评估纳米乳剂佐剂疫苗对耐甲氧西林 金黄色葡萄球菌 （MRSA）感染的免疫反应

摘要

本协议制备和评估新型纳米乳剂佐剂疫苗的物理特性、免疫应答和 体内 保护作用。

摘要

纳米乳佐剂疫苗因其粒径小、热稳定性高、有效诱导免疫应答的能力等特点而受到广泛关注。然而，建立一系列全面的方案来评估新型纳米乳剂佐剂疫苗的免疫反应至关重要。因此，本文采用严格的程序来确定疫苗的理化特性（通过透射电子显微镜 [TEM]、原子力显微镜 [AFM] 和动态光散射 [DLS]）、疫苗抗原和系统的稳定性（通过高速离心机测试、热力学稳定性测试、SDS-PAGE 和蛋白质印迹）和特异性免疫应答（IgG1， IgG2a 和 IgG2b）。使用这种方法，研究人员可以 准确评估新型纳米乳剂佐剂疫苗在致死MRSA252小鼠模型中的保护作用。通过这些方案，可以确定在有效佐剂潜力方面最有希望的纳米乳疫苗佐剂。此外，这些方法可以帮助优化新型疫苗的未来开发。

引言

耐甲氧西林 金黄色葡萄球菌 （MRSA） 是一种机会性病原体，是全球重症监护病房 （ICU）¹ 病房、心脏病科和烧伤科感染率最高的病原体之一。MRSA表现出较高的感染率，死亡率和广泛的耐药性，在临床治疗中存在很大的困难²。在世界卫生组织（WHO）于2017年发布的抗生素耐药细菌全球优先清单中，MRSA被列为最关键的^第3类。因此，迫切需要针对MRSA感染的疫苗。

铝助剂使用时间较长，佐剂辅助机理比较明确，安全有效，耐受性好⁴.铝助剂是目前广泛使用的佐剂类型。一般认为吸附在铝盐颗粒上的抗原可以提高注射部位的稳定性，增强吸收抗原的能力，提供良好的吸收和^缓释5。目前，铝佐剂的主要缺点是它们缺乏佐剂作用或仅对某些候选疫苗抗原表现出弱佐剂^作用6。此外，铝佐剂诱导IgE介导的超敏反应⁵。因此，有必要开发新型佐剂来刺激更强的免疫反应。

纳米乳液助剂是由油、水、表面活性剂和助表面^活性剂7组成的胶体分散体系。此外，佐剂具有热力学稳定性和各向同性，可通过高速离心高压灭菌或稳定，并且可以在温和的制备条件下自发形成。目前市场上有几种乳液助剂（如MF59、NB001-002系列、AS01-04系列等），但其粒径大于160nm8。因此，纳米级（1-100 nm）药物制剂的优势（即大比表面积、小粒径、表面效应、高表面能、小尺寸效应和宏观量子隧穿效应）无法得到充分利用。在本协议中，据报道，一种基于纳米乳液技术的新型佐剂具有直径尺寸为1-100nm的佐剂，其具有良好的佐剂活性⁹。我们测试了重组亚基疫苗抗原蛋白HI（α-溶血素突变体[Hla]和Fe离子表面决定因子B[IsdB]亚基N2活性片段融合蛋白）;建立了一系列程序来检查疫苗的物理性质和稳定性，评估其肌内给药后的特异性抗体反应，并使用小鼠全身感染模型测试疫苗的保护作用。

研究方案

动物实验根据实验动物使用和护理手册进行，并得到第三军医大学实验动物福利与伦理委员会的批准。6-8周龄的雌性Balb / c小鼠用于本研究。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。

1. MRSA HI抗原蛋白的制备

1. 从商业来源获得IsdB和Hla克隆（见材料表），进行聚合酶链反应（PCR）扩增以扩增IsdB和Hla基因，并将其产物连接到PGEX-6P-2质粒（商业上获得;见材料表）。用大肠杆菌¹⁰ 的矢量 Xl/蓝色菌株进行筛选。
2. 将阳性克隆转化为 大肠杆菌 BL21感受态细胞（参见 材料表）并用鲨鱼培养物扩增¹⁰。
3. 用异丙基-β-D-1-巯基吡喃半乳糖苷和多模态色谱（MMC）分离试剂盒¹¹诱导后表达抗原并分离。
4. 表征抗原蛋白并使用全自动净化器纯化¹¹.
   1. 使用市售亲和色谱树脂从清除的裂解物中亲和纯化古他硫酮S-转移酶（GST）标记的蛋白质（参见 材料表）。
   2. 通过MMC¹¹纯化重组蛋白。
   3. 通过Triton X-114相分离方法¹¹去除内毒素。简而言之，将1%Triton X-114与重组蛋白洗脱液在0°C下混合5分钟以确保溶液均匀，并在37°C下孵育5分钟以形成两相。
5. 使用细菌内毒素测试方法¹¹ 和海龟试剂盒（见 材料表）检测内毒素浓度。蛋白质抗原的内毒素为0.06 EU/μg，低于国际标准（1.5 EU/μg）¹⁰。
   1. 进行干涉测试，以消除测试产品对内毒素检测的可能影响¹¹.
      注:根据中国药典¹²附录2020，内毒素含量应小于5EU/剂。基于MVD = cL/λ计算了鲎裂解物的灵敏度（λ0.25 EU/mL）和最大有效稀释比33.3¹² ，其中L为供试品细菌内毒素限值，c为供试品溶液浓度，L以EU/m表示时，c等于1.0 mg/mL。λ是凝胶法中鲎试剂的标记灵敏度（EU/mL）。
6. 在没有内毒素或磷酸盐缓冲盐水（PBS）（二氯酸钠法）的无菌水中以 1.5 mg/mL 重组合抗原（48 kDa，通过 12% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 [SDS-PAGE]） 测定¹¹。
   注意:蛋白质峰时间为13.843分钟，纯度为99.4%（高效液相色谱法），蛋白质在-70°C保存¹⁰。使用从 金黄色葡萄球菌 菌株MRSA252中提取的基因组DNA（见 材料表）作为PCR模板。 IsdB 基因使用正向引物59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
   C-39和反向引物59-TTTTCCTTTTGCGG
   CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC-39. Hla 基因使用正向引物PHLAF（GCGGATCCGATTGATATTAATATTAAAACC）和反向引物PHLAR（TAAGCGGCCGCTTAT
   CAATTTGTCATTTCTTC）。

2. 纳米乳疫苗的制备

1. 按1:6:3（w/w）的质量比，依次向HI抗原蛋白溶液（10mg/mL）中加入3种赋形剂（肉豆蔻酸异丙酯、聚氧乙烯蓖麻油和丙二醇;见 材料表）搅拌均匀。然后，加入逐渐灭菌的纯水以达到10mL的最终体积，并在500rpm和25°C下搅拌约20分钟。
   注意:本协议中制备的纳米乳液的体积为10mL，三种赋形剂的质量分别为0.34g，2g和1g。这里的蛋白质溶液是工作溶液，是最终溶液浓度的10倍。
2. 通过低能量乳化方法13制备纳米乳剂佐剂疫苗（^1mg / mL蛋白），以获得澄清透明的液体溶液。
   注意:空白纳米乳液（BNE）通过类似的方法制备，只是用HI代替水。通常的乳化方法是将外相和内相加热到约80°C进行乳化，然后逐渐搅拌和冷却。在这个过程中，消耗了大量的能量，最后得到了乳液。

3. 纳米乳佐剂疫苗的物理特性和稳定性

1. 粒径、zeta 电位和聚合物分散指数表征 （PDI）。
   1. 准备100μL纳米乳液佐剂疫苗，用水稀释50倍注射。加入 2 mL 样品进行检测。
   2. 使用纳米Zetasizer（ZS;见 材料表）在25°C下观察粒径，zeta电位和PDI。
2. 透射电子显微镜
   1. 用水稀释 10 μL 纳米乳剂疫苗 50 倍，置于碳涂层 100 目铜网格上，并在室温下用 1% 磷钨酸染色（参见 材料表）5 分钟。
   2. 用滤纸去除多余的磷钨酸溶液。
   3. 在透射电子显微镜下观察形态（见 材料表）。检查成品在电子显微镜视场内是否近乎稳定和圆形，是否表现出良好的色散。
3. 扫描电子显微镜
   1. 用水稀释10μL纳米乳液佐剂疫苗50倍，将10μL预稀释样品滴在硅晶片上，并置于37°C恒温器控制的培养箱中24小时。
   2. 将准备好的铂喷在硅上40秒，然后冷却至室温。
   3. 在高分辨率扫描电子显微镜下观察制备样品的形态特性（见 材料表）。在电子显微镜下确定样品是否近乎稳定、球形且分散在视场内。
4. 形态稳定性
   1. 将1mL纳米乳疫苗样品置于微量离心管中，并通过在室温（25°）下以13，000× g 离心30分钟来评估新鲜样品的稳定性。
   2. 观察这些新鲜样品的外观，然后进行六个温度循环的热力学稳定性测试（一个循环:在4°C下储存48小时，在25°C下储存48小时，在37°C下储存48小时）。
   3. 离心后，让样品静置15分钟，以确定是否存在廷德尔效应（样品在光照下是否清晰透明）以及是否发生了破乳（破乳后通过明确分层显示）。
5. SDS-PAGE 和蛋白质印迹
   1. 摇动样品，混合0.6mL无水乙醇和0.3mL疫苗的溶液，并离心（13，000× g，室温下30分钟，25°C）。
   2. 将溶液的上清液转移到干净的管中，并用0.3mL水溶解沉淀物。用无水乙醇和蒸馏水溶液处理后，获得上清液和沉淀溶液（空白纳米乳液和疫苗），并进行相同的50倍稀释。
   3. 混合 2.5 mL 分离凝胶 A 和 2.5 mL 分离凝胶 B（参见 材料表），加入 50 μL 10% 过硫酸铵，并用移液管快速将溶液放入玻璃板中。混合 1 mL 浓凝胶 A 和 1 mL 浓凝胶 B，将 20 μL 10% 过硫酸铵加入玻璃板中，插入适当大小的梳子，等待凝固。
   4. 向步骤3.5.2中获得的稀释样品中加入总共5μL 5x蛋白质上样缓冲液，并将样品煮沸5分钟。
   5. 向相应的孔中加入 10 μL 加热的蛋白质，并向标记孔中加入 5 μL 蛋白质标记物。
   6. 连接电极，打开电泳仪（见 材料表），并将电压调节至300 V.当电泳到达距离PAGE橡胶底部1厘米时关闭电源。
   7. 取出凝胶并用ddH₂O冲洗，加入考马斯亮蓝色G-250染色溶液（参见 材料表）10分钟。倒出染色溶液，并用ddH₂O冲洗凝胶两次。
   8. 加入市售脱色溶液，将凝胶微波1分钟。摇动凝胶10分钟，反复更换脱色溶液，直到凝胶背景澄清。然后，进行凝胶成像（见 材料表）。
      注意:蛋白质印迹经过预处理，如步骤3.5.1-3.5.6中所述。
   9. 用电泳转印缓冲液浸泡三个滤纸块。将聚偏氟乙烯（PVDF）膜在甲醇中浸泡30秒，并用半干凝胶转移仪（两层滤纸，PVDF膜，电泳凝胶和一层滤纸）转移。使用23V的电压转移膜23分钟。
   10. 取出 PVDF 膜，转移后用三缓冲盐水吐温 20 （TBST） 洗涤一次。
   11. 将PVDF膜置于密封溶液（5%脱脂奶粉溶液）中，并在4°C下密封过夜。
   12. 取下PVDF膜，用TBST洗涤3次或每次10分钟。
   13. 与一抗（来自血清阳性的免疫小鼠）一起孵育。用TBST稀释要测试500倍（100倍）的一抗¹¹ （见 材料表）。将封闭的PVDF膜置于一抗中，并在37°C下孵育1小时。
   14. 去除PVDF膜，用TBST洗涤三次，每次10分钟。
   15. 与二抗孵育（见 材料表）。用TBST稀释碱性磷酸酶（AP）标记的山羊抗小鼠二抗5，000倍。将PVDF膜置于二抗中，并在37°C孵育40分钟。
   16. 去除PVDF膜，用TBST洗涤四次，每次10分钟。
   17. 将PVDF膜浸没在AP底物硝基蓝四唑（NBT）和BCIP（5-溴-4-氯-3'-吲哚磷酸对甲苯胺盐）（见 材料表）的混合物中（刚好足以浸泡膜）进行染色。阳性结果是紫色。
       注意:结果必须是透明的紫色条带，并且样品条和抗原的分子量应处于相同的标记位置。

4.肌内给药后对该疫苗的抗体免疫应答评估

注意:在发表的报告¹¹之后，通过肌肉注射纳米乳剂疫苗对小鼠进行免疫。给予小鼠PBS作为阴性对照。在完成三次免疫后1周，从小鼠¹¹收集血清。通过酶联免疫吸附法（ELISA）定量测定血清IgG水平以及IgG1、IgG2a和IgG2b亚类。

1. 抗原包被:用包被溶液将HI蛋白抗原稀释至10μg/mL，并以100μL/孔的速度加入ELISA板中。在4°C孵育过夜。
   注意:通过将1.6g无水碳酸钠和2.9g碳酸氢钠溶解在1L去离子水中制备涂层溶液。
2. 密封:清洗板（三个周期，每个周期300μL）。向每个孔中加入300μL密封溶液，并在37°C下密封孔2小时。
   注意:密封溶液是通过向PBS中加入吐温-20和牛血清白蛋白（BSA）来制备的。PBST溶液中BSA的含量为1%。
3. 血清稀释:用PBST稀释小鼠样品血清100倍（取3μL血清并将其加入297μLPBST中并涡旋），每个血清样品使用100μL。将阳性血清和阴性对照血清稀释 100 倍，方法是将 4 μL 加入 396 μL PBST 中，然后涡旋混合。
4. 双倍比例稀释:将 200 μL 上述稀释的实验血清加入包被的 ELISA 板的第一行，并向除第一行和第 12^行以外的 所有孔中加入 100 μL PBST。从第一行依次进行 1:2 稀释:将移液器调整至 100 μL，将 100 μL 从第一行转移到第二行，并与移液器混合 10 次。
5. 以多种比例将血清稀释至第 11 行，并弃去 100 μL 液体。
6. 根据样品模板将稀释的阴性和阳性血清添加到第 12 行的相应孔中（参见 表 1）-100 μL/孔。
7. 用保鲜膜密封ELISA板，并在37°C孵育1小时。
8. 用PBST以1:10，000稀释二抗抗小鼠IgG-HRP（参见 材料表）。
9. 清洗板（三个循环，每个循环300μL）。然后，向每个孔中加入100μL稀释的二抗，并将板在37°C孵育40分钟。
10. 染色和终止:清洗板（五个周期，每个周期300μL）。向每个孔中加入3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）染色溶液（100μL;参见 材料表）。将板置于37°C避光10分钟，然后立即用50μL的2M H₂SO₄终止反应。
11. 通过酶标记物检测光密度（OD 450）值（终止后15分钟内读取OD₄₅₀值）。

5. 新型佐剂疫苗体内效果评价

注意:在商业获得的致死MRSA252小鼠模型中评估了这种纳米乳剂疫苗的保护作用（见 材料表）。根据我们研究小组¹⁴的先前结果，1 x 10⁸ 菌落形成单位（CFU）/小鼠是评估MRSA252细菌感染致死模型保护效果的最佳剂量。

1. 菌株回收:获得一管冷冻MRSA252，通过"三线法"将细菌接种在Mueller Hinton（MH）（A）板上（见 材料表），并在37°C下培养过夜。 执行"三行法"的步骤，如下所述:
   1. 右手握住接种环，烧灼冷却，得到一圈细菌液体。
   2. 左手握住琼脂平板（将盖子放在桌子上）放在酒精灯火焰左前方区域上方，使平板面向火焰，防止细菌进入空气。用右手，以致密但不重叠的方式在琼脂表面上来回移动感染细菌的接种环，覆盖整个平板的约1/5-1 / 6区域，这是第一个区域。
      注意:接种环和琼脂应以30°-40°角轻轻接触;通过用手腕用力滑动可以避免损坏琼脂。
   3. 烧灼接种环上多余的细菌（是否烧灼或灭菌每个区域取决于标本中的细菌数量）。冷却后，在最后重复倒数第二行 2-3 并绘制第二个区域（大约是板面积的 1/4）。
   4. 第二个区域完成后，烧灼环，并以相同的方式绘制第三个区域以填充整个板。
   5. 画线后，将板放在培养皿的盖子上，标记板，并在37°C培养箱中孵育18-24小时，以观察琼脂表面上菌落的分布。将注意力集中在是否分离出单个菌落，并观察菌落特征（如大小、形状、透明度和色素沉着）。
2. 细菌活化:第二天，取两个50 mL摇瓶，并向每个培养瓶中加入20 mL MH（B）培养基（参见 材料表）。用 10 μL 移液器吸头挑选两个单菌落，并将它们添加到摇床中。将菌落在37°C下以220rpm孵育过夜。
3. 二次激活:第二天，取两个50 mL摇瓶，每个瓶含有20 mL MH（B）培养基。从含有第一个活化细菌的摇床中取出 200 μL 细菌溶液，加入到含有 20 mL MH （B） 培养基的两个新烧瓶中，并在 37 °C 和 220 rpm 下孵育 5 小时。
4. 将第二种活化的细菌溶液收集在50mL离心管中，以3，000× g 分离20分钟，并弃去上清液。
5. 将沉淀的细菌重悬于40 mL盐水中。
6. 测量细菌溶液的OD₆₀₀ 值，并用生理盐水调节至1。此时，我们实验中MRSA252的细菌量为2 x 10⁹ CFU/mL。
7. 用OD₆₀₀ 的1稀释细菌溶液至1 x 10⁹ CFU/mL的浓度。
8. 将48只Balb / c小鼠随机分为四组（n = 12）。
   注:第一组:PBS组;第二组:BNE对照组;III组:幼稚抗原[蛋白质]组;第四组:纳米乳液佐剂疫苗组。
9. 通过腹膜内注射100mg / kg的1%戊巴比妥钠麻醉小鼠。
10. 用红外理疗灯（见 材料表）照射小鼠约1分钟，以引起尾静脉血管舒张。
11. 将稀释的细菌溶液（步骤5.7）注射到尾静脉中，每只小鼠100μL，挑战小鼠。
12. 将小鼠置于红外理疗灯下，直到它们可以恢复正常活动。
13. 每12小时观察并记录小鼠的存活率，持续10天。
14. 通过腹膜内注射100mg / kg的1%戊巴比妥钠对在攻击中幸存下来的小鼠实施安乐死。

结果

评估了制备纳米乳液佐剂疫苗的方案以及该疫苗的体外和体内测试。TEM、AFM 和 DLS 用于确定该样品表面 zeta 电位和粒径的重要特征（图 1）。SDS-PAGE和蛋白质印迹显示，离心后沉淀物和上清液中的抗原量未显著降解，表明疫苗结构完整、特异性和免疫原性（图2）。纳米乳佐剂疫苗显著提高了总IgG、IgG1和IgG 2a抗体滴度。疫苗的免疫原性显着?...

讨论

IsdB是一种细菌细胞壁锚定和铁调节的表面蛋白，在获得血红素铁的过程中起重要作用¹⁵。 Hla，α毒素，是MRSA中已知的最有效的细菌毒素之一，可以在真核细胞中形成孔隙并干扰粘附和上皮细胞¹⁶。本研究基于 IsdB 和 Hla抗原基因，利用基因工程技术构建并表达新型重组MRSA抗原蛋白（HI）。然后，采用低能量乳化法研制出纳米乳化疫苗，...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11	Eppendorf, Germany	5424000495
96-well plates	Corning Incorporated, USA	CLS3922
AFM Dimension FastScan	BRUKER, Germany	null
Alcohol lamp	Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China	YBS-AA-11408
Balb/c mice	Beijing HFK Bioscience Co. Ltd.
BCIP/NBT	Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China	BCIP/NBT
Bio-Rad 6.0 microplate reader	Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA	null
BL21 Competent Cell	Merck millipore,Germany	70232-3CN
BSA-100G	Sigma-Aldrich, USA	B2064-100G
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
Coomassie bright blue G-250 staining solution	MIKX,China	DB236
Decolorization solution	BOSTER,China	AR0163-2
Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420	Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China	null
Electrophoresis apparatus	Beijing Liuyi Instrument Factory, China	DYCZ-25D
Gel image	Tanon, USA	null
Glutathione-Sepharose Resin GST	Mei5bio,China	affinity chromatography resin
H2SO4	Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China	7664-93-9
HI recombinant protein	Third Military Medical University,China	110-27-0
HRP -Goat Anti-Mouse IgG	Biodragon, China	BF03001
HRP- Goat anti-mouse IgG1	Biodragon, China	BF03002R
HRP- Goat anti-mouse IgG2a	Biodragon, China	BF03003R
HRP- Goat anti-mouse IgG2b	Biodragon, China	BF03004R
Inoculation loop	Haimen Feiyue Co.,LTD,China	YR-JZH-1UL
IsdB and Hla clones	Shanghai Jereh Biotechnology Co,China	null
Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant)	SEPPIC, France	null
isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside	fdbio,China	FD3278-1
LB bouillon culture-medium	Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China	02-136
Lnfrared physiotherapy lamp	Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China	7600
Low temperature refrigerated centrifuge	Eppendorf, Germany	null
Malvern NANO ZS	Malvern Instruments Ltd., UK	null
MH(A) medium	Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China	02-051
MH(B) medium	Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China	02-052
Micro plate washing machine 405 LSRS	Bio Tek Instruments,Inc Highland  Park,USA	null
Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument	BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China	1658030
MMC packing	TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD	0022818
MRSA252	USA, ATCC	null
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer	Thermo Scientific, USA	null
New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit	DAKEWE, China	8012011
PBS	biosharp, China	null
PCR, Amplifier	Thermal Cycler, USA	null
pGEX-target gene recombinant plasmid	Shanghai Jereh Biotechnology Co,China	B3528G
Phosphotungstic acid	G-CLONE, China	CS1231-25g
pipette	Eppendorf, Germany	3120000844
polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant)	Aladdin, China	K400327-1kg
Primary antibody	Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera	null	See Reference 11 for details
propylene glycol (pharmaceutic adjuvant)	Sigma-Aldrich, USA	P4347-500ML
Protein Marker	Thermo Scientufuc, USA	26616
PVDF TRANSFER MEMBRANE	Invitrogen,USA	88518
Scanning Electron Microscope	JEOL,Japan	JSM-IT800
Sodium pentobarbital	Merck,Germany	Tc-P8411
Talos L120C TEM	Thermo Fisher, USA	null
TMB color solution	TIAN GEN, China	PA107-01
Turtle kits	Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD	ES80545
Tween-20	Macklin, China	9005-64-5