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要約

本プロトコルは、新規ナノエマルジョンアジュバントワクチンの物理的特性、免疫応答、および インビボ 防御効果を調製および評価する。

要約

ナノエマルジョンアジュバントワクチンは、その小さな粒子サイズ、高い熱安定性、および有効な免疫応答を誘導する能力のために広く注目を集めている。しかし、新しいナノエマルジョンアジュバントワクチンの免疫応答を評価するための一連の包括的なプロトコルを確立することが不可欠です。したがって、この記事では、ワクチンの物理化学的特性(透過型電子顕微鏡[TEM]、原子間力顕微鏡[AFM]、および動的光散乱[DLS]による)、ワクチン抗原およびシステムの安定性(高速遠心分離試験、熱力学的安定性試験、SDS-PAGE、およびウェスタンブロットによる)、および特異的免疫応答(IgG1、 IgG2a、およびIgG2b)。このアプローチを使用して、研究者は、致死MRSA252マウスモデルにおける新規ナノエマルジョンアジュバントワクチンの保護効果 を正確に評価することができる。これらのプロトコルにより、有効なアジュバントの可能性の観点から最も有望なナノエマルジョンワクチンアジュバントを同定することができる。さらに、この方法は、将来の開発のために新しいワクチンを最適化するのに役立ちます。

概要

メチシリン耐性 黄色ブドウ球菌 (MRSA)は、世界中の集中治療室(ICU)病棟1、心臓病科、および火傷科で最も高い感染率の1つである日和見病原体です。MRSAは感染率、死亡率が高く、薬剤耐性が広く、臨床治療において大きな困難を示しています2。2017年に世界保健機関(WHO)が発表した抗生物質耐性菌のグローバル優先リストでは、MRSAは最も重要なカテゴリー3にリストされました。したがって、MRSA感染に対するワクチンが緊急に必要とされています。

アルミニウムアジュバントは長い間使用されており、アジュバント補助メカニズムは比較的明確で、安全で、効果的で、忍容性が良好です4。アルミニウムアジュバントは、現在広く使用されているタイプのアジュバントである。一般に、アルミニウム塩粒子に吸着された抗原は、安定性を改善し、注射部位が抗原を取り込む能力を高め、良好な吸収と徐放を提供すると考えられています5。現在、アルミニウムアジュバントの主な欠点は、アジュバント効果を欠くか、またはいくつかのワクチン候補抗原に対して弱いアジュバント効果しか示さないことである6。さらに、アルミニウムアジュバントはIgEを介した過敏反応を誘導します5。したがって、より強力な免疫応答を刺激するための新規アジュバントを開発する必要があります。

ナノエマルジョンアジュバントは、油、水、界面活性剤、および共界面活性剤7で構成されるコロイド分散系である。さらに、アジュバントは熱力学的に安定で等方性であり、オートクレーブ処理または高速遠心分離による安定化が可能で、穏やかな調製条件下で自発的に形成することができます。いくつかのエマルジョンアジュバント(MF59、NB001-002シリーズ、AS01-04シリーズなど)が現在市場に出回っているか、臨床研究段階にありますが、それらの粒子サイズは160nmを超えています8。したがって、ナノスケール(1〜100 nm)の医薬品の利点(すなわち、大きな比表面積、小さな粒子サイズ、表面効果、高い表面エネルギー、小さなサイズの効果、およびマクロ量子トンネル効果)を十分に活用することはできません。本プロトコールでは、直径サイズ1〜100nmのナノエマルジョン技術に基づく新規アジュバントが良好なアジュバント活性を示すことが報告されている9。組換えサブユニットワクチン抗原タンパク質HI(α-ヘモリシン変異体[Hla]およびFeイオン表面決定因子B[IsdB]サブユニットN2活性断片融合タンパク質)をテストしました。物性や安定性の検討、筋肉内投与後の特異的抗体応答の評価、マウス全身感染モデルを用いたワクチンの防御効果の試験など、一連の手順を確立した。

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プロトコル

動物実験は、実験動物の使用と管理に関するマニュアルに基づいて行われ、第三軍事医科大学の実験動物福祉倫理委員会によって承認されました。6〜8週齢の雌Balb / cマウスを本研究に使用しました。動物は商業的な情報源から入手した( 材料表を参照)。

1. MRSA HI抗原タンパク質の調製

  1. 市販のソースからIsdBおよびHlaクローンを取得し(材料表を参照)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅を実行してIsdBおよびHla遺伝子を増幅し、それらの産物をPGEX-6P-2プラスミドにライゲーションします(市販、材料表を参照)。大腸菌10のベクターXL /青色株のスクリーン。
  2. 陽性クローンを 大腸菌 BL21コンピテントセル( 材料表参照)に形質転換し、サメ培養10で増幅します。
  3. 抗原を発現し、イソプロピル-β-D-1-メルカプトガラクトピラノシドおよびマルチモーダルクロマトグラフィー(MMC)単離キット11( 材料表を参照)による誘導後に単離する。
  4. 抗原タンパク質の特性評価を行い、全自動精製器で精製します11.
    1. 市販のアフィニティークロマトグラフィー樹脂を使用して、透明化ライセートからグタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)タグ付きタンパク質をアフィニティー精製します( 材料表を参照)。
    2. MMC11により組換えタンパク質を精製する。
    3. Triton X-114相分離法11によりエンドトキシンを除去した。簡単に説明すると、1% Triton X-114を組換えタンパク質溶出液と0°Cで5分間混合して均一な溶液を確保し、37°Cで5分間インキュベートして2相を形成します。
  5. Turtleキット(材料表を参照)で細菌性エンドトキシン試験方法11を使用して、エンドトキシン濃度を検出します。タンパク質抗原のエンドトキシンは0.06 EU/μgで、国際標準(1.5 EU/μg)よりも低くなっています10。
    1. 干渉試験を実施して、エンドトキシン検出11に対する試験生成物の影響の可能性を排除する。
      注:中国薬局方2020の付録12によると、エンドトキシン含有量は5 EU /用量未満である必要があります。.リムルスライセート(λ0.25 EU / mL)の感度と33.3の最大有効希釈比は、MVD = cL / λに基づいて12 と計算されました(Lは試験品の細菌性エンドトキシンの限界値、cは試験品溶液の濃度、LをEU/mで表した場合、cは1.0 mg / mLに相当します。λは、ゲル法におけるカブトガニ試薬の標識感度(EU / mL)です。
  6. 抗原 (48 kDa、12% ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 [SDS-PAGE]) をエンドトキシンまたはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含まない滅菌水中で 1.5 mg/mL で再結合します (二塩素酸ナトリウム法)11。
    注:タンパク質ピーク時間は13.843分、純度は99.4%(高速液体クロマトグラフィー法)であり、タンパク質は-70°Cで保存されました10。 黄色ブドウ球菌 株MRSA252から抽出したゲノムDNA( 材料表参照)をPCRテンプレートとして用いた。 IsdB 遺伝子をフォワードプライマー59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAGCAAGCAGを用いて増幅した
    C-39およびリバースプライマー59-TTTTCCTTTTGCGG
    CCGCCTATGTCATATTTTTATTATTTC-39. Hla 遺伝子は、フォワードプライマーPHLAF(GCGGATCCGATTCTGATATTAAACC)およびリバースプライマーPHLAR(TAAGCGGCCGCTTATTAT)を用いて増幅した
    CAATTTGTCATTTCTTC)。

2.ナノエマルジョンワクチンの調製

  1. 1:6:3(w/w)の質量比で、HI抗原タンパク質溶液(10mg/mL)に3種類の賦形剤(ミリスチン酸イソプロピル、ポリオキシエチレンヒマシ油、プロピレングリコール、 材料表参照)を順次添加し、よく攪拌します。その後、徐々に滅菌した純水を最終容量10mLになるまで加え、500rpm、25°Cで約20分間攪拌します。
    注:このプロトコルで調製されたナノエマルジョンは10mLの容量を有し、3つの賦形剤の質量はそれぞれ0.34g、2g、および1gである。ここでのタンパク質溶液は作業溶液であり、最終溶液の濃度の10倍です。
  2. ナノエマルジョンアジュバントワクチン(1mg / mLタンパク質)を低エネルギー乳化法13 によって調製し、透明で透明な液体溶液を得る。
    注:ブランクナノエマルジョン(BNE)は、水をHIに置き換えたことを除いて、同様の方法で調製した。通常の乳化法は、外相と内相を約80°Cに加熱して乳化した後、徐々に攪拌して冷却します。このプロセスでは、大量のエネルギーが消費され、最終的にエマルジョンが得られる。

3.ナノエマルジョンアジュバントワクチンの物理的特性と安定性

  1. 粒子サイズ、ゼータ電位、およびポリマー分散指数の特性評価(PDI)。
    1. 100μLのナノエマルジョンアジュバントワクチンを調製し、注射用水で50倍に希釈する。検出用に2 mLのサンプルを追加します。
    2. ナノゼータサイザー(ZS; 材料表参照)を使用して、25°Cでの粒子サイズ、ゼータ電位、およびPDIを観察します。
  2. 透過型電子顕微鏡(TEM)
    1. 10μLのナノエマルジョンワクチンを水で50倍に希釈し、カーボンコーティングされた100メッシュの銅グリッド上に置き、室温で5分間1%リンタングステン酸( 材料表を参照)で染色する。
    2. 余分なリンタングステン酸溶液をろ紙で取り除きます。
    3. 透過型電子顕微鏡で形態を観察します( 材料表参照)。完成品が電子顕微鏡の視野内でほぼ安定して円形であるかどうか、およびそれらが良好な分散を示すかどうかを調べます。
  3. 走査型電子顕微鏡(SEM)
    1. 10μLのナノエマルジョンアジュバントワクチンを水で50倍に希釈し、10μLの予備希釈サンプルをシリコンウェーハ上に滴下し、37°Cの恒温槽制御インキュベーターに24時間入れる。
    2. 準備したプラチナをシリコンに40秒間スプレーし、室温まで冷却します。
    3. 調製した試料の形態学的性質を高分解能走査型電子顕微鏡で観察します( 材料表参照)。サンプルがほぼ安定で球状で、電子顕微鏡下の視野内に十分に分散しているかどうかを判断します。
  4. 形態学的安定性
    1. 1mLのナノエマルジョンワクチンサンプルをマイクロ遠心チューブに入れ、室温(25°)で13,000 x g で30分間遠心分離することにより、新鮮なサンプルの安定性を評価します。
    2. これらの新鮮なサンプルの外観を観察してから、6つの温度サイクル(1サイクル:4°Cで48時間、25°Cで48時間、37°Cで48時間保存)の熱力学的安定性試験を実行します。
    3. 遠心分離後、サンプルを15分間放置して、ティンダル効果があるかどうか(サンプルが光の下で透明で透明であるかどうか)、および解乳化が発生したかどうか(解乳化後の明確な層別化によって示される)を判断します。
  5. SDSページおよびウェスタンブロット
    1. サンプルを振とうし、0.6 mLの無水エタノールと0.3 mLのワクチンの溶液を混合し、遠心分離機(13,000 x g、室温、25°Cで30分)します。
    2. 溶液の上清をきれいなチューブに移し、沈殿物を0.3 mLの水で溶解します。無水エタノールと蒸留水溶液で処理した後の上清と沈殿溶液(ブランクナノエマルジョンとワクチンの両方)を得て、同じ50倍希釈を行う。
    3. 2.5 mLの分離ゲルAと2.5 mLの分離ゲルB( 材料表を参照)を混合し、50 μLの10%過硫酸アンモニウムを加え、ピペットでガラス板にすばやく溶液を入れます。濃縮ゲルA1 mLと濃縮ゲルB1 mLを混合し、ガラス板に10%過硫酸アンモニウム20 μLを加え、適当な大きさのコームを挿入して固化を待ちます。
    4. ステップ3.5.2で得られた希釈サンプルに合計5 μLの5xタンパク質ローディングバッファー溶液を加え、サンプルを5分間煮沸します。
    5. 10 μLの加熱タンパク質を対応するウェルに加え、5 μLのタンパク質マーカーをマーカーウェルに加えます。
    6. 電極を接続し、電気泳動計( 材料表を参照)をオンにして、電圧を300 Vに調整します。 電気泳動がPAGEゴムの底から1cm離れたら電源を切ります。
    7. ゲルを取り除き、ddH2Oですすいで、クーマシーブライトブルーG-250染色溶液( 材料表を参照)を10分間加えます。染色液を注ぎ出し、ゲルをddH 2 Oで2回すすぎます。
    8. 市販の脱色液を加え、ゲルを電子レンジで1分間加熱します。ゲルを10分間振とうし、ゲルの背景が透明になるまで脱色溶液の交換を繰り返します。次に、ゲルイメージングを実行します( 材料表を参照)。
      注:ウェスタンブロットは、ステップ3.5.1-3.5.6で説明されているように前処理されました。
    9. 3つのろ紙ブロックを電気泳動転写バッファーに浸します。ポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンをメタノールに30秒間浸し、セミドライゲル転写装置(2層の濾紙、PVDF膜、電気泳動ゲル、および1層の濾紙)で転写します。23 Vの電圧を使用して、メンブレンを23分間転送します。
    10. PVDFメンブレンを取り外し、転写後にトリス緩衝生理食塩水-Tween 20(TBST)で1回洗浄します。
    11. PVDFメンブレンをシーリング溶液(5%脱脂粉乳溶液)に入れ、4°Cで一晩シールします。
    12. PVDFメンブレンを取り外し、TBSTで3回またはそれぞれ10分間洗浄します。
    13. 一次抗体(血清陽性で免疫したマウスから)でインキュベートします。試験する一次抗体11 ( 材料表参照)をTBSTで500倍(100倍)に希釈する。ブロックしたPVDFメンブレンを一次抗体に入れ、37°Cで1時間インキュベートします。
    14. PVDFメンブレンを取り外し、TBSTでそれぞれ10分間3回洗浄します。
    15. 二次抗体とインキュベートします( 材料表を参照)。アルカリホスファターゼ(AP)標識ヤギ抗マウス二次抗体をTBSTで5,000倍に希釈する。PVDFメンブレンを二次抗体に入れ、37°Cで40分間インキュベートします。
    16. PVDFメンブレンを取り外し、TBSTでそれぞれ10分間4回洗浄します。
    17. 染色のために、PVDFメンブレンをAP基質ニトロブルーテトラゾール(NBT)とBCIP(5-ブロモ-4-クロロ-3'-インドリホスフェートp-トルイジン塩)の混合物(メンブレンを浸すのにちょうど十分)に浸します( 材料の表を参照)。肯定的な結果は紫色です。
      注:結果は明確な紫色のバンドでなければならず、サンプルストリップと抗原の分子量は同じ標識位置にある必要があります。

4.筋肉内投与後のこのワクチンに対する抗体免疫応答の評価

注:マウスは、公表された報告11に続いてナノエマルジョンワクチンの筋肉内注射によって免疫された。マウスには陰性対照としてPBSを投与した。3回の免疫が終了した1週間後に、マウス11から血清を採取した。IgGおよびIgG1、IgG2a、およびIgG2bのサブクラスの血清レベルは、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって定量的に決定されました。

  1. 抗原コーティング:HIタンパク質抗原をコーティング溶液で10 μg/mLに希釈し、ELISAプレートに100 μL/ウェルで添加します。4°Cで一晩インキュベートします。
    注:コーティング溶液は、1.6 gの無水炭酸ナトリウムと2.9 gの重炭酸ナトリウムを1 Lの脱イオン水に溶解することによって調製されます。
  2. シーリング:プレートを洗浄します(3サイクル、各サイクル300μL)。各ウェルに300 μLのシーリング溶液を加え、37°Cで2時間ウェルを密閉します。
    注:シーリング溶液は、Tween-20とウシ血清アルブミン(BSA)をPBSに添加することによって調製されます。PBST溶液中のBSAの含有量は1%である。
  3. 血清希釈:マウスのサンプル血清をPBSTで100倍に希釈し(血清3μLを採取し、PBSTとボルテックス297μLに加える)、各血清サンプルに100μLを使用します。陽性血清と陰性対照血清をPBSTで100倍に希釈し、4 μLを396 μLのPBSTに加え、ボルテックスで混合します。
  4. ダブル比希釈:上記の希釈実験血清200 μLをコーティングされたELISAプレートの最初の列に加え、1列目と12列目 を除くすべてのウェルに100 μLのPBSTを追加します。最初の列から連続して1:2希釈を実行します:ピペットを100 μLに調整し、100 μLを最初の列から2列目に移し、ピペットで10回混合します。
  5. 血清を複数の比率で11列目に希釈し、100 μLの液体を廃棄します。
  6. 希釈した陰性および陽性の血清を、サンプルテンプレートに従って行12の対応するウェルに追加します( 表1を参照)-100 μL/ウェル。
  7. ELISAプレートをラップで密封し、37°Cで1時間インキュベートします。
  8. 二次抗体抗マウスIgG-HRP( 材料表参照)をPBSTで1:10,000で希釈します。
  9. プレートを洗浄します(3サイクル、各サイクル300μL)。次に、希釈した二次抗体100 μLを各ウェルに加え、プレートを37°Cで40分間インキュベートします。
  10. 染色および終了:プレートを洗浄する(5サイクル、各サイクル300μL)。3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン(TMB)染色液(100 μL、 材料表参照)を各ウェルに加えます。プレートを37°Cで光から10分間離して置き、50μLの2M H2SO4で反応を直ちに終了させます。
  11. 酵素マーカーで光学濃度(OD450)値を検出します(終了後15分以内にOD450値を読み取ります)。

5. 新規アジュバントワクチンの 生体内 効果の評価

注:このナノエマルジョンワクチンの保護効果は、商業的に得られた致死MRSA252マウスモデルで評価されました( 材料表を参照)。私たちの研究グループ14の以前の結果によると、1 x 108 コロニー形成単位(CFU)/マウスは、細菌感染の致死モデルの防御効果を評価するのに最適な用量MRSA252。

  1. 菌株回収:凍結MRSA252のチューブを入手し、「スリーライン法」によりミューラーヒントン(MH)(A)プレート( 材料表参照)に菌を接種し、37°Cで一晩培養した。 下記の「3行方式」の手順を実行します。
    1. 接種リングを右手に持ち、焼灼して冷却し、細菌液のリングを得る。
    2. 寒天プレートをアルコールランプの炎の前左領域の上に左手で(テーブルに蓋をしたまま)持ち、プレートが炎に面するようにして、細菌が空気に入るのを防ぎます。右手で、感染細菌の接種リングを寒天表面上で密に、しかし重ならないように前後に動かし、最初のゾーンであるプレート全体の約1/5〜1/6の領域をカバーします。
      注意: 接種リングと寒天は、30°〜40°の角度で穏やかに接触している必要があります。寒天の損傷は、手首の力でスライドさせることで回避できます。
    3. 接種リング上の余分な細菌を焼灼する(各領域を焼灼するか滅菌するかは、検体中の細菌の量に依存する)。冷却後、最後に最後から2番目の行2〜3を繰り返し、2番目の領域(プレート領域の約1/4)を描画します。
    4. 2番目のゾーンが終了したら、リングを焼灼し、同じ方法で3番目のゾーンを描画してプレート全体を満たします。
    5. 線が引かれたら、プレートを皿の蓋の上に置き、プレートに印を付け、37°Cのインキュベーターで18〜24時間インキュベートして、寒天表面のコロニーの分布を観察します。単一のコロニーが分離されているかどうかに注意を向け、コロニーの特性(サイズ、形状、透明度、色素沈着など)を観察します。
  2. 細菌の活性化:翌日、2つの50 mL振とうフラスコを取り、それぞれに20 mLのMH(B)培地( 材料表を参照)を追加します。10 μLのピペットチップで2つの単一コロニーを選び、シェーカーに加えます。コロニーを37°Cで220rpmで一晩インキュベートします。
  3. 二次活性化:翌日、それぞれ20mLのMH(B)培地を含む2つの50mL振とうフラスコを取ります。最初の活性化細菌を含むシェーカーから200 μLの細菌溶液を取り出し、20 mLのMH(B)培地を含む2つの新しいフラスコに加え、37°Cおよび220 rpmで5時間インキュベートします。
  4. 2番目の活性化菌液を50 mLの遠沈管に集め、3,000 x g で20分間分離し、上清を廃棄します。
  5. 沈殿した細菌を40mLの生理食塩水に再懸濁します。.
  6. 菌液のOD600 値を測定し、生理食塩水で1に調整します。このとき、実験におけるMRSA252の菌量は2 x 109 CFU/mLであった。
  7. 細菌溶液をOD600 1で1 x 109 CFU / mLの濃度に希釈します。
  8. 48匹のBalb/cマウスを4つのグループにランダムに分けます(n = 12)。
    注:グループI:PBSグループ。グループII:BNEコントロールグループ;グループIII:ナイーブ抗原[タンパク質]グループ;グループIV:ナノエマルジョンアジュバントワクチン群。
  9. 100 mg / kgの1%ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射によってマウスに麻酔をかけます。.
  10. マウスに赤外線理学療法ランプ( 材料表を参照)を約1分間照射して、尾静脈の血管拡張を引き起こします。
  11. 希釈した細菌溶液(ステップ5.7)を尾静脈に1匹あたり100 μL注射してマウスに挑戦します。
  12. マウスが通常の活動に戻るまで、赤外線理学療法ランプの下に置きます。
  13. マウスの生存を12時間ごとに10日間観察および記録します。
  14. 攻撃を生き延びたマウスを100 mg / kgの1%ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射により安楽死させます。.

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結果

ナノエマルジョンアジュバントワクチンを調製するためのプロトコル、ならびにこのワクチンのインビトロおよびインビボ試験を評価した。TEM、AFM、およびDLSを使用して、このサンプルの表面のゼータ電位と粒子サイズの重要な特性を決定しました(図1)。SDS-PAGEとウェスタンブロッティングでは、遠心分離後、沈殿物と上清中の抗原量が有意に分解されず?...

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ディスカッション

細菌の細胞壁に固定され、鉄で調節された表面タンパク質であるIsdBは、ヘム鉄15を得るプロセスにおいて重要な役割を果たします。アルファ毒素であるHlaは、MRSAで知られている最も効果的な細菌毒素の1つであり、真核細胞に細孔を形成し、接着および上皮細胞を妨害する可能性があります16。本研究では、IsdBとHlaの抗原遺伝子?...

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開示事項

著者は、この作業に利益相反がないことを宣言します。

謝辞

この研究は、中国の国家重点研究開発プログラムのNo.2021YFC2302603、NSFCの第32070924および32000651、および重慶の自然科学財団プロジェクトプログラムのNo.2019jcyjA-msxmx0159によってサポートされました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11Eppendorf, Germany 5424000495
96-well platesCorning Incorporated, USACLS3922
AFM Dimension FastScanBRUKER, Germany null
Alcohol lampShenzhen Yibaxun Technology Co.,ChinaYBS-AA-11408
Balb/c mice Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. 
BCIP/NBTFuzhou Maixin Biotechnology Development Company,ChinaBCIP/NBT
Bio-Rad 6.0 microplate readerBio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USAnull
BL21 Competent CellMerck millipore,Germany70232-3CN
BSA-100GSigma-Aldrich, USAB2064-100G
Centrifuge 5810 REppendorf, Germany 5811000398
Coomassie bright blue G-250 staining solutionMIKX,ChinaDB236
Decolorization solutionBOSTER,ChinaAR0163-2
Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420Shanghai Yuejin Medical Device Factory, Chinanull
Electrophoresis apparatusBeijing Liuyi Instrument Factory, ChinaDYCZ-25D
Gel imageTanon, USAnull
Glutathione-Sepharose Resin GSTMei5bio,Chinaaffinity chromatography resin
H2SO4Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China7664-93-9
HI recombinant proteinThird Military Medical University,China110-27-0
HRP -Goat Anti-Mouse IgGBiodragon, ChinaBF03001
HRP- Goat anti-mouse IgG1Biodragon, ChinaBF03002R
HRP- Goat anti-mouse IgG2aBiodragon, ChinaBF03003R
HRP- Goat anti-mouse IgG2bBiodragon, ChinaBF03004R
Inoculation loopHaimen Feiyue Co.,LTD,ChinaYR-JZH-1UL
IsdB and Hla clonesShanghai Jereh Biotechnology Co,Chinanull
Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant)SEPPIC, Francenull
isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranosidefdbio,ChinaFD3278-1
LB bouillon culture-mediumBeijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China02-136
Lnfrared physiotherapy lampGuangzhou Runman Medical Equipment Co.,China7600
Low temperature refrigerated centrifugeEppendorf, Germany null
Malvern NANO ZSMalvern Instruments Ltd., UKnull
MH(A) mediumBeijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China02-051
MH(B) mediumBeijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China02-052
Micro plate washing machine 405 LSRSBio Tek Instruments,Inc Highland  Park,USAnull
Mini-TBC Compact Film Transfer InstrumentBeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China1658030
MMC packingTOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD0022818
MRSA252USA, ATCCnull
Nanodrop ultraviolet spectrophotometerThermo Scientific, USAnull
New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kitDAKEWE, China8012011
PBSbiosharp, Chinanull
PCR, AmplifierThermal Cycler, USAnull
pGEX-target gene recombinant plasmidShanghai Jereh Biotechnology Co,ChinaB3528G
Phosphotungstic acidG-CLONE, ChinaCS1231-25g
pipetteEppendorf, Germany 3120000844
polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant)Aladdin, ChinaK400327-1kg
Primary antibodyLaboratory homemade:from immunized mice with positive seranullSee Reference 11 for details
propylene glycol (pharmaceutic adjuvant)Sigma-Aldrich, USAP4347-500ML
Protein MarkerThermo Scientufuc, USA26616
PVDF TRANSFER MEMBRANEInvitrogen,USA88518
Scanning Electron MicroscopeJEOL,JapanJSM-IT800
Sodium pentobarbitalMerck,GermanyTc-P8411
Talos L120C TEMThermo Fisher, USAnull
TMB color solutionTIAN GEN, ChinaPA107-01
Turtle kitsXiamen Bioendo Technology Co.,LTDES80545
Tween-20Macklin, China9005-64-5

参考文献

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