 14 ، فإن 1 ×10 8 وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) / الماوس هي أفضل جرعة لتقييم التأثير الوقائي للنموذج القاتل للعدوى البكتيرية MRSA252.

  1. استعادة السلالة: الحصول على أنبوب من MRSA252 المجمدة ، وتلقيح البكتيريا على ألواح مولر هينتون (MH) (A) (انظر جدول المواد) بواسطة "طريقة الخطوط الثلاثة" ، والاستزراع طوال الليل عند 37 درجة مئوية. قم بتنفيذ خطوات "طريقة ثلاثة أسطر" كما هو مذكور أدناه:
    1. أمسك حلقة التلقيح في اليد اليمنى ، وقم بكيها وتبريدها للحصول على حلقة من السائل البكتيري.
    2. أمسك لوحة أجار في اليد اليسرى (مع إبقاء الغطاء على الطاولة) فوق المنطقة اليسرى الأمامية من لهب مصباح الكحول بحيث تواجه اللوحة اللهب ، مما يمنع البكتيريا من دخول الهواء. باليد اليمنى ، حرك حلقة التلقيح للبكتيريا المصابة ذهابا وإيابا على سطح أجار بطريقة كثيفة ولكن غير متداخلة ، تغطي مساحة حوالي 1 / 5-1 / 6 من اللوحة بأكملها ، وهي المنطقة الأولى.
      ملاحظة: يجب أن تكون حلقة التلقيح والأجار على اتصال لطيف بزاوية 30 درجة -40 درجة ؛ يمكن تجنب إتلاف أجار عن طريق الانزلاق بقوة المعصم.
    3. كي البكتيريا الزائدة على حلقة التلقيح (يعتمد الكي أو تعقيم كل منطقة على كمية البكتيريا في العينة). بعد التبريد ، كرر الصفوف قبل الأخيرة 2-3 في النهاية وارسم منطقة ثانية (حوالي 1/4 من مساحة اللوحة).
    4. بعد الانتهاء من المنطقة الثانية ، قم بكي الحلقة ، وارسم المنطقة الثالثة بنفس الطريقة لملء اللوحة بأكملها.
    5. بعد رسم الخطوط ، ضع الطبق على غطاء الطبق ، وحدد الطبق ، واحتضنه في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة لمراقبة توزيع المستعمرات على سطح الآجار. ركز الانتباه على ما إذا كانت مستعمرة واحدة معزولة ، ولاحظ خصائص المستعمرة (مثل الحجم والشكل والشفافية والتصبغ).
  2. التنشيط البكتيري: في اليوم التالي ، خذ دورقين من الخفق سعة 50 مل وأضف 20 مل من وسط MH (B) (انظر جدول المواد) إلى كل منهما. اختر مستعمرتين مفردتين بطرف ماصة 10 ميكرولتر وأضفهما إلى الهزازات. احتضان المستعمرات بين عشية وضحاها عند 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. التنشيط الثانوي: في اليوم التالي ، خذ دورقين من الخفق سعة 50 مل ، يحتوي كل منهما على 20 مل من وسط MH (B). قم بإزالة 200 ميكرولتر من المحلول البكتيري من الخلاط الذي يحتوي على البكتيريا المنشطة الأولى ، وأضفها إلى الدورقين الجديدين اللذين يحتويان على 20 مل من وسط MH (B) ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة لمدة 5 ساعات.
  4. اجمع المحلول البكتيري المنشط الثاني في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، وافصله عند 3000 × جم لمدة 20 دقيقة ، وتخلص من المادة الطافية.
  5. إعادة تعليق البكتيريا المترسبة في 40 مل من المياه المالحة.
  6. قياس قيمة OD600 من المحلول البكتيري والتكيف مع 1 مع المياه المالحة. في هذا الوقت ، كانت الكمية البكتيرية من MRSA252 في تجربتنا 2 × 109 CFU / mL.
  7. تمييع المحلول البكتيري مع OD600 من 1 إلى تركيز 1 × 109 CFU / مل.
  8. قسم عشوائيا 48 فأرا Balb / c إلى أربع مجموعات (n = 12).
    ملاحظة: المجموعة الأولى: مجموعة PBS؛ المجموعة الثانية: المجموعة الضابطة BNE ؛ المجموعة الثالثة: مجموعة مستضد [بروتين] ساذجة ؛ المجموعة الرابعة: مجموعة اللقاحات المساعدة للمستحلب النانوي.
  9. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من 100 ملغ / كغ من 1٪ بنتوباربيتال الصوديوم.
  10. تشعيع الفئران بمصباح العلاج الطبيعي بالأشعة تحت الحمراء (انظر جدول المواد) لمدة 1 دقيقة تقريبا للتسبب في توسع الأوعية في الوريد الذيل.
  11. تحدي الفئران بحقن المحلول البكتيري المخفف (الخطوة 5.7) في وريد الذيل ، 100 ميكرولتر لكل فأر.
  12. ضع الفئران تحت مصباح العلاج الطبيعي بالأشعة تحت الحمراء حتى تتمكن من العودة إلى النشاط الطبيعي.
  13. مراقبة وتسجيل بقاء الفئران كل 12 ساعة لمدة 10 أيام.
  14. القتل الرحيم للفئران التي نجت من الهجوم عن طريق الحقن داخل الصفاق من 100 ملغم / كغم من 1٪ بنتوباربيتال الصوديوم.

النتائج

تم تقييم بروتوكول تحضير اللقاح المساعد للمستحلب النانوي والاختبارات المختبرية وفي الجسم الحي لهذا اللقاح. تم استخدام TEM و AFM و DLS لتحديد الخصائص المهمة لجهد زيتا وحجم الجسيمات على سطح هذه العينة (الشكل 1). أظهر SDS-PAGE والنشاف الغربي أن كمية المستضد في المادة المترسبة...

Discussion

يلعب IsdB ، وهو بروتين سطحي مثبت على جدار الخلية البكتيرية وينظمه الحديد ، دورا مهما في عملية الحصول على حديدالهيم 15. Hla ، سم ألفا ، هو من بين السموم البكتيرية الأكثر فعالية المعروفة في MRSA ، ويمكن أن تشكل المسام في الخلايا حقيقية النواة وتتداخل مع الالتصاق والخلايا الظه...

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح في هذا العمل.

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث من قبل رقم 2021YFC2302603 من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين ، ورقم 32070924 و 32000651 من NSFC ، ورقم 2019jcyjA-msxmx0159 من برنامج مشروع مؤسسة العلوم الطبيعية في تشونغتشينغ.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11Eppendorf, Germany 5424000495
96-well platesCorning Incorporated, USACLS3922
AFM Dimension FastScanBRUKER, Germany null
Alcohol lampShenzhen Yibaxun Technology Co.,ChinaYBS-AA-11408
Balb/c mice Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. 
BCIP/NBTFuzhou Maixin Biotechnology Development Company,ChinaBCIP/NBT
Bio-Rad 6.0 microplate readerBio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USAnull
BL21 Competent CellMerck millipore,Germany70232-3CN
BSA-100GSigma-Aldrich, USAB2064-100G
Centrifuge 5810 REppendorf, Germany 5811000398
Coomassie bright blue G-250 staining solutionMIKX,ChinaDB236
Decolorization solutionBOSTER,ChinaAR0163-2
Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420Shanghai Yuejin Medical Device Factory, Chinanull
Electrophoresis apparatusBeijing Liuyi Instrument Factory, ChinaDYCZ-25D
Gel imageTanon, USAnull
Glutathione-Sepharose Resin GSTMei5bio,Chinaaffinity chromatography resin
H2SO4Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China7664-93-9
HI recombinant proteinThird Military Medical University,China110-27-0
HRP -Goat Anti-Mouse IgGBiodragon, ChinaBF03001
HRP- Goat anti-mouse IgG1Biodragon, ChinaBF03002R
HRP- Goat anti-mouse IgG2aBiodragon, ChinaBF03003R
HRP- Goat anti-mouse IgG2bBiodragon, ChinaBF03004R
Inoculation loopHaimen Feiyue Co.,LTD,ChinaYR-JZH-1UL
IsdB and Hla clonesShanghai Jereh Biotechnology Co,Chinanull
Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant)SEPPIC, Francenull
isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranosidefdbio,ChinaFD3278-1
LB bouillon culture-mediumBeijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China02-136
Lnfrared physiotherapy lampGuangzhou Runman Medical Equipment Co.,China7600
Low temperature refrigerated centrifugeEppendorf, Germany null
Malvern NANO ZSMalvern Instruments Ltd., UKnull
MH(A) mediumBeijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China02-051
MH(B) mediumBeijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China02-052
Micro plate washing machine 405 LSRSBio Tek Instruments,Inc Highland  Park,USAnull
Mini-TBC Compact Film Transfer InstrumentBeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China1658030
MMC packingTOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD0022818
MRSA252USA, ATCCnull
Nanodrop ultraviolet spectrophotometerThermo Scientific, USAnull
New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kitDAKEWE, China8012011
PBSbiosharp, Chinanull
PCR, AmplifierThermal Cycler, USAnull
pGEX-target gene recombinant plasmidShanghai Jereh Biotechnology Co,ChinaB3528G
Phosphotungstic acidG-CLONE, ChinaCS1231-25g
pipetteEppendorf, Germany 3120000844
polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant)Aladdin, ChinaK400327-1kg
Primary antibodyLaboratory homemade:from immunized mice with positive seranullSee Reference 11 for details
propylene glycol (pharmaceutic adjuvant)Sigma-Aldrich, USAP4347-500ML
Protein MarkerThermo Scientufuc, USA26616
PVDF TRANSFER MEMBRANEInvitrogen,USA88518
Scanning Electron MicroscopeJEOL,JapanJSM-IT800
Sodium pentobarbitalMerck,GermanyTc-P8411
Talos L120C TEMThermo Fisher, USAnull
TMB color solutionTIAN GEN, ChinaPA107-01
Turtle kitsXiamen Bioendo Technology Co.,LTDES80545
Tween-20Macklin, China9005-64-5

References

  1. Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).
  2. Lakhundi, S., Zhang, K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology. Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020 (2018).
  3. Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens. Pathogens. 10 (10), 1310 (2021).
  4. Goullé, J. P., Grangeot-Keros, L. Aluminum and vaccines: Current state of knowledge. Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).
  5. Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
  6. Geoghegan, S., O'Callaghan, K. P., Offit, P. A. Vaccine safety: myths and misinformation. Frontiers in Microbiology. 11, 372 (2020).
  7. Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Patents on Nanotechnology. 14 (4), 276-293 (2020).
  8. Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
  9. Chen, B. H., Inbaraj, B. S. Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability. Nutrients. 11 (5), 1052 (2019).
  10. Zuo, Q. F., et al. Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection. PLoS One. 8 (12), e81212 (2013).
  11. Sun, H. W., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
  12. National Pharmacopoeia Committee. . Chinese Pharmacopoeia. , 1088 (2020).
  13. Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
  14. Zeng, H., et al. An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia. The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).
  15. Roy, U., Kornitzer, D. Heme-iron acquisition in fungi. Current Opinion in Microbiology. 52, 77-83 (2019).
  16. Saeed, K., et al. Bacterial toxins in musculoskeletal infections. Journal of Orthopaedic Research. 39 (2), 240-250 (2021).
  17. Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption. Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).
  18. Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).
  19. Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers. Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).
  20. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
  21. Francis, M. J. Recent advances in vaccine technologies. The Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice. 48 (2), 231-241 (2018).
  22. Tripathi, N. K., Shrivastava, A. Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines. Frontiers in Immunology. 9, 1919 (2018).
  23. Wilder-Smith, A. Dengue vaccine development: status and future. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).
  24. Korneev, K. V. Mouse models of sepsis and septic shock. Molecular Biology. 53 (5), 799-814 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 199

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved