Avaliação da Resposta Imune de uma Vacina Adjuvante em Nanoemulsão Contra a Infecção por Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (MRSA)

Resumo

O presente protocolo prepara e avalia as propriedades físicas, a resposta imune e o efeito protetor in vivo de uma nova vacina adjuvante em nanoemulsão.

Resumo

As vacinas adjuvantes em nanoemulsão têm atraído grande atenção devido ao seu pequeno tamanho de partículas, alta estabilidade térmica e capacidade de induzir respostas validamente imunes. No entanto, o estabelecimento de uma série de protocolos abrangentes para avaliar a resposta imune de uma nova vacina adjuvante em nanoemulsão é vital. Portanto, este artigo apresenta um procedimento rigoroso para determinar as características físico-químicas de uma vacina (por microscopia eletrônica de transmissão [MET], microscopia de força atômica [AFM] e espalhamento dinâmico de luz [DLS]), a estabilidade do antígeno e do sistema vacinal (por um teste de centrífuga de alta velocidade, um teste de estabilidade termodinâmica, SDS-PAGE e western blot) e a resposta imune específica (IgG1, IgG2a e IgG2b). Usando essa abordagem, os pesquisadores podem avaliar com precisão o efeito protetor de uma nova vacina adjuvante de nanoemulsão em um modelo de camundongo MRSA252 letal. Com esses protocolos, pode-se identificar o adjuvante vacinal em nanoemulsão mais promissor em termos de potencial adjuvante efetivo. Além disso, os métodos podem ajudar a otimizar novas vacinas para desenvolvimento futuro.

Introdução

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) é um patógeno oportunista com uma das mais altas taxas de infecção em enfermarias de unidade de terapia intensiva (UTI)¹, departamentos de cardiologia e departamentos de queimados em todo o mundo. MRSA apresenta altas taxas de infecção, mortalidade e ampla resistência a drogas, apresentando grandes dificuldades no tratamento clínico². Na Lista Global Prioritária de Bactérias Resistentes a Antibióticos divulgada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) em 2017, o MRSA foi listado na categoria³ mais crítica. Uma vacina contra a infecção po....

Protocolo

Os experimentos com animais foram conduzidos com base no manual de uso e cuidados com animais de experimentação e foram aprovados pelo Comitê de Ética e Bem-Estar Animal de Laboratório da Terceira Universidade Militar de Medicina. Camundongos Balb/c fêmeas, com 6-8 semanas de idade, foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).

1. Preparação da proteína do antígeno MRSA HI

1. Obter clones IsdB e Hla de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais), realizar amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar genes

Resultados

Avaliou-se o protocolo de preparação da vacina adjuvante em nanoemulsão e os testes in vitro e in vivo desta vacina. MET, AFM e DLS foram usados para determinar as características importantes do potencial zeta e do tamanho de partícula na superfície desta amostra (Figura 1). SDS-PAGE e western blotting mostraram que a quantidade de antígeno no precipitado e sobrenadante não se degradou significativamente após a centrifugação, o que indicou que a vacina estava est.......

Discussão

A IsdB, uma proteína de superfície bacteriana ancorada na parede celular e regulada pelo ferro, desempenha um papel importante no processo de obtenção do ferro heme¹⁵. A Hla, toxina alfa, está entre as toxinas bacterianas mais eficazes conhecidas em MRSA, podendo formar poros em células eucarióticas e interferir na adesão e nas células epiteliais¹⁶. Em nosso estudo, uma nova proteína antigênica (HI) de MRSA de recombinação foi construída e ex.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11	Eppendorf, Germany	5424000495
96-well plates	Corning Incorporated, USA	CLS3922
AFM Dimension FastScan	BRUKER, Germany	null
Alcohol lamp	Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China	YBS-AA-11408
Balb/c mice	Beijing HFK Bioscience Co. Ltd.
BCIP/NBT	Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China	BCIP/NBT
Bio-Rad 6.0 microplate reader	Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA	null
BL21 Competent Cell	Merck millipore,Germany	70232-3CN
BSA-100G	Sigma-Aldrich, USA	B2064-100G
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
Coomassie bright blue G-250 staining solution	MIKX,China	DB236
Decolorization solution	BOSTER,China	AR0163-2
Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420	Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China	null
Electrophoresis apparatus	Beijing Liuyi Instrument Factory, China	DYCZ-25D
Gel image	Tanon, USA	null
Glutathione-Sepharose Resin GST	Mei5bio,China	affinity chromatography resin
H2SO4	Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China	7664-93-9
HI recombinant protein	Third Military Medical University,China	110-27-0
HRP -Goat Anti-Mouse IgG	Biodragon, China	BF03001
HRP- Goat anti-mouse IgG1	Biodragon, China	BF03002R
HRP- Goat anti-mouse IgG2a	Biodragon, China	BF03003R
HRP- Goat anti-mouse IgG2b	Biodragon, China	BF03004R
Inoculation loop	Haimen Feiyue Co.,LTD,China	YR-JZH-1UL
IsdB and Hla clones	Shanghai Jereh Biotechnology Co,China	null
Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant)	SEPPIC, France	null
isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside	fdbio,China	FD3278-1
LB bouillon culture-medium	Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China	02-136
Lnfrared physiotherapy lamp	Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China	7600
Low temperature refrigerated centrifuge	Eppendorf, Germany	null
Malvern NANO ZS	Malvern Instruments Ltd., UK	null
MH(A) medium	Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China	02-051
MH(B) medium	Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China	02-052
Micro plate washing machine 405 LSRS	Bio Tek Instruments,Inc Highland  Park,USA	null
Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument	BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China	1658030
MMC packing	TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD	0022818
MRSA252	USA, ATCC	null
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer	Thermo Scientific, USA	null
New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit	DAKEWE, China	8012011
PBS	biosharp, China	null
PCR, Amplifier	Thermal Cycler, USA	null
pGEX-target gene recombinant plasmid	Shanghai Jereh Biotechnology Co,China	B3528G
Phosphotungstic acid	G-CLONE, China	CS1231-25g
pipette	Eppendorf, Germany	3120000844
polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant)	Aladdin, China	K400327-1kg
Primary antibody	Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera	null	See Reference 11 for details
propylene glycol (pharmaceutic adjuvant)	Sigma-Aldrich, USA	P4347-500ML
Protein Marker	Thermo Scientufuc, USA	26616
PVDF TRANSFER MEMBRANE	Invitrogen,USA	88518
Scanning Electron Microscope	JEOL,Japan	JSM-IT800
Sodium pentobarbital	Merck,Germany	Tc-P8411
Talos L120C TEM	Thermo Fisher, USA	null
TMB color solution	TIAN GEN, China	PA107-01
Turtle kits	Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD	ES80545
Tween-20	Macklin, China	9005-64-5