JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מכין ומעריך את התכונות הפיזיקליות, התגובה החיסונית וההשפעה המגנה in vivo של חיסון אדג'ובנטי ננו-תחליב חדשני.

Abstract

חיסונים אדג'ובנטיים של ננו-תחליב משכו תשומת לב נרחבת בגלל גודל החלקיקים הקטן שלהם, יציבות תרמית גבוהה ויכולתם לגרום לתגובות חיסוניות תקפות. עם זאת, קביעת סדרה של פרוטוקולים מקיפים להערכת התגובה החיסונית של חיסון אדג'ובנטי ננו-תחליב חדשני היא חיונית. לכן, מאמר זה כולל הליך קפדני לקביעת המאפיינים הפיזיקוכימיים של חיסון (על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור [TEM], מיקרוסקופ כוח אטומי [AFM], ופיזור אור דינמי [DLS]), יציבות האנטיגן והמערכת של החיסון (על ידי בדיקת צנטריפוגה במהירות גבוהה, בדיקת יציבות תרמודינמית, SDS-PAGE וכתם מערבי), והתגובה החיסונית הספציפית (IgG1, IgG2a, ו- IgG2b). באמצעות גישה זו, חוקרים יכולים להעריך במדויק את ההשפעה המגנה של חיסון אדג'ובנטי ננו-תחליב חדשני במודל קטלני של עכבר MRSA252. בעזרת פרוטוקולים אלה, ניתן לזהות את האדג'ובנט המבטיח ביותר של חיסון ננו-תחליב במונחים של פוטנציאל אדג'ובנטי יעיל. בנוסף, השיטות יכולות לסייע באופטימיזציה של חיסונים חדשים לפיתוח עתידי.

Introduction

סטפילוקוקוס זהוב עמיד למתיצילין (MRSA) הוא פתוגן אופורטוניסטי עם אחד משיעורי הזיהום הגבוהים ביותר ביחידה לטיפול נמרץ (ICU) מחלקות1, מחלקות קרדיולוגיה ומחלקות כוויות ברחבי העולם. MRSA מציג שיעורים גבוהים של זיהום, תמותה ועמידות רחבה לתרופות, מה שמציג קשיים גדולים בטיפול קליני2. ברשימת העדיפות העולמית של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה שפורסמה על ידי ארגון הבריאות העולמי (WHO) בשנת 2017, MRSA היה רשום בקטגוריה3 הקריטית ביותר. לכן יש צורך דחוף בחיסון נגד זיהום MRSA.

אדג'ובנט אלומיניום נמצא בשימוש מזה זמן רב, ומנגנון העזר האדג'ובנטי ברור יחסית, בטוח, יעיל ונסבל היטב4. אדג'ובנטים מאלומיניום הם כיום סוג נפוץ של אדג'ובנט. מקובל לחשוב כי אנטיגנים הנספחים על חלקיקי מלח אלומיניום יכולים לשפר את היציבות ולשפר את היכולת של אתר ההזרקה לספוג אנטיגנים, לספק ספיגה טובה ושחרור איטי5. נכון לעכשיו, החיסרון העיקרי של אדג'ובנטים מאלומיניום הוא שהם חסרים אפקט אדג'ובנטי או מציגים רק השפעה אדג'ובנטית חלשה על חלק מהאנטיגנים המועמדים לחיסון6. בנוסף, אדג'ובנטים מאלומיניום גורמים לתגובות רגישות יתר בתיווך IgE5. לכן, יש צורך לפתח אדג'ובנטים חדשים כדי לעורר תגובה חיסונית חזקה יותר.

אדג'ובנטים של ננו-תחליב הם מערכות פיזור קולואידיות המורכבות מנפט, מים, חומרים פעילי שטח וקוסורפקטנטים7. בנוסף, האדג'ובנטים יציבים מבחינה תרמודינמית ואיזוטרופיים, ניתנים לאוטוקלאבינג או לייצוב על ידי צנטריפוגה במהירות גבוהה, ויכולים להיווצר באופן ספונטני בתנאי הכנה מתונים. מספר אדג'ובנטים של תחליב (כגון MF59, סדרת NB001-002, סדרת AS01-04 וכו ') נמצאים כיום בשוק או בשלב המחקר הקליני, אך גודל החלקיקים שלהם גדול מ -160 ננומטר8. לכן, היתרונות של תכשירים רפואיים ננומטריים (1-100 ננומטר) (כלומר, שטח פנים ספציפי גדול, גודל חלקיקים קטנים, אפקט פני שטח, אנרגיית שטח גבוהה, אפקט גודל קטן ואפקט מנהור קוונטי מאקרו) אינם ניתנים לניצול מלא. בפרוטוקול הנוכחי, אדג'ובנט חדשני המבוסס על טכנולוגיית ננו-תחליב בקוטר של 1-100 ננומטר דווח כבעל פעילות אדג'ובנטית טובה9. בדקנו את חלבון האנטיגן של החיסון מסוג רקומבינציה HI (מוטנט α-המוליזין [Hla] ומשטח יון Fe הקובע גורם B [IsdB] תת-יחידה N2 חלבון היתוך מקטע פעיל); סדרה של נהלים נקבעו כדי לבחון את התכונות הפיזיות והיציבות, להעריך את תגובת הנוגדנים הספציפית שלו לאחר מתן תוך שרירי, ולבחון את ההשפעה המגנה של החיסון באמצעות מודל זיהום מערכתי בעכבר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הניסויים בבעלי חיים נערכו על בסיס המדריך לשימוש וטיפול בחיות ניסוי ואושרו על ידי הוועדה לרווחת חיות מעבדה ואתיקה של האוניברסיטה הרפואית הצבאית השלישית. נקבות עכברי Balb/c, בנות 6-8 שבועות, שימשו במחקר הנוכחי. בעלי החיים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים).

1. הכנת חלבון האנטיגן MRSA HI

  1. להשיג שיבוטים של IsdB ו-Hla ממקורות מסחריים (ראה טבלת חומרים), לבצע הגברה של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי להגביר את הגנים IsdB ו-Hla, ולשייך את מוצריהם לפלסמיד PGEX-6P-2 (המתקבל באופן מסחרי; ראה טבלת חומרים). מסך עם זן Xl/כחול וקטורי של Escherichia coli10.
  2. הפוך את השיבוט החיובי לתאים מוכשרים של E. coli BL21 (ראה טבלת חומרים) והגבר עם תרבית כרישים10.
  3. לבטא את האנטיגן ולבודד לאחר אינדוקציה עם isopropyl-β-D-1-mercaptogalactopyranoside וכרומטוגרפיה multimodal (MMC) לבודד ערכות11 (ראה טבלה של חומרים).
  4. לאפיין את חלבון האנטיגן ולטהר אותו עם מטהר אוטומציה מלאה11.
    1. חלבונים מתויגים ב-Affinity-purify gutathione S-transferase (GST) מליזטים מנוקים באמצעות שרף כרומטוגרפיית זיקה זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים).
    2. לטהר את החלבונים הרקומביננטיים על ידי MMC11.
    3. הסר את האנדוטוקסין בשיטת הפרדת הפאזה Triton X-11411. בקצרה, יש לערבב 1% Triton X-114 עם חלבון רקומביננטי בטמפרטורה של 0°C למשך 5 דקות כדי להבטיח תמיסה הומוגנית, ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות כדי לאפשר היווצרות של שני שלבים.
  5. השתמש בשיטת בדיקת אנדוטוקסיןחיידקי 11 עם ערכות צבים (ראה טבלת חומרים) כדי לזהות את ריכוז האנדוטוקסין. האנדוטוקסין לאנטיגן חלבוני הוא 0.06 EU/μg, נמוך מהתקן הבינלאומי (1.5 EU/μg)10.
    1. בצע בדיקת הפרעה כדי למנוע את ההשפעה האפשרית של מוצר הבדיקה על זיהוי אנדוטוקסין11.
      הערה: על פי נספח 2020 של הפרמקופיאההסינית 12, תכולת האנדוטוקסין צריכה להיות פחות מ- 5 האיחוד האירופי למנה. הרגישות של לימולוס ליזט (λ0.25 EU/mL) ויחס הדילול האפקטיבי המרבי של 33.3 חושבו12 בהתבסס על MVD = cL/λ, כאשר L הוא ערך הגבול של אנדוטוקסין חיידקי עבור מאמר הבדיקה, c הוא הריכוז של תמיסת מאמר הבדיקה, וכאשר L מבוטא ב- EU/m, c שווה ל- 1.0 mg/mL. λ היא הרגישות המסומנת (EU/mL) של מגיב סרטן הפרסה בשיטת הג'ל.
  6. שלב מחדש את האנטיגן (48 kDa, נקבע על ידי 12% אלקטרופורזה ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד [SDS-PAGE]) ב 1.5 מ"ג / מ"ל במים סטריליים ללא אנדוטוקסין או מלח חוצץ פוספט (PBS) (שיטת נתרן dichlorate)11.
    הערה: זמן שיא החלבון היה 13.843 דקות, הטוהר היה 99.4% (שיטת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים), והחלבון אוחסן ב -70 ° C10. DNA גנומי שהופק מזן S. aureus MRSA252 (ראה טבלת חומרים) שימש כתבנית PCR. הגן IsdB הוגבר באמצעות פריימר קדמי 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
    C-39 והפריימר ההפוך 59-TTTTCCTTTTGCGG
    CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTCT-39. הגן Hla הוגבר באמצעות פריימר קדמי PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC) והפריימר ההפוך PHLAR (TAAGCGGCCGCTTAT
    CAATTTGTCATTTCTCTTC).

2. הכנת חיסון ננו-תחליב

  1. לפי יחס המסה של 1:6:3 (w/w), הוסיפו שלושה סוגים של חומרים פעילים ברצף (איזופרופיל מיריסטט, שמן קיק פוליאוקסאתילן ופרופילן גליקול; ראו טבלת חומרים) לתמיסת חלבון האנטיגן HI (10 מ"ג/מ"ל) וערבבו היטב. לאחר מכן, הוסיפו מים טהורים מעוקרים בהדרגה כדי להגיע לנפח סופי של 10 מ"ל וערבבו במהירות 500 סל"ד ו-25 מעלות צלזיוס במשך כ-20 דקות.
    הערה: הננו-תחליב שהוכן בפרוטוקול זה הוא בעל נפח של 10 מ"ל, והמסות של שלושת החומרים הפעילים הן 0.34 גרם, 2 גרם ו-1 גרם, בהתאמה. הפתרון החלבוני כאן הוא פתרון העבודה, פי 10 מהריכוז של התמיסה הסופית.
  2. הכן את החיסון האדג'ובנטי ננו-תחליב (1 מ"ג/מ"ל חלבון) בשיטות תחליב באנרגיה נמוכה13 כדי לקבל תמיסה נוזלית ברורה ושקופה.
    הערה: ננו-תחליב ריק (BNE) הוכן בשיטות דומות, אלא שמים הוחלפו ב-HI. שיטת התחליב הרגילה כוללת חימום הפאזה החיצונית והפנימית לכ-80 מעלות צלזיוס לצורך תחליב ולאחר מכן ערבוב וקירור הדרגתיים. בתהליך זה, כמות גדולה של אנרגיה נצרכת, ולבסוף, תחליב מתקבל.

3. אפיון פיזי ויציבות של החיסון האדג'ובנטי ננו-תחליב

  1. גודל חלקיקים, פוטנציאל זטה ואפיון אינדקס פיזור פולימרים (PDI).
    1. הכינו 100 μL של החיסון האדג'ובנטי ננו-תחליב ודללו פי 50 במים להזרקה. הוסף 2 מ"ל של דגימה לזיהוי.
    2. שימו לב לגודל החלקיקים, פוטנציאל הזטה וה-PDI ב-25°C באמצעות ננו זטסייזר (ZS; ראו טבלת חומרים).
  2. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM)
    1. לדלל 10 μL של חיסון ננו-תחליב 50 פעמים עם מים, להניח על רשת נחושת מצופה פחמן 100-mesh, ולהכתים עם 1% חומצה phosphotungstic (ראה טבלה של חומרים) במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. הסר תמיסת חומצה פוספוטונגסטית עודפת עם נייר סינון.
    3. התבוננו במורפולוגיה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (ראו טבלת חומרים). בדקו האם המוצרים המוגמרים כמעט יציבים ומעגליים בתוך שדה הראייה של מיקרוסקופ האלקטרונים והאם הם מפגינים פיזור טוב.
  3. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM)
    1. לדלל 10 μL של החיסון האדג'ובנטי ננו-תחליב פי 50 עם מים, להטיל 10 μL של דגימות מדוללות מראש על פרוסת סיליקון, ומניחים באינקובטור מבוקר תרמוסטט 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
    2. מרססים את הפלטינה המוכנה על הסיליקון למשך 40 שניות ומצננים לטמפרטורת החדר.
    3. התבונן בתכונות המורפולוגיות של הדגימות המוכנות תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ברזולוציה גבוהה (ראה טבלת חומרים). קבע אם הדגימות כמעט יציבות, כדוריות ומפוזרות היטב בתוך שדה הראייה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים.
  4. יציבות מורפולוגית
    1. מניחים 1 מ"ל של דגימות חיסון ננו-תחליב בצינורות מיקרוצנטריפוגה, ומעריכים את יציבות הדגימות הטריות על ידי צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 13,000 x גרם בטמפרטורת החדר (25 °).
    2. שימו לב למראה של דגימות טריות אלה ולאחר מכן בצעו בדיקת יציבות תרמודינמית של שישה מחזורי טמפרטורה (מחזור אחד: אחסנו בטמפרטורה של 4°C למשך 48 שעות, 25°C במשך 48 שעות ו-37°C במשך 48 שעות).
    3. לאחר הצנטריפוגה, יש לאפשר לדגימות לעמוד במשך 15 דקות כדי לקבוע אם קיים אפקט טינדל (האם הדגימה שקופה ושקופה תחת אור) ואם התרחשה דה-מולסיפיקציה (מוצג על ידי ריבוד ברור לאחר הדמולסיפיקציה).
  5. SDS-PAGE וכתם מערבי
    1. נערו את הדגימות, ערבבו תמיסה של 0.6 מ"ל אתנול מוחלט ו-0.3 מ"ל חיסון, וצנטריפוגה (13,000 x גרם, 30 דקות בטמפרטורת החדר, 25 מעלות צלזיוס).
    2. מעבירים את הסופרנאטנט של התמיסה לצינור נקי וממיסים את המשקע עם 0.3 מ"ל מים. להשיג את תמיסות הסופרנאטנט והזירוז (הן ננו-תחליב ריק והן חיסון) לאחר הטיפול באתנול מוחלט ותמיסת מים מזוקקים, ולבצע את אותו דילול פי 50.
    3. מערבבים 2.5 מ"ל של ג'ל הפרדה A ו-2.5 מ"ל של ג'ל הפרדה B (ראו טבלת חומרים), מוסיפים 50 מיקרוליטר של 10% אמוניום פרסולפט, ומניחים במהירות את התמיסה בצלחת הזכוכית עם פיפטה. מערבבים 1 מ"ל ג'ל מרוכז A ו-1 מ"ל ג'ל B מרוכז, מוסיפים 20 מיקרוליטר של 10% אמוניום פרסולפט לצלחת הזכוכית, מכניסים מסרק בגודל מתאים ומחכים להתמצקות.
    4. הוסף סך של 5 μL של תמיסת חיץ העמסת חלבון 5x לדגימה המדוללת שהתקבלה בשלב 3.5.2, והרתיח את הדגימה במשך 5 דקות.
    5. מוסיפים 10 μL חלבון מחומם לבאר המתאימה, ומוסיפים 5 μL של סמן חלבון לסמן היטב.
    6. חבר את האלקטרודה, הפעל את מד האלקטרופורזה (ראה טבלת חומרים) וכוונן את המתח ל- 300 V. כבה את החשמל כאשר האלקטרופורזה מגיעה למרחק של 1 ס"מ מתחתית גומי PAGE.
    7. הסר את הג'ל ושטוף עם ddH2O. הוסף תמיסת צביעה G-250 בצבע כחול בהיר של קומאסי (ראה טבלת חומרים) למשך 10 דקות. יוצקים את תמיסת הצביעה, ושוטפים את הג'ל פעמיים עם ddH2O.
    8. הוסיפו את תמיסת הסרת הצבע המסחרית וחממו את הג'ל במיקרוגל למשך דקה אחת. נערו את הג'ל במשך 10 דקות, ושנו שוב ושוב את תמיסת הסרת הצבע עד שרקע הג'ל ברור. לאחר מכן, בצע הדמיית ג'ל (ראה טבלת חומרים).
      הערה: הכתם המערבי עובד מראש, כמתואר בשלבים 3.5.1-3.5.6.
    9. השרו שלושה בלוקי נייר מסנן עם מאגר העברת אלקטרופורזה. משרים את קרום הפוליווינילידן פלואוריד (PVDF) במתנול למשך 30 שניות ומעבירים באמצעות מכשיר העברת ג'ל חצי יבש (שתי שכבות של נייר סינון, קרום PVDF, ג'ל אלקטרופורזה ושכבה אחת של נייר סינון). השתמש במתח של 23 V כדי להעביר את הממברנה למשך 23 דקות.
    10. יש להסיר את קרום ה-PVDF ולשטוף פעם אחת במי מלח-טווין 20 (TBST) לאחר ההעברה.
    11. יש להניח את קרום PVDF בתמיסת איטום (תמיסת אבקת חלב דל שומן 5%) ולאטום למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
    12. הסירו את קרום ה-PVDF ושטפו שלוש פעמים עם TBST או 10 דקות כל אחת.
    13. לדגור עם הנוגדן הראשוני (מעכברים מחוסנים עם סרום חיובי). יש לדלל את הנוגדן הראשוני11 (ראו טבלת חומרים) כדי להיבדק פי 500 (פי 100) עם TBST. הניחו את קרום PVDF החסום בנוגדן הראשוני ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת.
    14. הסירו את קרום ה-PVDF ושטפו שלוש פעמים עם TBST במשך 10 דקות כל אחת.
    15. לדגור עם הנוגדן המשני (ראה טבלת חומרים). לדלל פוספטאז אלקליין (AP) - שכותרתו נוגדן משני עז נגד עכבר פי 5,000 עם TBST. מניחים את קרום ה-PVDF בנוגדן המשני ודגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 40 דקות.
    16. הסר את קרום PVDF ושטוף ארבע פעמים עם TBST במשך 10 דקות כל אחת.
    17. יש לטבול את קרומי PVDF בתערובת (בדיוק מספיק כדי לספוג את הממברנה) של מצע AP ניטרו כחול טטרזול (NBT) ו-BCIP (5-ברומו-4-כלורו-3'-אינדוליפפוספט p-toluidine salt) (ראו טבלת חומרים) לצורך צביעה. תוצאה חיובית היא סגולה.
      הערה: התוצאות חייבות להיות פס סגול ברור, ורצועת הדגימה והמשקל המולקולרי של האנטיגן צריכים להיות באותו מיקום מסומן.

4. הערכת התגובה החיסונית של נוגדנים לחיסון זה לאחר מתן תוך שרירי

הערה: העכברים חוסנו על ידי הזרקה תוך שרירית של חיסון ננו-תחליב בעקבות דו"חשפורסם 11. העכברים קיבלו PBS כביקורת שלילית. שבוע לאחר השלמת שלושה חיסונים, נאסף הסרום מהעכברים11. רמות IgG בסרום ותת-הקבוצות של IgG1, IgG2a ו-IgG2b נקבעו כמותית על ידי בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA).

  1. ציפוי אנטיגן: לדלל אנטיגן חלבון HI ל 10 מיקרוגרם / מ"ל עם תמיסת ציפוי ולהוסיף לצלחת ELISA ב 100 μL / באר. יש לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: תמיסת הציפוי מוכנה על ידי המסת 1.6 גרם של נתרן פחמתי נטול מים ו -2.9 גרם של סודיום ביקרבונט ב -1 ליטר של מים נטולי יונים.
  2. איטום: שטפו את הצלחת (שלושה מחזורים, כל מחזור 300 מיקרוליטר). הוסף 300 μL של תמיסת האיטום לכל באר, ואטם את הבארות במשך 2 שעות ב 37 ° C.
    הערה: פתרון האיטום מוכן על ידי הוספת Tween-20 ואלבומין בסרום בקר (BSA) ל- PBS. התוכן של BSA בפתרון PBST הוא 1%.
  3. דילול בסרום: דללו את סרום הדגימה של עכברים 100 פעמים עם PBST (קחו 3 מיקרוליטר של סרום והוסיפו אותו ל-297 מיקרוליטר של PBST ומערבולת), והשתמשו ב-100 מיקרוליטר לכל דגימת סרום. לדלל את הסרום החיובי ואת סרום הבקרה השלילית 100 פעמים עם PBST על ידי הוספת 4 μL ל 396 μL של PBST, ולאחר מכן ערבוב על ידי מערבולת.
  4. דילול יחס כפול: הוסף 200 μL של הסרום הניסיוני המדולל לעיל לשורה הראשונה של צלחת ELISA המצופה והוסף 100 μL של PBST לכל הבארות למעט השורה הראשונה וה- 12. בצע דילול 1:2 ברציפות מהשורה הראשונה: כוונן את הפיפטה ל 100 μL, העבר 100 μL מהשורה הראשונה לשורה השנייה, וערבב עם פיפטה 10 פעמים.
  5. לדלל את הסרום לשורה 11 ביחסים מרובים ולהשליך 100 μL של נוזל.
  6. הוסף סרום שלילי וחיובי מדולל לבארות המתאימות בשורה 12 בהתאם לתבנית לדוגמה (ראה טבלה 1)-100 μL/well.
  7. אטמו את צלחות ELISA בניילון נצמד ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת.
  8. לדלל נוגדנים משניים נגד עכבר IgG-HRP (ראה טבלת חומרים) עם PBST בקנ"מ 1:10,000.
  9. לשטוף את הצלחת (שלושה מחזורים, כל מחזור 300 μL). לאחר מכן, להוסיף 100 μL של נוגדן משני מדולל לכל באר, לדגור את הצלחת ב 37 ° C במשך 40 דקות.
  10. צביעה וסיום: שטפו את הצלחת (חמישה מחזורים, כל מחזור 300 מיקרוליטר). הוסף תמיסת צביעה 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) (100 μL; ראה טבלת חומרים) לכל באר. הניחו את הלוחות בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות הרחק מהאור, ולאחר מכן סיימו את התגובה מיד עם 50 μL של 2 M H2SO4.
  11. זהה את ערך הצפיפות האופטית (OD 450) על-ידי סמן אנזים (קרא את הערך OD450 תוך 15 דקות לאחר הסיום).

5. הערכת ההשפעות in vivo של החיסונים האדג'ובנטיים החדשים

הערה: ההשפעה המגנה של חיסון ננו-תחליב זה הוערכה במודל עכבר MRSA252 קטלני שהושג מסחרית (ראה טבלת חומרים). על פי התוצאות הקודמות של קבוצת המחקר שלנו14, 1 x 108 יחידות יוצרות מושבה (CFU) / עכבר הוא המינון הטוב ביותר כדי להעריך את ההשפעה המגנה של המודל הקטלני של זיהום חיידקי MRSA252.

  1. התאוששות הזן: להשיג צינור של MRSA252 קפואים, לחסן את החיידקים על לוחות מולר הינטון (MH) (A) (ראה טבלת חומרים) על ידי "שיטת שלושת הקווים", ותרבית לילה ב 37 מעלות צלזיוס. בצע את השלבים של "שיטת שלוש שורות" כמפורט להלן:
    1. מחזיקים את טבעת החיסון ביד ימין, צורבים ומקררים אותה כדי לקבל טבעת של נוזל חיידקי.
    2. החזיקו את צלחת האגר ביד שמאל (תוך שמירה על המכסה על השולחן) מעל האזור השמאלי הקדמי של להבת מנורת האלכוהול כך שהצלחת פונה ללהבה ומונעת מהחיידקים להיכנס לאוויר. ביד ימין, הזיזו את טבעת החיסון של חיידקים נגועים קדימה ואחורה על משטח האגר בצורה צפופה אך לא חופפת, המכסה שטח של כ 1/5-1/6 מהצלחת כולה, שהוא האזור הראשון.
      הערה: טבעת החיסון והאגר צריכים להיות במגע עדין בזווית של 30°-40°; ניתן למנוע פגיעה באגר על ידי החלקה בכוח שורש כף היד.
    3. לצרוב את עודפי החיידקים על טבעת החיסון (האם לצרוב או לעקר כל אזור תלוי בכמות החיידקים בדגימה). לאחר הקירור, חוזרים על השורות הלפני אחרונה 2-3 בסוף ומציירים אזור שני (כרבע משטח הצלחת).
    4. לאחר סיום האזור השני, צרוב את הטבעת, וצייר את האזור השלישי באותו אופן כדי למלא את הצלחת כולה.
    5. לאחר שרטוט הקווים, מניחים את הצלחת על מכסה המנה, מסמנים את הצלחת ודגרים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 18-24 שעות כדי לבחון את התפלגות המושבות על משטח האגר. מקדו את תשומת הלב בשאלה האם מושבה בודדת מבודדת, והתבוננו במאפייני המושבה (כגון גודל, צורה, שקיפות ופיגמנטציה).
  2. הפעלת חיידקים: למחרת, קח שתי צלוחיות שייקר של 50 מ"ל והוסף 20 מ"ל של MH (B) בינוני (ראה טבלת חומרים) לכל אחת. בחרו שתי מושבות בודדות עם קצה פיפטה של 10 μL והוסיפו אותן לשייקר. לדגור את המושבות לילה ב 220 סל"ד ב 37 °C (77 °F).
  3. הפעלה משנית: למחרת, קח שתי צלוחיות שייקר של 50 מ"ל, שכל אחת מהן מכילה 20 מ"ל של MH (B) בינוני. הסר 200 μL של תמיסה חיידקית מהשייקר המכיל את החיידקים הפעילים הראשונים, הוסף לשתי הצלוחיות החדשות המכילות 20 מ"ל של MH (B) בינוני, ודגר ב 37 ° C ו 220 סל"ד במשך 5 שעות.
  4. אספו את התמיסה החיידקית הפעילה השנייה בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, הפרידו בטמפרטורה של 3,000 x גרם למשך 20 דקות, והשליכו את הסופרנטנט.
  5. להשעות את החיידקים המושקעים ב 40 מ"ל של מלוחים.
  6. מדוד את ערך OD600 של תמיסת החיידקים והתאם ל-1 עם מי מלח. באותו זמן, כמות החיידקים של MRSA252 בניסוי שלנו הייתה 2 x 109 CFU/mL.
  7. לדלל את הפתרון החיידקי עם OD600 של 1 לריכוז של 1 x 109 CFU/mL.
  8. חלקו באופן אקראי 48 עכברי Balb/c לארבע קבוצות (n=12).
    הערה: קבוצה I: קבוצת PBS; קבוצה II: קבוצת ביקורת BNE; קבוצה III: קבוצת אנטיגן נאיבית; קבוצה IV: קבוצת חיסון אדג'ובנטי ננו-תחליב.
  9. מרדימים את העכברים על ידי הזרקה תוך צפקית של 100 מ"ג/ק"ג של 1% נתרן פנטוברביטל.
  10. הקרינו את העכברים עם מנורת פיזיותרפיה אינפרא אדומה (ראו טבלת חומרים) למשך כדקה אחת כדי לגרום להרחבת כלי הדם של וריד הזנב.
  11. אתגרו את העכברים עם הזרקת התמיסה החיידקית המדוללת (שלב 5.7) לווריד הזנב, 100 מיקרוליטר לעכבר.
  12. הניחו את העכברים מתחת למנורת הפיזיותרפיה האינפרא אדומה עד שיוכלו לחזור לפעילות רגילה.
  13. צפו ותיעדו את הישרדותם של עכברים כל 12 שעות במשך 10 ימים.
  14. להרדים את העכברים ששרדו את ההתקפה על ידי הזרקה intraperitoneal של 100 מ"ג / ק"ג של 1% pentobarbital נתרן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

נבדק הפרוטוקול להכנת החיסון האדג'ובנטי ננו-תחליב ובדיקות in vitro ו-in vivo של חיסון זה. TEM, AFM ו-DLS שימשו כדי לקבוע את המאפיינים החשובים של פוטנציאל הזטה וגודל החלקיקים על פני השטח של הדגימה הזו (איור 1). SDS-PAGE ו-Western Blotting הראו שכמות האנטיגן במשקע ובסופרנאטנט לא ירדה משמעותית...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

IsdB, חלבון פני השטח מעוגן דופן תא חיידקי ומווסת ברזל, ממלא תפקיד חשוב בתהליך קבלת ברזל הם15. HLA, רעלן אלפא, הוא בין הרעלנים החיידקיים היעילים ביותר הידועים ב- MRSA, והוא יכול ליצור נקבוביות בתאים איקריוטים ולהפריע להידבקות ולתאי אפיתל16. במחקר שלנו, חלבון אנטיג...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים בעבודה זו.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מס '2021YFC2302603 של תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין, מס '32070924 ו -32000651 של NSFC, ומס '2019jcyjA-msxmx0159 של תוכנית פרויקט הקרן למדעי הטבע של צ'ונגצ'ינג.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11Eppendorf, Germany 5424000495
96-well platesCorning Incorporated, USACLS3922
AFM Dimension FastScanBRUKER, Germany null
Alcohol lampShenzhen Yibaxun Technology Co.,ChinaYBS-AA-11408
Balb/c mice Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. 
BCIP/NBTFuzhou Maixin Biotechnology Development Company,ChinaBCIP/NBT
Bio-Rad 6.0 microplate readerBio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USAnull
BL21 Competent CellMerck millipore,Germany70232-3CN
BSA-100GSigma-Aldrich, USAB2064-100G
Centrifuge 5810 REppendorf, Germany 5811000398
Coomassie bright blue G-250 staining solutionMIKX,ChinaDB236
Decolorization solutionBOSTER,ChinaAR0163-2
Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420Shanghai Yuejin Medical Device Factory, Chinanull
Electrophoresis apparatusBeijing Liuyi Instrument Factory, ChinaDYCZ-25D
Gel imageTanon, USAnull
Glutathione-Sepharose Resin GSTMei5bio,Chinaaffinity chromatography resin
H2SO4Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China7664-93-9
HI recombinant proteinThird Military Medical University,China110-27-0
HRP -Goat Anti-Mouse IgGBiodragon, ChinaBF03001
HRP- Goat anti-mouse IgG1Biodragon, ChinaBF03002R
HRP- Goat anti-mouse IgG2aBiodragon, ChinaBF03003R
HRP- Goat anti-mouse IgG2bBiodragon, ChinaBF03004R
Inoculation loopHaimen Feiyue Co.,LTD,ChinaYR-JZH-1UL
IsdB and Hla clonesShanghai Jereh Biotechnology Co,Chinanull
Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant)SEPPIC, Francenull
isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranosidefdbio,ChinaFD3278-1
LB bouillon culture-mediumBeijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China02-136
Lnfrared physiotherapy lampGuangzhou Runman Medical Equipment Co.,China7600
Low temperature refrigerated centrifugeEppendorf, Germany null
Malvern NANO ZSMalvern Instruments Ltd., UKnull
MH(A) mediumBeijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China02-051
MH(B) mediumBeijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China02-052
Micro plate washing machine 405 LSRSBio Tek Instruments,Inc Highland  Park,USAnull
Mini-TBC Compact Film Transfer InstrumentBeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China1658030
MMC packingTOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD0022818
MRSA252USA, ATCCnull
Nanodrop ultraviolet spectrophotometerThermo Scientific, USAnull
New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kitDAKEWE, China8012011
PBSbiosharp, Chinanull
PCR, AmplifierThermal Cycler, USAnull
pGEX-target gene recombinant plasmidShanghai Jereh Biotechnology Co,ChinaB3528G
Phosphotungstic acidG-CLONE, ChinaCS1231-25g
pipetteEppendorf, Germany 3120000844
polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant)Aladdin, ChinaK400327-1kg
Primary antibodyLaboratory homemade:from immunized mice with positive seranullSee Reference 11 for details
propylene glycol (pharmaceutic adjuvant)Sigma-Aldrich, USAP4347-500ML
Protein MarkerThermo Scientufuc, USA26616
PVDF TRANSFER MEMBRANEInvitrogen,USA88518
Scanning Electron MicroscopeJEOL,JapanJSM-IT800
Sodium pentobarbitalMerck,GermanyTc-P8411
Talos L120C TEMThermo Fisher, USAnull
TMB color solutionTIAN GEN, ChinaPA107-01
Turtle kitsXiamen Bioendo Technology Co.,LTDES80545
Tween-20Macklin, China9005-64-5

References

  1. Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).
  2. Lakhundi, S., Zhang, K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology. Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020(2018).
  3. Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens. Pathogens. 10 (10), 1310(2021).
  4. Goullé, J. P., Grangeot-Keros, L. Aluminum and vaccines: Current state of knowledge. Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).
  5. Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
  6. Geoghegan, S., O'Callaghan, K. P., Offit, P. A. Vaccine safety: myths and misinformation. Frontiers in Microbiology. 11, 372(2020).
  7. Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Patents on Nanotechnology. 14 (4), 276-293 (2020).
  8. Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
  9. Chen, B. H., Inbaraj, B. S. Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability. Nutrients. 11 (5), 1052(2019).
  10. Zuo, Q. F., et al. Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection. PLoS One. 8 (12), e81212(2013).
  11. Sun, H. W., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
  12. National Pharmacopoeia Committee. Chinese Pharmacopoeia. , China Medical Science and Technology Press. Beijing. 1088(2020).
  13. Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477(2022).
  14. Zeng, H., et al. An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia. The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).
  15. Roy, U., Kornitzer, D. Heme-iron acquisition in fungi. Current Opinion in Microbiology. 52, 77-83 (2019).
  16. Saeed, K., et al. Bacterial toxins in musculoskeletal infections. Journal of Orthopaedic Research. 39 (2), 240-250 (2021).
  17. Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption. Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).
  18. Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).
  19. Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers. Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).
  20. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
  21. Francis, M. J. Recent advances in vaccine technologies. The Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice. 48 (2), 231-241 (2018).
  22. Tripathi, N. K., Shrivastava, A. Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines. Frontiers in Immunology. 9, 1919(2018).
  23. Wilder-Smith, A. Dengue vaccine development: status and future. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).
  24. Korneev, K. V. Mouse models of sepsis and septic shock. Molecular Biology. 53 (5), 799-814 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE199

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved