تجميع وتشغيل مرحلة التبريد لشل حركة C. elegans على لوحات الاستزراع الخاصة بهم

Summary

تصف هذه الورقة بروتوكولات لبناء وتشغيل مرحلة تبريد لشل حركة C. elegans على ألواح الزراعة الأصلية بشكل جماعي.

Abstract

يمكن أن تكشف طرق الفحص المجهري عالية الدقة في الجسم الحي عن معلومات دقيقة وتفاصيل دقيقة داخل الحيوان النموذجي Caenorhabditis elegans (C. elegans) ، ولكنها تتطلب تجميدا قويا للحيوان لمنع ضبابية الحركة في الصور. لسوء الحظ ، تتطلب معظم تقنيات التثبيت الحالية جهدا يدويا كبيرا ، مما يجعل التصوير عالي الدقة منخفض الإنتاجية. يتم تبسيط تجميد C. elegans إلى حد كبير باستخدام نهج التبريد الذي يمكن بسهولة شل حركة مجموعات بأكملها مباشرة على لوحات الزراعة الخاصة بهم. يمكن لمرحلة التبريد إنشاء والحفاظ على نطاق واسع من درجات الحرارة مع توزيع موحد على لوحة الزراعة. في هذه المقالة ، يتم توثيق العملية الكاملة لبناء مرحلة التبريد. الهدف هو أن الباحث النموذجي يمكنه بناء مرحلة تبريد تشغيلية في مختبره باتباع هذا البروتوكول دون صعوبة. يظهر استخدام مرحلة التبريد باتباع ثلاثة بروتوكولات ، ولكل بروتوكول مزايا لتجارب مختلفة. يظهر أيضا مثال على ملف تعريف التبريد للمرحلة مع اقترابها من درجة حرارتها النهائية وبعض النصائح المفيدة في استخدام تثبيت التبريد.

Introduction

يوفر الفحص المجهري البصري عالي الدقة أداة لا غنى عنها لدراسة الهياكل البيولوجية في الجسم الحي على المستوى دون الخلوي. تتطلب العديد من الدراسات البيولوجية تصويرا بدقة دون الميكرون لحل التفاصيل التشريحية الدقيقة ، بما في ذلك مورفولوجيا الخلايا العصبية¹،² ، وبنية الغشاء³،⁴ ، وتوطين البروتين^5،6. تتطلب الصورة عالية الدقة وقت تعرض من عدة أجزاء من الثانية إلى ثوان ، اعتمادا على طريقة التصوير والمسبار ^7,8. لتحقيق أفضل النتائج ، من الضروري تخطيط وإجراء التجارب القائمة على الفحص المجهري بعناية. من الأمور الحاسمة في هذا الجهد طريقة فعالة لإعداد الحيوانات تسهل التصوير عالي الدقة.

الديدان الخيطية C. elegans هي كائن نموذجي يستخدم على نطاق واسع لدراسة العديد من العمليات البيولوجية⁹. يزرع هذا الحيوان الصغير عادة على ألواح أجار متوسطة نمو الديدان الخيطية (NGM) ، ويتكاثر بسرعة عن طريق الإخصاب الذاتي ، مما يجعله مناسبا تماما للدراسات واسعة النطاق. تسمح شفافيتها ومجموعة واسعة من تقنيات وضع العلامات بالتصور المباشر لتشريحها الداخلي^10,11. تعتبر الهياكل الدقيقة في C. elegans مثالية لدراسة العمليات البيولوجية على المستوى تحت الخلوي ، مثل تجديد الخلايا العصبية¹² ، وتنكس الخلايا^{العصبية 13} ، وانقسام الخلايا¹⁴. تتطلب مثل هذه الدراسات التصوير بدقة دون الميكرون وتثبيت الحيوان بقوة كافية لمنع ضبابية الصورة. يعد التثبيت القوي أمرا بالغ الأهمية بشكل خاص للتقنيات التي تتضمن صورا متعددة في المكان أو الزمان ، مثل مكدسات الصور 3D (أي مكدسات z) والتصوير بفاصل زمني. أي حركة حيوانية بين التعرضات يمكن أن تحجب النتيجة. بالنسبة إلى C. elegans ، يتضمن التثبيت القوي عادة التلاعب اليدوي بالحيوانات الفردية وتركيبها على شرائح باستخدام مخدر^15,16. هذه الإجراءات كثيفة الوقت والعمالة تجعل التجارب واسعة النطاق صعبة للغاية. يمكن لاستراتيجية الشلل حيث يتم تجميد الحيوانات بشكل مباشر وعكسي على ألواح الزراعة الأصلية أن تتيح تصويرا عالي الإنتاجية عالي الدقة.

تم عرض تجميد تبريد C. elegans في عدد قليل من الدراسات ولكن لا يتم استخدامه على نطاق واسع. عادة ما يتم دمجه مع جهاز الموائع الدقيقة لزيادة تقييد الحيوانات¹⁷،^18،19. ومع ذلك ، فإن أجهزة الموائع الدقيقة معقدة ، وتتطلب تدريبا تشغيليا كبيرا ، ولا يمكن دمجها بسهولة مع سير عمل الزراعة الصلبة النموذجية لتجارب C. elegans. وبالتالي ، لا يتم استخدام الموائع الدقيقة على نطاق واسع لتجميد C. elegans. يظهر هنا ، بالتزامن مع المنشور الأخير لمختبر^{تشونغ 20} ، إدخال نهج جديد لتجميد التبريد باستخدام مرحلة التبريد الكهروحرارية (الشكل 1) لمعالجة أوجه القصور هذه. مع مرحلة التبريد ، يمكن تبريد لوحة زراعة البوليسترين النموذجية 60 مم إلى أي درجة حرارة مستهدفة (_مجموعة T) بين -8 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة. يمكن لنهج مرحلة التبريد هذا أن يجمد مجموعة كاملة من الحيوانات بسهولة وعكس ذلك بأقل جهد للمستخدم ، مما يلغي 98٪ من وقت معالجة الحيوانات²⁰.

أدناه ، يتم وصف إجراءات بناء مرحلة التبريد من الصفر. باستثناء تصنيع الأجزاء والطباعة ثلاثية الأبعاد ، من المتوقع أن يستغرق الإجراء بأكمله 4 ساعات دون الحاجة إلى أدوات أو خبرات خاصة. بعد ذلك ، يتم وصف ثلاث استراتيجيات تبريد مختلفة بمعدلات تبريد متفاوتة وجهود المستخدم لشل حركة C. elegans على مجهر عمودي نموذجي. قد تعتمد الإستراتيجية المفضلة على تطبيق المستخدم. يتم وصف بروتوكولات استراتيجيات تجميد التبريد الثلاث هذه بالتفصيل.

Protocol

1. تصنيع وإعداد كل مكون من مكونات مرحلة التبريد

ملاحظة: تتكون مرحلة التبريد من عدة مكونات (انظر جدول المواد). معظم المكونات جاهزة. تتطلب نافذة الياقوت طلبا مخصصا ، بينما يمكن تصنيع اللوحة النحاسية وقوس التثبيت ولوحة العزل في الموقع باستخدام مطحنة تحكم رقمية بالكمبيوتر أو طابعة 3D. بعد التصنيع الأولي ، تستغرق عملية التجميع اللاحقة حوالي 2-3 ساعات.

1. استخدم مطحنة التحكم العددي بالكمبيوتر لتصنيع الصفيحة النحاسية من صفائح معدنية نحاسية نقية مقاس 170 مم × 120 مم × 3 مم (الشكل 2 أ). يتم توفير الرسم ثنائي الأبعاد لهذا التصنيع في الملف التكميلي 1. استخدم ورق صنفرة ناعم الحبيبات لإزالة أي حواف حادة وبقايا متسخة.
2. لتصنيع قوس التثبيت ولوحة العزل ، استخدم طابعة ثلاثية الأبعاد وخيوط حمض اللبنيك (PLA) بقطر 1.75 مم (الشكل 2B ، C). للحصول على جودة أفضل ، يجب أن توفر الطابعة ثلاثية الأبعاد ارتفاعا للطبقة أدق من 0.2 مم .3D يتم توفير النماذج في الملف التكميلي 2 والملف التكميلي 3.

2. بناء تجميع تبريد المياه

1. قم بإعداد أنبوب السيليكون المعالج بالبلاتين ، وخزان المضخة ، وكتلة التبريد النحاسية ، والرادياتير (الشكل 3 أ) لبناء مجموعة تبريد المياه. قم بإعداد شفرة حلاقة ومقص ومفتاح سداسي جاهز للاستخدام. كن على دراية بالمخاطر الكهربائية بسبب استخدام المياه طوال فترة التجميع.
2. قطع أنبوب السيليكون إلى ثلاثة أقسام بأطوال مقترحة 40 سم و 50 سم و 80 سم. اضبط الطول عند الحاجة.
3. قم بتوصيل أقسام أنبوب السيليكون من الخطوة 2.2 بمنافذ المبرد وخزان المضخة وكتلة التبريد النحاسية ، كما هو موضح في الشكل 3B. تأكد من أن جميع التوصيلات مانعة لتسرب الماء. تم الآن بناء مجموعة تبريد المياه.
4. قم بإعداد مجموعة تبريد المياه ، ومصدر طاقة 12 فولت ، وثلاثة أسلاك عبور حمراء وثلاثة أسلاك سوداء ، ولوح تجارب ، و 500 مل من الماء النقي.
5. تأكد من خلو طاولة العمل من السوائل للسلامة الكهربائية.
6. قم بتوصيل خزانات المضخة وأسلاك المبرد بمصدر طاقة 12 فولت من خلال لوح التجارب (الشكل 3C). يتم استخدام اللوح للراحة.
   ملاحظة: للحصول على اتصال أكثر ديمومة وأمانا ، يمكن للباحثين استبدال اللوح بأسلاك لحام.
7. افتح غطاء خزان المضخة باستخدام مفك براغي مسطح الرأس. استخدم قمعا لإضافة الماء حتى يمتلئ خزان المضخة بنسبة 80٪ تقريبا (الشكل 3 د). لا تقم بتغطية خزان المضخة بعد هذه التعبئة.
8. قم بتشغيل مجموعة التبريد بالماء عن طريق توصيل مصدر الطاقة 12 فولت أو تشغيله (في حالة وجود مفتاح). بعد التشغيل ، سوف يتدفق الماء داخل التجميع ويجب أن تنفجر المراوح الموجودة على المبرد.
9. بسبب تدفق المياه من خزان المضخة ، سينخفض مستوى السائل في الخزان. أضف المزيد من الماء إلى خزان المضخة حتى يستقر عند 2/3 ممتلئ تقريبا (الشكل 3E).
10. هز المبرد للتخلص من فقاعات الهواء ثم قم بتغطية خزان التبريد.
11. قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.

3. اختبار الأسطح الباردة والساخنة في بلتيير

ملاحظة: بلتيير ، وهو مكون رئيسي في مرحلة التبريد ، عبارة عن مضخة حرارية نشطة ذات حالة صلبة تنقل الحرارة من جانب إلى^{آخر 21}. يصبح أحد سطحي بلتيير ساخنا ، ويصبح السطح الآخر باردا عند توفير الطاقة الكهربائية. بشكل افتراضي ، يقوم مصنعو بلتيير بتمييز السطح البارد قبل البيع ، ولكن لا يزال من المفيد اختباره يدويا قبل التجميع.

1. قم بإعداد مصدر الطاقة القابل للضبط وبلتيير ، كما هو موضح في الشكل 4 أ.
2. تأكد من إيقاف تشغيل مصدر الطاقة القابل للضبط لمنع المخاطر الكهربائية المحتملة.
3. قم بتوصيل السلك الأحمر لبلتيير بالإخراج الموجب والسلك الأسود بالخرج السلبي لمصدر الطاقة القابل للضبط بمشابك التمساح ، والتي يتم توفيرها مع مصدر الطاقة (الشكل 4 ب).
4. قم بتشغيل مصدر الطاقة القابل للضبط واضبطه على حوالي 2 فولت عن طريق تعديل كل من مقابض الجهد والتيار في الصف العلوي من مصدر الطاقة. استخدم إصبعا عاريا على الفور لتشعر بسطحي بلتيير. يصبح سطح واحد باردا في غضون ثوان قليلة.
5. بعد تحديد السطح البارد ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة على الفور وافصل بلتيير.
6. استخدم علامة للإشارة إلى السطح البارد للتجميع في المستقبل.

4. بناء التجميع لتبريد بلتيير باستخدام مجموعة تبريد المياه

1. كما هو موضح في الشكل 4 أ ، قم بإعداد مجموعة تبريد المياه المغلقة ، وبلتيير (السطح البارد ملحوظ) ، والمعجون الحراري (لتحسين التوصيل الحراري).
2. قم بتنظيف جميع أسطح كتلة التبريد النحاسية باستخدام 70٪ إيثانول (أو محلول منظف آخر) في مجموعة التبريد بالماء.
3. ضع حوالي 0.4 جرام من المعجون الحراري على سطح واحد من كتلة تبريد المياه النحاسية وتأكد من أن اتجاه السطح هذا سيمنع الأنابيب من العبور أو الانحناء عند مواجهة لأسفل. استخدم قفازا لحماية الجلد وحاول توزيع المعجون الحراري بشكل رقيق ومتساو (الشكل 4C).
4. وبالمثل ، قم بتنظيف السطح الساخن لبلتيير ، ثم ضع العجينة الحرارية على السطح (الشكل 4 د).
5. قم بتوصيل سطح بلتيير الساخن بسطح كتلة التبريد النحاسية باستخدام معجون حراري. اضغط للتأكد من أنها آمنة. اتبع اتجاه الأسلاك على بلتيير وأنابيب كتلة التبريد النحاسية ، كما هو موضح في الشكل 4E. نظف المعجون الحراري الزائد.
6. حافظ على إيقاف تشغيل كل من مصدر الطاقة 12 فولت ومصدر الطاقة القابل للضبط. قم بتوصيل بلتيير بمصدر الطاقة القابل للضبط ، كما في القسم 3.
7. أعد فحص كل من توصيلات التجميع الكهربائية وتبريد المياه ، ثم قم بتشغيل مصدر الطاقة 12 فولت ومصدر الطاقة القابل للضبط بالتتابع.
8. أدر مصدر الطاقة القابل للضبط تدريجيا إلى 12 فولت. مع بلتيير المقترح ، يجب أن يكون التيار حوالي 7.3 أمبير.
9. انتظر لمدة 2 دقيقة ؛ يجب أن تصبح درجة حرارة سطح بلتيير البارد أكثر برودة من -35 درجة مئوية. قم بقياس درجة الحرارة هذه باستخدام مقياس حرارة بالأشعة تحت الحمراء (الشكل 4F). لا تلمس السطح البارد لمنع إصابة اليدين.
10. تحقق من جميع التوصيلات والمكونات إذا كانت درجة الحرارة لا يمكن أن تصل إلى أقل من -30 درجة مئوية. تعد فقاعات الهواء داخل مجموعة التبريد بالماء سببا محتملا لأداء التبريد دون المستوى الأمثل.
11. لضمان السلامة في الخطوات اللاحقة ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة القابل للضبط ، وانتظر 1 دقيقة ، ثم قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة 12 فولت.

5. بناء لوحة النحاس وتجميع نافذة الياقوت

1. قم بإعداد الصفيحة النحاسية ، ونافذة الياقوت التي يبلغ قطرها 80 مم ، والمعجون الحراري ، وشريط بعرض 4 بوصات ، وشفرة حادة للقطع (الشكل 5 أ).
2. نظف بعناية اللوحة النحاسية ونافذة الياقوت بنسبة 70٪ من الإيثانول واستخدم ورق صنفرة ناعم الحبيبات لتنعيم الأسطح الخشنة.
3. ضع المعجون الحراري على ثلاثة أسطح داخلية ، كما هو موضح في الشكل 5 ب. تأكد من أن المعجون الحراري يغطي جميع مساحات السطح الثلاثة ولكنه ليس سميكا جدا ، حوالي 0.5 مم.
4. ضع اللوحة النحاسية على سطح الطاولة المحمي بورق الطابعة. الورقة تجعل التنظيف اللاحق أسهل.
5. أدخل نافذة الياقوت في فتحة الصفيحة النحاسية (الشكل 5C). تأكد من عدم دوران الياقوت أثناء الإدخال لمنع المعجون الحراري من الانتقال إلى مناطق أخرى. إزالة معجون الحرارية الزائدة.
6. قم بلصق الشريط بعرض 4 بوصات على السطح العلوي لمجموعة نافذة الصفيحة النحاسية الياقوت (السطح الذي يحتوي على منطقة انخفاض مربعة ، كما هو موضح في الشكل 5 د). تجنب فقاعات الهواء بين الشريط والأسطح النحاسية أثناء اللصق عن طريق توجيه الالتصاق ببطء من جانب إلى آخر.
7. اقطع المناطق الزرقاء المتقطعة المحددة من الشريط باستخدام شفرة حادة ، باتباع الشكل 5E. يكشف القطع عن فتحتي الخيط ، والاكتئاب المربع ، ومساحة قطرها 70 مم لنافذة الياقوت.
8. قم بلصق السطح السفلي لمجموعة نافذة الصفيحة النحاسية الياقوت ثم كرر إجراء القطع (منطقة الياقوت فقط) على هذا السطح ، كما هو موضح في الشكل 5F.
   ملاحظة: الآن ، يتم تثبيت نافذة الياقوت على الصفيحة النحاسية ، والأسطح النحاسية محمية من الصدأ.

6. التجميع النهائي لمرحلة التبريد

1. تأكد من أن جميع التركيبات الفرعية والمكونات الأساسية جاهزة.
2. ضع حوالي 0.4 غرام من المعجون الحراري على الاكتئاب المربع للوحة النحاسية (الشكل 6 أ).
3. ضع حوالي 0.4 غرام من المعجون الحراري على السطح البارد لبلتيير. لاحظ أن بلتيير متصل بالفعل بكتلة التبريد النحاسية (الشكل 6 ب).
4. قم بتوصيل سطح بلتيير البارد بانخفاض الصفيحة النحاسية بضغط هبوطي. نظف كل المعجون الحراري الزائد (الشكل 6 ج).
5. قم بتركيب القوس المطبوع ثلاثي الأبعاد أعلى كتلة التبريد النحاسية ، ثم استخدم مفتاحا سداسيا لإحكام ربط براغي بطول 8-32 ، 0.5 بوصة لتثبيت الحامل على اللوحة النحاسية (الشكل 6 د). استخدم شد عزم الدوران المنخفض حتى لا تنكسر الدعامة المطبوعة أو تتشوه لضمان التوصيل الحراري المناسب من بلتيير إلى النحاس.
6. ضع الصفيحة النحاسية في قاعدة العزل المطبوعة 3D للعزل الحراري من سطح الطاولة أو قاعدة المجهر أثناء التشغيل (الشكل 6D).
7. يتم تجميع مرحلة التبريد وجاهزة للاستخدام (الشكل 6E).
8. بالنسبة للفحص المجهري ، ضع مرحلة التبريد المكتملة على منصة مجهر عمودية (الشكل 7 أ).
9. اكتمال تجميع مرحلة التبريد. يتوفر مزيد من التفاصيل من المنشور المصاحب لمختبر تشونغ ، والذي يميز بشكل كامل الاستراتيجيات التفصيلية وحركة الحيوانات²⁰.

ملاحظة: في الأقسام التالية ، تتم مناقشة بروتوكولات التبريد البطيء والسريع والمفاجئ. تم استخدام خنثى N2 في L4 أو سن الشباب لإنتاج البيانات التالية. استراتيجية التبريد البطيء مفيدة لشل حركة N2 المزروعة 20 درجة مئوية عند 6 درجات مئوية. يتم تجميد N2 المزروعة 15 درجة مئوية بقوة عند 1 درجة مئوية²⁰. وترد مقارنة موجزة بين بروتوكولات التبريد الثلاثة هذه في الجدول 1.

7. بروتوكول تجميد التبريد البطيء

1. انقل طبق الزراعة بغطاء إلى ثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية.
2. بعد نقل لوحة الزراعة إلى الثلاجة ، قم بتشغيل مصدر الطاقة 12 فولت لمرحلة التبريد واضبط جهد إمداد الطاقة القابل للضبط على 5.5 فولت.
3. بعد بقاء صفيحة الزراعة ذات الغطاء في الثلاجة 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة ، انقل اللوحة على الفور إلى مرحلة التبريد وقم بإزالة الغطاء (الشكل 7 أ). عادة ما تكون ألواح الزراعة هذه حوالي 6 درجات مئوية. مرحلة التبريد المسبق مستقرة وباردة بما يكفي للحفاظ على سطح أجار عند 6 درجات مئوية.
4. إذا تغيرت درجة حرارة سطح أجار ، كما تم قياسها أو من خلال ملاحظة حركة الحيوان ، اضبط الجهد قليلا حتى يستقر عند 6 درجات مئوية.
5. يتم تجميد الحيوانات بشكل صحيح في وقت النقل.

8. بروتوكول تجميد التبريد السريع

ملاحظة: استراتيجية التبريد السريع هي طريقة التثبيت الأساسية (انظر الفيلم 1) ؛ ومع ذلك ، تحتل لوحات أجار المسرح بشكل خامل لفترة طويلة أثناء الوصول إلى_مجموعة T. أيضا ، عندما تكون هناك حاجة إلى تثبيت قوي_{ومجموعة T هي} 6 درجات مئوية ، يتم تمديد وقت الخمول إلى حوالي 1 ساعة^{و 20}.

1. قم بتشغيل مصدر الطاقة 12 فولت لمرحلة التبريد واضبط جهد إمداد الطاقة القابل للضبط على حوالي 12 فولت. انتظر لمدة 10 دقائق.
2. أحضر صفيحة زراعة من حاضنتها مباشرة إلى مرحلة التبريد وقم بإزالة الغطاء.
3. بمجرد انخفاض درجة حرارة سطح أجار إلى (T_set + ΔT) °C ، اضبط مصدر الطاقة القابل للضبط على_{V set} وانتظر حتى يصل الآجار إلى_مجموعة T. مجموعة V هي الجهد المناسب لتثبيت أجار عند_مجموعة T. ΔT هو متغير يمنع التبريد الزائد. انظر الجدول 2 للحصول على مزيج من_مجموعة T و ΔT_{و V} مجموعة.
   ملاحظة: تتعلق البيانات الواردة في الجدول 2 تحديدا بمختبر تشونغ، وبالتالي تجدر الإشارة إلى أن المعلمات التجريبية قد تختلف بناء على الظروف البيئية وظروف الاستخدام الفريدة لكل تجربة على حدة.
4. يتم تجميد الحيوانات عندما يصل أجار إلى_مجموعة T. يتحسن الشلل مع مرور الوقت حتى ~ 50 دقيقة بعد بدء التبريد.

9. بروتوكول تجميد التبريد المفاجئ

ملاحظة: تستهلك استراتيجية التبريد المفاجئ معظم وقت المستخدم ولكنها تشل حركة الحيوانات بسرعة أكبر من درجة حرارة زراعتها.

1. قم بتشغيل مصدر الطاقة 12 فولت لمرحلة التبريد وقم بتحويل جهد إمداد الطاقة القابل للضبط إلى حوالي 12 فولت. احتفظ به لمدة 10 دقائق.
2. أحضر صفيحة أجار غير مشغولة إلى مرحلة التبريد. استخدم الخطوة 8.3 في بروتوكول تثبيت التبريد السريع لتثبيت درجة حرارة سطح أجار عند_مجموعة T.
3. انقل الحيوانات من صفيحة الزراعة الأصلية إلى الصفيحة المبردة الموجودة في مرحلة التبريد.
4. بناء على حجم الحيوان الصغير ، من المتوقع أن تبرد الحيوانات_{إلى T في} ثوان ويتم تجميدها. يتحسن الشلل مع مرور الوقت حتى ~ 50 دقيقة بعد بدء التبريد.

10. إحياء الحيوانات بعد تجميد التبريد

1. انقل لوحة الثقافة المبردة مرة أخرى إلى الحاضنة الأصلية أو إلى درجة حرارة الغرفة.
2. انتظر لمدة 20 دقيقة إلى 1 ساعة حتى تنتعش جميع الديدان الموجودة على اللوحة إلى سلوكها الطبيعي في الزحف والتغذية.

النتائج

قياس درجة حرارة التبريد
بالنسبة لتجارب تجميد التبريد الأولية ، من المهم تتبع درجة حرارة سطح أجار لضمان إمكانية تجميد الحيوانات بشكل صحيح. يمكن للتجارب المستقبلية التي يتم تكرارها من التجربة الأولية استخدام نفس المعلمات ، عادة دون تتبع درجة الحرارة بشكل متكرر. لقياس درجة الحرارة ، يتم تعقيم طرف الترمومتر المزدوج الحراري باستخدام محلول إيثانول بنسبة 70٪ ، في انتظار أن يتبخر الإيثانول تماما قبل الاستخدام. بعد ذلك ، يتم إدخال طرف المزدوجة الحرارية 1 مم في أجار NGM لضمان قراءة دقيقة لدرجة الحرارة. يتم تثبيت طرف مقياس الحرارة باستخدام حامل مشبك أو حوامل أخرى (الشكل 7 ب).

قياس درجة الحرارة بكاميرا الأشعة تحت الحمراء
تم تصميم مرحلة التبريد لضمان توزيع درجة الحرارة في المنطقة المركزية التي يبلغ قطرها 40 مم للوحة بشكل موحد. يتم استخدام كاميرا الأشعة تحت الحمراء التطلعية (FLIR) لتصوير توزيع درجة الحرارة على سطح أجار. يبلغ الحد الأقصى لفرق درجة الحرارة حوالي 1 درجة مئوية عندما تكون_مجموعة T 1 أو 3 أو 6 درجات مئوية (الشكل 8 أ).

تقييم معدل التبريد باستخدام استراتيجية التبريد السريع
تستخدم استراتيجية التبريد السريع لتوصيف معدل التبريد لمرحلة عند 12 فولت. يتم وضع لوحة 20 درجة مئوية في مرحلة التبريد ويتم استخدام مقياس حرارة مزدوج حراري لتتبع درجة حرارة السطح. تبرد المرحلة ألواح 20 درجة مئوية إلى 6 درجات مئوية في 6 دقائق ، إلى 1 درجة مئوية في 10 دقائق ، وتستقر في النهاية أقل من -7 درجة مئوية في حوالي 40 دقيقة (الشكل 8 ب).

استخدام مرحلة التبريد على منصة مجهر عمودية
يشتمل المجهر المستقيم عادة على هدف للتصوير ، ومرحلة لحمل العينات ، والإضاءة. تم تصميم مرحلة التبريد هذه للاستخدام في مرحلة المجهر المستقيم النموذجية مع سهولة الإدخال والإزالة (الشكل 8C). عندما تكون هناك حاجة إلى تجميد التبريد للتصوير أو الفحص ، يتم وضع مرحلة التبريد ببساطة على مرحلة المجهر لإنهاء القسط والعكس صحيح.

يظهر تجميد الديدان على لوحة التبريد في الفيلم 1.

الشكل 1: نموذج 3D لجهاز مرحلة التبريد. لا يتم عرض الاتصالات الإلكترونية من أجل الوضوح. يضخ الخزان الماء عبر كتلة التبريد لإزالة الحرارة المنقولة بواسطة بلتيير المضمنة في المسرح. يمكن وضع صفيحة زراعة البوليسترين النموذجية مقاس 60 مم على نافذة الياقوت الشفافة وتبريدها حسب المرحلة. نموذج تم إنشاؤه في سوليدووركس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: نماذج 3D للمكونات المراد تصنيعها. أ: صفيحة نحاسية. (ب) قوس عقد مطبوع 3D. (C) لوحة عزل مطبوعة 3D. النماذج التي تم إنشاؤها في سوليدووركس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تجميع تبريد الماء . (أ) المكونات الفردية. أنابيب مقطوعة لأطوال محددة. (ب) توصيل مكونات التبريد بالماء. (ج) الأسلاك التي تربط خزان المضخة والرادياتير بمصدر الطاقة 12 فولت. بشكل عام ، تتصل الأسلاك الحمراء بالطرف الموجب ، والأسلاك السوداء بالطرف السالب. د: سكب الماء النقي في المضخة. (ه) امتلأ الخزان إلى أكثر من الثلثين لتحقيق الكفاءة المثلى للمضخة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: توصيل بلتيير ومجموعة تبريد المياه. (أ) مكونات لتشغيل بلتيير. (ب) استخدام مصدر الطاقة القابل للضبط لتحديد الجوانب الساخنة والباردة لبلتيير. للسلامة ، لا يتم استخدام أكثر من 2 فولت. (ج) تطبيق معجون حراري متساو على سطح كتلة النحاس. (د) تطبيق معجون حراري متساو على سطح بلتيير الساخن. (ه) الجانب الساخن من بلتيير مضغوط على الكتلة النحاسية بعجينة حرارية. (F) مقياس حرارة الأشعة تحت الحمراء المستخدم لقياس درجة حرارة سطح بلتيير البارد. من الناحية المثالية ، يمكن أن تصل درجة الحرارة الباردة إلى ما يقرب من -35 درجة مئوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: تجميع الصفيحة النحاسية ونافذة الياقوت . (أ) المكونات المطلوبة. (ب) معجون حراري يوضع على ثلاثة أسطح داخلية للوحة النحاسية حيث ستتلامس نافذة الياقوت. منظران لأسفل للوحة النحاسية يوضحان موقع الأسطح الثلاثة. (ج) نافذة من الياقوت في فتحة الصفيحة النحاسية. (د) شريط لاصق على السطح العلوي للتجميع. (ه) الجانب العلوي: تشير الخطوط الزرقاء المتقطعة إلى مواقع قطع الشريط وإزالته: انخفاض مربع ، فتحتان ، ومنطقة ياقوت قطرها 70 مم. (F) الجانب السفلي: يتم قص الشريط وإزالته كما هو موضح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: التجميع النهائي لمرحلة التبريد. أ: عجينة حرارية مطبقة على انخفاض الصفيحة النحاسية. (ب) معجون حراري يوضع على الجانب البارد من بلتيير. (ج) السطح البارد لبلتيير المتصل بالمنخفض. (د) كتلة تبريد نحاسية مثبتة على الصفيحة النحاسية باستخدام البراغي. مرحلة التبريد في قاعدة العزل. (ه) مرحلة التبريد المكتملة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: مرحلة التبريد على المجهر وقياس المزدوجة الحرارية. أ: مرحلة التبريد الموضوعة على قاعدة المجهر للتصوير. نافذة الياقوت شفافة ، مما يسمح بالإضاءة. (ب) ترمومتر مزدوج حراري يستخدم لقياس درجة حرارة سطح أجار NGM. يتم إدخال الطرف حوالي 1 مم في أجار NGM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8: توصيف مرحلة التبريد واستخدامها . (أ) صور حرارية توضح سطح الآجار المبرد إلى 1 و3 و6 درجات مئوية. توزيع متساو لدرجة الحرارة داخل المنطقة المركزية 40 مم (دائرة بيضاء متقطعة). (ب) درجة حرارة سطح أجار NGM بمرور الوقت في مرحلة التبريد عند 12 فولت. يمكن تبريد سطح أجار NGM أقل من -7 درجة مئوية. درجة الحرارة تقاس بالطريقة الموضحة في الشكل 7 ب. (ج) مرحلة التبريد المستخدمة على مجهر عمودي نموذجي. يمكن تركيب مرحلة التبريد أو إزالتها بسهولة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

	التبريد البطيء	تبريد سريع	التبريد المفاجئ
احتلال المرحلة	الحد الادني	طويل	متوسط
الوقت حتى يتم تجميد الحيوانات	طويل	متوسط	قصير جدا
قوة الشلل	قوي	متوسط	متوسط
جهد المستخدم	الحد الادني	أكثر بقليل من الحد الأدنى	الحد الاقصي

الجدول 1: مقارنة استراتيجيات التبريد.

مجموعة T (°C)	ΔT (درجة مئوية)	مجموعة V (V)
1	2	8
2	3	7.4
3	4.5	7
4	5.5	6.5
5	6	5.9
6	6	5.5

الجدول 2: المعلمات لتحقيق درجة الحرارة المطلوبة في استراتيجية التبريد السريع.

الملف التكميلي 1: صفيحة نحاسية بالمتري. رسم A2D لتصنيع الألواح النحاسية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: حامل القابضة. رسم ثلاثي الأبعاد لقوس عقد يمكن فتحه أو تعديله بواسطة Solidworks وتصديره إلى برنامج طباعة ثلاثي الأبعاد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: لوحة العزل. رسم ثلاثي الأبعاد للوحة عزل يمكن فتحها أو تعديلها بواسطة Solidworks وتصديرها إلى برنامج طباعة ثلاثي الأبعاد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيلم 1: فيديو التبريد. ديدان التثبيت على صفيحة أجار NGM عند 2 درجة مئوية. تم تبريد اللوحة من درجة حرارة الغرفة إلى 2 درجة مئوية ، وبقيت عند 2 درجة مئوية لعدة دقائق. بعد ذلك ، تم إيقاف تشغيل مرحلة التبريد وبدأت الألواح في التسخين إلى درجة حرارة الغرفة بشكل طبيعي. يتم تسريع الفيديو بمقدار 10x ليناسب فيديو 1 ساعة في 6 دقائق. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.

الجدول التكميلي 1: تقدير السعر الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

تظهر مرحلة التبريد التصنيع والتجميع والاستخدام في هذه المخطوطة. معظم المكونات هي عناصر جاهزة يمكن شراؤها عبر الإنترنت. بعض المكونات ، مثل الصفيحة النحاسية ونافذة الياقوت ، تحتاج إلى طلب مخصص وقد يستغرق تصنيعها ما يصل إلى 1 شهر. المكونات الأخرى التي يمكن طباعتها 3D يتم تصنيعها بسهولة في معظم المؤسسات البحثية (الجدول التكميلي 1). تحتاج عملية التجميع إلى عدد قليل من الأدوات ويمكن القيام بها بسرعة بواسطة غير خبير في غضون ساعات قليلة. وبالتالي ، يجب أن تكون معظم المختبرات البيولوجية قادرة على تنفيذ هذا الجهاز بسهولة.

تمتلك مرحلة التبريد ونهج تجميد التبريد العديد من التحسينات المهمة على طرق التثبيت الحالية ، مفصلة بعناية في المنشور الأصلي²⁰. باختصار ، تتيح مرحلة التبريد الشلل القوي لمجموعات كبيرة من C. elegans من جميع الأعمار ، بما في ذلك الأجنة والداور ، على لوحات الاستزراع النموذجية الخاصة بهم تحت سير عمل الفحص المجهري القياسي. إنه يلغي الحاجة إلى إعدادات الأجهزة المعقدة ، مثل الموائع الدقيقة ، مع توفير تأثير تثبيت أقوى. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يقلل من التعرض الكيميائي السام المحتمل للحيوانات والباحثين حيث لا يتم استخدام أي مواد كيميائية ، مع توفير تأثير تثبيت مماثل. تتيح هذه القدرات التقنية التطبيق الواسع لهذا الجهاز والنهج للعديد من التجارب التي تتطلب فحصا مجهريا عالي الدقة في الجسم الحي على أعداد كبيرة من الحيوانات.

هناك بعض الخطوات الحاسمة أثناء بناء الجهاز ، بما في ذلك جميع تطبيقات المعجون الحراري والشريط العريض لتثبيت نافذة الياقوت على لوحة كوبر. يضمن المعجون الحراري موصلية حرارية قوية عن طريق استبدال الفجوات بمادة مقاومة حرارية منخفضة. لتحقيق أداء التبريد المطلوب ، يجب إدخال العجينة بشكل صحيح بين جميع الأسطح المتاخمة / الملامسة ، بما في ذلك سطح بلتيير البارد إلى الصفيحة النحاسية ، وسطح بلتيير الساخن إلى كتلة التبريد النحاسية ، واللوحة النحاسية إلى نافذة الياقوت. الشريط العريض المطبق على المسرح يعزل الصفيحة النحاسية لمنع التسخين من الهواء والتكثيف ، مما يؤدي إلى الصدأ. كما أنه يقوي الاتصال بين نافذة الياقوت واللوحة النحاسية. وبالتالي ، فإن تطبيق المعجون الحراري والشريط العريض يتطلب عناية إضافية.

في تجربة تجميد التبريد الفعلية ، تعتمد المعلمات الواردة في هذه المخطوطة ، مثل الفولتية والأوقات ، على الخصائص المحددة لألواح الزراعة والمرحلة ، مثل كمية الآجار في الألواح ، وكفاءة المرحلة ، ودرجة الحرارة المحيطة والرطوبة. في التعديلات المستقبلية ، يمكن تثبيت وحدة تحكم التغذية المرتدة ، مثل مشتق التكامل النسبي (PID) ، لضبط إدخال الجهد بنشاط على مرحلة التبريد لتحقيق درجة الحرارة المطلوبة وتثبيتها.

هناك العديد من القيود على تجميد مرحلة التبريد هذه ، مفصلة بعناية في المنشور الأصلي²⁰. باختصار ، يتم تجميد الحيوانات التي يتم تربيتها في درجات حرارة مختلفة بدرجات مختلفة ، والتي قد تحتاج إلى ضبط إضافي. أيضا ، لم يتم تصميم مرحلة التبريد الحالية هذه للمجهر المقلوب. علاوة على ذلك ، قد يؤدي التصوير أو الفحص على صفيحة الزراعة مباشرة إلى تلوث اللوحة.

نحن نصمم إصدارات جديدة من مرحلة التبريد مناسبة لمنصات التصوير المختلفة ، بما في ذلك المجاهر المستقيمة المركبة والمجاهر المقلوبة. ستسمح هذه التصميمات الجديدة بتثبيت تبريد الحيوانات مباشرة على لوحات الاستزراع أثناء التصوير على هذه المنصات. سيستخدم التصوير في مراحل التبريد هذه أهداف غمر الهواء لمسافات طويلة ، على غرار التكوين الرأسي. في الوقت الحاضر ، يمكن أن يكون لأهداف الغمر في الهواء فتحة عددية تصل إلى 0.9 ، والتي توفر دقة حوالي 300 نانومتر لتصوير البروتين الفلوري الأخضر. وبالتالي ، فإن الجمع بين مرحلة التبريد الجديدة والمجهر يمكن أن يسمح بتصوير مضان بدقة دون الميكرون بشكل روتيني.

كما نقدم بعض النصائح المفيدة لاستخدام مرحلة التبريد وفقا لتجربتنا. على سبيل المثال ، يجب على الأفراد التحقق مما إذا كانت هناك أي فقاعات هواء داخل مجموعة تبريد المياه. تعمل فقاعات الهواء على تدهور التبريد إلى سطح بلتيير الساخن وبالتالي تقلل من فعالية التبريد لمرحلة التبريد. في حالة وجود فقاعات هواء ، يجب تشغيل مصدر الطاقة 12 فولت لجعل تدفق المياه واهتزاز جميع مكونات تدفق المياه. يمكن طرد فقاعات الهواء من المناطق المحاصرة وتنفيسها بواسطة خزان المضخة. يجب على الباحثين التأكد من عدم ثني أنابيب تدفق المياه أو تقاطعها عند تجميع مجموعة تبريد المياه. قد يمنع ثني الأنبوب أو عبوره التدفق الكافي للمياه ويقلل من فعالية التبريد. يجب أن تكون وصلات الأنبوب مناسبة وضيقة بشكل صحيح. إذا لزم الأمر ، يمكن استخدام أنبوب ناعم بقطر مختلف بدلا من ذلك لضمان ضيق. لا ينبغي تطبيق اللصق ، حتى لو لم يكن الاتصال ضيقا بدرجة كافية ، حيث قد يؤدي اللصق إلى انسداد أثناء الاستخدام في المستقبل. تؤثر رطوبة الغرفة على أداء التبريد وتدخل التكثيف والجليد في مرحلة التبريد. قبل وضع صفيحة الزراعة على مرحلة التبريد ، يوصى باستخدام منديل ورقي لإزالة التكثيف أو استخدام غرفة التبريد لإزالة الجليد الذي تشكل على نافذة الياقوت بسرعة. يمكن أن يتسبب خزان المضخة ومراوح المبرد في اهتزازات صغيرة في المجهر إذا كانا يعملان على نفس الطاولة. اهتزاز المجهر يطمس الصورة المكتسبة وبالتالي يجب تجنبه. يمكن استخدام وسادة لعزل الخزان والرادياتير ميكانيكيا ، أو يمكن وضعها على طاولة منفصلة قريبة. يمكن أن تصبح مرحلة التبريد مرحلة تسخين عن طريق عكس التوصيل الكهربائي إلى بلتيير.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-V power supply	ANYTITI	ledpower00	output DC 12V +/-0.5V, 5A power 60W
8-32 screw	arbitrary		for bracket fixation
bracket	N/A	N/A	3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model.
breadboard	DEYUE	7545924028	400 pin solderless board kit for DIY electric connection
copper cooling block	Kalolary	Kalolary-Heatsink001	40*40mm internal fin thickness 0.5mm
copper plate	arbitrary	N/A	Machined from a 170x120x3 mm 99.9% pure copper sheet.  See supplementary for 2D drawing for manufacturing.
digital thermocouple thermometer	Proster	4333090752	dual channel thermometer with two K-type thermocouple probes measuring range -50-300°C accuracy ±1.5% resolution 0.1°C /°F < 1000°
isolation base	N/A	N/A	3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model.
jumper wires	arbitrary		for electronic connection
multistage peltier	DigiKey	TEC1-12706	thermoelectric cooling device size 40*40*7.05 mm Umax 16.1 V  Imax 8.5 A ΔTmax @ Th 85°C @ 27°C Qmax @ Th 51.6W @ 27°C resistance 1.65 Ω
Nalgene 50 Platinum-Cured Silicone Tubing	ThermoScientific	14-176-332E	ultrasoft tube durometer hardness Shore A, 50 inner diameter 1/4 in outer diameter 9.5 mm
packaging tape	arbitrary		4 inch wide to cover the copper plate
pump tank	Yosoo	SC-300T	input power DC 12V flow rate 300L/h max
radiator	DIYhzWater	10463	12 pipe aluminum heat exchanger cooling water drain row with two 120mm fans
sapphire window	Altos Photonics, Inc.	N/A	Contact Altos for custom order size Ø 80mm, 3mm thick surface quality 60-40s/d uncoated
thermal paste	Corsair	XTM50	reduce thermal impedance between surfaces thermal conductivity 5.0W/mK
tunable power supply	Kungber	DY-SPS3010B	voltage range 0 – 30V current range 0 – 10A linear Power Supply with 4-Digits coarse and fine adjustments with alligator leads