Avaliação da Resposta Imune de uma Vacina Adjuvante em Nanoemulsão Contra a Infecção por Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (MRSA)

Resumo

O presente protocolo prepara e avalia as propriedades físicas, a resposta imune e o efeito protetor in vivo de uma nova vacina adjuvante em nanoemulsão.

Resumo

As vacinas adjuvantes em nanoemulsão têm atraído grande atenção devido ao seu pequeno tamanho de partículas, alta estabilidade térmica e capacidade de induzir respostas validamente imunes. No entanto, o estabelecimento de uma série de protocolos abrangentes para avaliar a resposta imune de uma nova vacina adjuvante em nanoemulsão é vital. Portanto, este artigo apresenta um procedimento rigoroso para determinar as características físico-químicas de uma vacina (por microscopia eletrônica de transmissão [MET], microscopia de força atômica [AFM] e espalhamento dinâmico de luz [DLS]), a estabilidade do antígeno e do sistema vacinal (por um teste de centrífuga de alta velocidade, um teste de estabilidade termodinâmica, SDS-PAGE e western blot) e a resposta imune específica (IgG1, IgG2a e IgG2b). Usando essa abordagem, os pesquisadores podem avaliar com precisão o efeito protetor de uma nova vacina adjuvante de nanoemulsão em um modelo de camundongo MRSA252 letal. Com esses protocolos, pode-se identificar o adjuvante vacinal em nanoemulsão mais promissor em termos de potencial adjuvante efetivo. Além disso, os métodos podem ajudar a otimizar novas vacinas para desenvolvimento futuro.

Introdução

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) é um patógeno oportunista com uma das mais altas taxas de infecção em enfermarias de unidade de terapia intensiva (UTI)¹, departamentos de cardiologia e departamentos de queimados em todo o mundo. MRSA apresenta altas taxas de infecção, mortalidade e ampla resistência a drogas, apresentando grandes dificuldades no tratamento clínico². Na Lista Global Prioritária de Bactérias Resistentes a Antibióticos divulgada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) em 2017, o MRSA foi listado na categoria³ mais crítica. Uma vacina contra a infecção por MRSA é, portanto, urgentemente necessária.

O adjuvante de alumínio é utilizado há muito tempo, e o mecanismo auxiliar do adjuvante é relativamente claro, seguro, eficaz e bem tolerado⁴. Os adjuvantes de alumínio são atualmente um tipo de adjuvante amplamente utilizado. Acredita-se que antígenos adsorvidos em partículas de sal de alumínio possam melhorar a estabilidade e aumentar a capacidade do local de injeção de captar antígenos, proporcionando boa absorção e liberação lenta⁵. Atualmente, a principal desvantagem dos adjuvantes de alumínio é que eles não têm efeito adjuvante ou exibem apenas um fraco efeito adjuvante sobre alguns antígenos candidatos à vacina⁶. Além disso, adjuvantes de alumínio induzem reações de hipersensibilidade mediadas por IgE⁵. Portanto, é necessário desenvolver novos adjuvantes para estimular uma resposta imune mais forte.

Os adjuvantes em nanoemulsão são sistemas de dispersão coloidal compostos por óleo, água, surfactantes e cosurfactantes⁷. Além disso, os adjuvantes são termodinamicamente estáveis e isotrópicos, podem ser autoclavados ou estabilizados por centrifugação de alta velocidade e podem ser formados espontaneamente sob condições leves de preparação. Vários adjuvantes de emulsão (como MF59, NB001-002 series, AS01-04 series, etc.) estão atualmente no mercado ou em fase de pesquisa clínica, mas seus tamanhos de partículas são superiores a 160 nm⁸. Portanto, as vantagens das preparações medicinais em nanoescala (1-100 nm) (ou seja, grande área de superfície específica, tamanho de partícula pequeno, efeito de superfície, alta energia de superfície, efeito de tamanho pequeno e efeito de tunelamento macroquântico) não podem ser totalmente exploradas. No presente protocolo, um novo adjuvante baseado na tecnologia de nanoemulsão com um tamanho de diâmetro de 1-100 nm foi relatado como exibindo boa atividade adjuvante⁹. Testamos a proteína de antígeno vacinal de subunidade de recombinação HI (α-hemolisina mutante [Hla] e fator determinante de superfície do íon Fe B [IsdB] subunidade N2 proteína de fusão de fragmento ativo); Uma série de procedimentos foi estabelecida para examinar as propriedades físicas e a estabilidade, avaliar sua resposta específica de anticorpos após administração intramuscular e testar o efeito protetor da vacina usando um modelo de infecção sistêmica em camundongos.

Protocolo

Os experimentos com animais foram conduzidos com base no manual de uso e cuidados com animais de experimentação e foram aprovados pelo Comitê de Ética e Bem-Estar Animal de Laboratório da Terceira Universidade Militar de Medicina. Camundongos Balb/c fêmeas, com 6-8 semanas de idade, foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).

1. Preparação da proteína do antígeno MRSA HI

1. Obter clones IsdB e Hla de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais), realizar amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar genes IsdB e Hla e ligar seus produtos ao plasmídeo PGEX-6P-2 (obtido comercialmente; ver Tabela de Materiais). Tela com o vetor Xl/cepa azul de Escherichia coli¹⁰.
2. Transformar o clone positivo em células competentes de E. coli BL21 (ver Tabela de Materiais) e amplificar com cultura de tubarão¹⁰.
3. Expresse o antígeno e isole após indução com isopropil-β-D-1-mercaptogalactopiranosídeo e kits de isolados de cromatografia multimodal (MMC)¹¹(ver Tabela de Materiais).
4. Caracterizar a proteína antigênica e purificá-la com um purificador de automação completa¹¹.
   1. Proteínas marcadas com gutationa S-transferase (GST) purificadas por afinidade a partir de lisados limpos usando uma resina cromatográfica de afinidade disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais).
   2. Purificar as proteínas recombinantes por MMC¹¹.
   3. Remover a endotoxina pelo método de separação de fases Triton X-114¹¹. Resumidamente, misturar Triton X-114 a 1% com eluato de proteína recombinante a 0 °C durante 5 minutos para garantir uma solução homogénea e incubar a 37 °C durante 5 minutos para permitir a formação de duas fases.
5. Use o método de teste de endotoxina bacteriana¹¹ com kits Turtle (ver Tabela de Materiais) para detectar a concentração de endotoxina. A endotoxina para antígeno proteico é de 0,06 EU/μg, inferior ao padrão internacional (1,5 EU/μg)¹⁰.
   1. Realizar um teste de interferência para eliminar a possível influência do produto em teste na detecção de endotoxinas¹¹.
      NOTA: De acordo com o apêndice 2020 da farmacopeia chinesa¹², o teor de endotoxinas deve ser inferior a 5 EU/dose. A sensibilidade do lisado de Limulus (λ0,25 EU/mL) e a razão de diluição efetiva máxima de 33,3 foram calculadas¹² com base em MVD = cL/λ, onde L é o valor-limite de endotoxina bacteriana para o artigo de teste, c é a concentração da solução do artigo de teste e, quando L é expresso em EU/m, c é igual a 1,0 mg/mL. λ é a sensibilidade marcada (EU/mL) do reagente de caranguejo-ferradura no método do gel.
6. Recombinar o antígeno (48 kDa, determinado por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio a 12% [SDS-PAGE]) a 1,5 mg/mL em água estéril sem endotoxina ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) (método do diclorato de sódio)¹¹.
   NOTA: O tempo de pico da proteína foi de 13,843 min, a pureza foi de 99,4% (método de cromatografia líquida de alta eficiência) e a proteína foi armazenada a -70 °C¹⁰. DNA genômico extraído da cepa de S. aureus MRSA252 (ver Tabela de Materiais) foi usado como modelo de PCR. O gene IsdB foi amplificado usando o primer forward 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
   C-39 e o primer reverso 59-TTTTCCTTTTGCGG
   CCGCCTATGTCATATCTTTATTATTAGATTCTTC-39. O gene Hla foi amplificado usando o primer forward PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC) e o primer reverso PHLAR (TAAGCGGCCGCTTAT
   CAATTTGTCATTTCTTC).

2. Preparação da vacina em nanoemulsão

1. De acordo com a relação de massa de 1:6:3 (p/p), adicione três tipos de excipientes em sequência (miristato de isopropilo, óleo de rícino de polioxietileno e propilenoglicol; ver Tabela de Materiais) à solução de proteína do antígeno HI (10 mg/mL) e mexa bem. Em seguida, adicionar água pura gradualmente esterilizada até atingir um volume final de 10 mL e agitar a 500 rpm e 25 °C por aproximadamente 20 min.
   NOTA: A nanoemulsão preparada neste protocolo tem um volume de 10 mL, e as massas dos três excipientes são de 0,34 g, 2 g e 1 g, respectivamente. A solução proteica aqui é a solução de trabalho, 10 vezes a concentração da solução final.
2. Preparar a vacina adjuvante em nanoemulsão (1 mg/mL de proteína) por métodos de emulsificação de baixa energia¹³ para obter uma solução líquida transparente e límpida.
   NOTA: A nanoemulsão em branco (BNE) foi preparada por métodos semelhantes, exceto que a água foi substituída por HI. O método de emulsificação usual envolve o aquecimento das fases externa e interna a aproximadamente 80 °C para emulsificação e, em seguida, agitá-las e resfriá-las gradualmente. Nesse processo, uma grande quantidade de energia é consumida e, finalmente, a emulsão é obtida.

3. Caracterização física e estabilidade da vacina adjuvante em nanoemulsão

1. Tamanho de partícula, potencial zeta e caracterização do índice de dispersão de polímeros (PDI).
   1. Preparar 100 μL da vacina adjuvante em nanoemulsão e diluir 50 vezes com água para injeção. Adicionar 2 mL de amostra para detecção.
   2. Observe os tamanhos de partículas, potencial zeta e PDI a 25 °C usando um Nano Zetasizer (ZS; ver Tabela de Materiais).
2. Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
   1. Diluir 10 μL de vacina em nanoemulsão 50 vezes com água, colocar em uma grade de cobre de 100 malhas revestida de carbono e corar com ácido fosfotúngstico a 1% (ver Tabela de Materiais) por 5 minutos à temperatura ambiente.
   2. Remova o excesso de solução de ácido fosfotúngstico com papel de filtro.
   3. Observe a morfologia sob um microscópio eletrônico de transmissão (ver Tabela de Materiais). Examine se os produtos acabados são quase estáveis e circulares dentro do campo de visão do microscópio eletrônico e se eles exibem boa dispersão.
3. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
   1. Diluir 10 μL da vacina adjuvante em nanoemulsão 50 vezes com água, soltar 10 μL de amostras pré-diluídas em um wafer de silício e colocar em uma incubadora controlada por termostato a 37 °C por 24 horas.
   2. Borrifar a platina preparada sobre o silício durante 40 s e arrefecer até à temperatura ambiente.
   3. Observar as propriedades morfológicas das amostras preparadas em microscópio eletrônico de varredura de alta resolução (ver Tabela de Materiais). Determine se as amostras são quase estáveis, esféricas e bem dispersas dentro do campo de visão sob o microscópio eletrônico.
4. Estabilidade morfológica
   1. Colocar 1 mL de amostras de vacina em nanoemulsão em tubos de microcentrífuga e avaliar a estabilidade de amostras frescas centrifugando por 30 min a 13.000 x g à temperatura ambiente (25°).
   2. Observe a aparência dessas amostras frescas e, em seguida, realize um teste de estabilidade termodinâmica de seis ciclos de temperatura (um ciclo: armazenar a 4 °C por 48 h, 25 °C por 48 h e 37 °C por 48 h).
   3. Após a centrifugação, deixar as amostras repousarem durante 15 minutos para determinar se existe um efeito Tyndall (se a amostra é clara e transparente sob luz) e se ocorreu desmulsificação (demonstrada por estratificação clara após a desmulsificação).
5. SDS-PAGE e western blot
   1. Agitar as amostras, misturar uma solução de 0,6 ml de etanol absoluto e 0,3 ml de vacina e centrifugar (13.000 x g, 30 min à temperatura ambiente, 25 °C).
   2. Transfira o sobrenadante da solução para um tubo limpo e dissolva o precipitado com 0,3 ml de água. Obter as soluções sobrenadante e precipitada (nanoemulsão em branco e vacina) após o tratamento com etanol absoluto e solução de água destilada, e realizar a mesma diluição de 50 vezes.
   3. Misturar 2,5 ml de gel de separação A e 2,5 ml de gel de separação B (ver Tabela de Materiais), adicionar 50 μL de persulfato de amónio a 10% e colocar rapidamente a solução na placa de vidro com uma pipeta. Misturar 1 ml de gel concentrado A e 1 ml de gel concentrado B, adicionar 20 μL de persulfato de amónio a 10% na placa de vidro, introduzir um pente de tamanho adequado e aguardar a solidificação.
   4. Adicionar um total de 5 μL de solução tampão de carga proteica de 5x à amostra diluída obtida na etapa 3.5.2 e ferver a amostra durante 5 minutos.
   5. Adicionar 10 μL de proteína aquecida ao poço correspondente e adicionar 5 μL de marcador de proteína ao poço marcador.
   6. Conecte o eletrodo, ligue o medidor de eletroforese (veja Tabela de Materiais) e ajuste a tensão para 300 V. Desligue a energia quando a eletroforese atingir 1 cm de distância da parte inferior da borracha PAGE.
   7. Retire o gel e enxágue com ddH₂O. Adicione a solução corante G-250 azul brilhante Coomassie (ver Tabela de Materiais) por 10 min. Despeje a solução corante e enxágue o gel duas vezes com ddH₂O.
   8. Adicione a solução de descoloração disponível comercialmente e leve ao micro-ondas o gel por 1 min. Agite o gel por 10 minutos e troque repetidamente a solução de descoloração até que o fundo do gel esteja claro. Em seguida, execute imagens em gel (consulte Tabela de Materiais).
      NOTA: O western blot foi pré-processado, conforme descrito nas etapas 3.5.1-3.5.6.
   9. Mergulhe três blocos de papel de filtro com um tampão de transferência de eletroforese. Mergulhe a membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) em metanol por 30 s e transfira com um instrumento de transferência de gel semi-seco (duas camadas de papel de filtro, membrana de PVDF, gel de eletroforese e uma camada de papel de filtro). Use uma tensão de 23 V para transferir a membrana por 23 min.
   10. Remova a membrana de PVDF e lave uma vez com solução salina tamponada tris-Tween 20 (TBST) após a transferência.
   11. Colocar a membrana de PVDF em solução de vedação (solução de leite em pó desnatado a 5%) e selar durante a noite a 4 °C.
   12. Retire a membrana de PVDF e lave três vezes com TBST ou 10 min cada.
   13. Incubar com o anticorpo primário (de camundongos imunizados com soro positivo). Diluir o anticorpo primário¹¹ (ver Tabela de Materiais) para ser testado 500 vezes (100 vezes) com TBST. Coloque a membrana de PVDF bloqueada no anticorpo primário e incube a 37 °C durante 1 h.
   14. Retire a membrana de PVDF e lave três vezes com TBST por 10 min cada.
   15. Incubar com o anticorpo secundário (ver Tabela de Materiais). Anticorpo secundário diluído de fosfatase alcalina (AP) de cabra anti-camundongo 5.000 vezes com TBST. Colocar a membrana de PVDF no anticorpo secundário e incubar a 37 °C durante 40 minutos.
   16. Retire a membrana de PVDF e lave quatro vezes com TBST por 10 min cada.
   17. Submergir as membranas de PVDF em uma mistura (apenas o suficiente para embeber a membrana) do substrato AP nitro azul tetrazólio (NBT) e BCIP (5-bromo-4-cloro-3'-indolifosfato sal de p-toluidina) (ver Tabela de Materiais) para coloração. O resultado positivo é roxo.
       NOTA: Os resultados devem ser uma faixa roxa clara e a tira de amostra e o peso molecular do antigénio devem estar na mesma posição rotulada.

4. Avaliação da resposta imune de anticorpos a essa vacina após administração intramuscular

NOTA: Os camundongos foram imunizados por injeção intramuscular da vacina de nanoemulsão após um relatório publicado¹¹. Os camundongos receberam PBS como controle negativo. Após 1 semana de término de três imunizações, o soro foi coletado dos camundongos¹¹. Os níveis séricos de IgG e as subclasses de IgG1, IgG2a e IgG2b foram determinados quantitativamente por ensaio imunoenzimático (ELISA).

1. Revestimento antigénico: Diluir o antigénio da proteína HI a 10 μg/ml com solução de revestimento e adicionar à placa de ELISA a 100 μL/poço. Incubar a 4 °C durante a noite.
   NOTA: A solução de revestimento é preparada dissolvendo 1,6 g de carbonato de sódio anidro e 2,9 g de bicarbonato de sódio em 1 L de água deionizada.
2. Vedação: Lave a placa (três ciclos, cada ciclo 300 μL). Adicionar 300 μL da solução de vedação a cada poço e selar os poços durante 2 h a 37 °C.
   NOTA: A solução de selagem é preparada pela adição de Tween-20 e albumina de soro bovino (BSA) ao PBS. O teor de BSA na solução PBST é de 1%.
3. Diluição do soro: Diluir a amostra de soro de camundongos 100 vezes com PBST (tomar 3 μL de soro e adicioná-lo a 297 μL de PBST e vórtice) e usar 100 μL para cada amostra de soro. Diluir o soro positivo e o soro de controle negativo 100 vezes com PBST adicionando 4 μL a 396 μL de PBST, misturando em seguida por vórtice.
4. Diluição de dupla proporção: Adicionar 200 μL do soro experimental diluído acima à primeira fileira da placa ELISA revestida e adicionar 100 μL de PBST a todos os poços, exceto à primeira e à^12ª linhas. Efectuar uma diluição 1:2 sucessivamente a partir da primeira fileira: ajustar a pipeta para 100 μL, transferir 100 μL da primeira fileira para a segunda fileira e misturar com a pipeta 10 vezes.
5. Diluir o soro para a linha 11 em proporções múltiplas e descartar 100 μL de líquido.
6. Adicionar soro negativo e positivo diluído aos poços correspondentes na linha 12 de acordo com o modelo de amostra (ver Tabela 1)-100 μL/poço.
7. Selar as placas de ELISA com filme plástico e incubar a 37 °C por 1 h.
8. Diluir o anticorpo secundário anti-IgG-HRP de rato (ver Tabela de Materiais) com PBST a 1:10.000.
9. Lave a placa (três ciclos, cada ciclo 300 μL). Em seguida, adicionar 100 μL do anticorpo secundário diluído a cada poço e incubar a placa a 37 °C por 40 min.
10. Coloração e terminação: Lave a placa (cinco ciclos, cada ciclo 300 μL). Adicionar solução corante de 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) (100 μL; ver Tabela de Materiais) a cada poço. Colocar as placas a 37 °C durante 10 minutos longe da luz e, em seguida, terminar imediatamente a reacção com 50 μL de 2 M H₂SO₄.
11. Detectar o valor da densidade óptica (OD 450) por um marcador enzimático (leia o valor OD₄₅₀ dentro de 15 minutos após o término).

5. Avaliação dos efeitos in vivo das novas vacinas adjuvantes

NOTA: O efeito protetor desta vacina de nanoemulsão foi avaliado em um modelo de camundongo letal MRSA252 obtido comercialmente (ver Tabela de Materiais). De acordo com os resultados anteriores do nosso grupo de pesquisa¹⁴, 1 x^{10 8} unidades formadoras de colônias (UFC)/camundongo é a melhor dose para avaliar o efeito protetor do modelo letal de infecção bacteriana MRSA252.

1. Recuperação de deformação: Obter um tubo de MRSA252 congelado, inocular as bactérias em placas Mueller Hinton (MH) (A) (ver Tabela de Materiais) pelo "método de três linhas" e cultivar durante a noite a 37 °C. Execute as etapas do "método de três linhas" conforme mencionado abaixo:
   1. Segurando o anel de inoculação na mão direita, cauterize-o e resfrie-o para obter um anel de líquido bacteriano.
   2. Segure a placa de ágar na mão esquerda (mantendo a tampa sobre a mesa) acima da área frontal esquerda da chama da lâmpada de álcool para que a placa fique voltada para a chama, impedindo que as bactérias entrem no ar. Com a mão direita, mova o anel de inoculação de bactérias infectadas para frente e para trás na superfície do ágar de forma densa, mas não sobreposta, cobrindo uma área de aproximadamente 1/5-1/6 de toda a placa, que é a primeira zona.
      NOTA: O anel de inoculação e o ágar devem estar em contato suave em um ângulo de 30°-40°; Danificar o ágar pode ser evitado deslizando com a força do pulso.
   3. Cauterizar o excesso de bactérias no anel de inoculação (se deve cauterizar ou esterilizar cada área depende da quantidade de bactérias no espécime). Após esfriar, repita a penúltima linha 2-3 no final e desenhe uma segunda área (cerca de 1/4 da área da placa).
   4. Depois que a segunda zona terminar, cauterize o anel e desenhe a terceira zona da mesma forma para preencher toda a placa.
   5. Depois que as linhas forem traçadas, coloque a placa na tampa da placa, marque a placa e incube em uma incubadora a 37 °C por 18-24 h para observar a distribuição das colônias na superfície do ágar. Concentre a atenção se uma única colônia está isolada e observe as características da colônia (como tamanho, forma, transparência e pigmentação).
2. Ativação bacteriana: No dia seguinte, tomar dois frascos agitadores de 50 mL e adicionar 20 mL de meio MH (B) (ver Tabela de Materiais) a cada um. Escolha duas colônias simples com uma ponta de pipeta de 10 μL e adicione-as aos agitadores. Incubar as colónias durante a noite a 220 rpm a 37 °C.
3. Ativação secundária: No dia seguinte, tomar dois frascos agitadores de 50 mL, cada um contendo 20 mL de meio MH (B). Retirar 200 μL de solução bacteriana do agitador contendo as primeiras bactérias ativadas, adicionar aos dois novos frascos contendo 20 mL de meio MH (B) e incubar a 37 °C e 220 rpm por 5 h.
4. Recolher a segunda solução bacteriana activada num tubo de centrifugação de 50 ml, separar a 3.000 x g durante 20 minutos e eliminar o sobrenadante.
5. Ressuspender as bactérias precipitadas em 40 mL de solução salina.
6. Medir o valor OD₆₀₀ da solução bacteriana e ajustar para 1 com soro fisiológico. Neste momento, a quantidade bacteriana de MRSA252 em nosso experimento foi de 2 x 10⁹ UFC/mL.
7. Diluir a solução bacteriana com um OD₆₀₀ de 1 para uma concentração de 1 x 10⁹ UFC/ml.
8. Divida aleatoriamente 48 camundongos Balb/c em quatro grupos (n=12).
   LEGENDA: Grupo I: grupo PBS; Grupo II: grupo controle do NEC; Grupo III: grupo antígeno [proteína] virgen; Grupo IV: grupo vacinal adjuvante em nanoemulsão.
9. Anestesiar os camundongos por injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico a 1%.
10. Irradiar os ratos com uma lâmpada de fisioterapia infravermelha (ver Tabela de Materiais) durante aproximadamente 1 minuto para causar vasodilatação da veia caudal.
11. Desafiar os ratinhos com a injeção da solução bacteriana diluída (passo 5.7) na veia da cauda, 100 μL por rato.
12. Coloque os ratos sob a lâmpada de fisioterapia infravermelha até que eles possam retornar à atividade normal.
13. Observar e registrar a sobrevivência de camundongos a cada 12 h por 10 dias.
14. Eutanasiar os camundongos que sobreviveram ao ataque por injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico a 1%.

Resultados

Avaliou-se o protocolo de preparação da vacina adjuvante em nanoemulsão e os testes in vitro e in vivo desta vacina. MET, AFM e DLS foram usados para determinar as características importantes do potencial zeta e do tamanho de partícula na superfície desta amostra (Figura 1). SDS-PAGE e western blotting mostraram que a quantidade de antígeno no precipitado e sobrenadante não se degradou significativamente após a centrifugação, o que indicou que a vacina estava est...

Discussão

A IsdB, uma proteína de superfície bacteriana ancorada na parede celular e regulada pelo ferro, desempenha um papel importante no processo de obtenção do ferro heme¹⁵. A Hla, toxina alfa, está entre as toxinas bacterianas mais eficazes conhecidas em MRSA, podendo formar poros em células eucarióticas e interferir na adesão e nas células epiteliais¹⁶. Em nosso estudo, uma nova proteína antigênica (HI) de MRSA de recombinação foi construída e ex...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11	Eppendorf, Germany	5424000495
96-well plates	Corning Incorporated, USA	CLS3922
AFM Dimension FastScan	BRUKER, Germany	null
Alcohol lamp	Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China	YBS-AA-11408
Balb/c mice	Beijing HFK Bioscience Co. Ltd.
BCIP/NBT	Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China	BCIP/NBT
Bio-Rad 6.0 microplate reader	Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA	null
BL21 Competent Cell	Merck millipore,Germany	70232-3CN
BSA-100G	Sigma-Aldrich, USA	B2064-100G
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
Coomassie bright blue G-250 staining solution	MIKX,China	DB236
Decolorization solution	BOSTER,China	AR0163-2
Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420	Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China	null
Electrophoresis apparatus	Beijing Liuyi Instrument Factory, China	DYCZ-25D
Gel image	Tanon, USA	null
Glutathione-Sepharose Resin GST	Mei5bio,China	affinity chromatography resin
H2SO4	Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China	7664-93-9
HI recombinant protein	Third Military Medical University,China	110-27-0
HRP -Goat Anti-Mouse IgG	Biodragon, China	BF03001
HRP- Goat anti-mouse IgG1	Biodragon, China	BF03002R
HRP- Goat anti-mouse IgG2a	Biodragon, China	BF03003R
HRP- Goat anti-mouse IgG2b	Biodragon, China	BF03004R
Inoculation loop	Haimen Feiyue Co.,LTD,China	YR-JZH-1UL
IsdB and Hla clones	Shanghai Jereh Biotechnology Co,China	null
Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant)	SEPPIC, France	null
isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside	fdbio,China	FD3278-1
LB bouillon culture-medium	Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China	02-136
Lnfrared physiotherapy lamp	Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China	7600
Low temperature refrigerated centrifuge	Eppendorf, Germany	null
Malvern NANO ZS	Malvern Instruments Ltd., UK	null
MH(A) medium	Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China	02-051
MH(B) medium	Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China	02-052
Micro plate washing machine 405 LSRS	Bio Tek Instruments,Inc Highland  Park,USA	null
Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument	BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China	1658030
MMC packing	TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD	0022818
MRSA252	USA, ATCC	null
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer	Thermo Scientific, USA	null
New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit	DAKEWE, China	8012011
PBS	biosharp, China	null
PCR, Amplifier	Thermal Cycler, USA	null
pGEX-target gene recombinant plasmid	Shanghai Jereh Biotechnology Co,China	B3528G
Phosphotungstic acid	G-CLONE, China	CS1231-25g
pipette	Eppendorf, Germany	3120000844
polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant)	Aladdin, China	K400327-1kg
Primary antibody	Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera	null	See Reference 11 for details
propylene glycol (pharmaceutic adjuvant)	Sigma-Aldrich, USA	P4347-500ML
Protein Marker	Thermo Scientufuc, USA	26616
PVDF TRANSFER MEMBRANE	Invitrogen,USA	88518
Scanning Electron Microscope	JEOL,Japan	JSM-IT800
Sodium pentobarbital	Merck,Germany	Tc-P8411
Talos L120C TEM	Thermo Fisher, USA	null
TMB color solution	TIAN GEN, China	PA107-01
Turtle kits	Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD	ES80545
Tween-20	Macklin, China	9005-64-5