组装和操作冷却阶段，以固定 秀丽隐杆线虫 在其培养板上

摘要

本文描述了构建和操作冷却阶段以将秀丽隐杆线虫集体固定在其原始培养板上的协议。

摘要

高分辨率体内显微镜方法可以揭示模型动物秀丽隐杆线虫（秀丽隐杆线虫）内部的微妙信息和精细细节，但需要强烈的动物固定以防止图像中的运动模糊。不幸的是，大多数当前的固定技术都需要大量的手动工作，使得高分辨率成像的通量很低。秀丽隐杆线虫的固定化通过使用冷却方法大大简化，该方法可以轻松地将整个种群直接固定在其培养板上。冷却阶段可以建立并保持广泛的温度范围，并在培养板上均匀分布。在本文中，记录了构建冷却阶段的整个过程。目的是典型的研究人员可以毫无困难地按照此协议在实验室中构建操作冷却阶段。显示了以下三种方案对冷却阶段的利用，每种方案对于不同的实验都有优势。还显示了接近最终温度的载物台冷却曲线示例，以及使用冷却固定的一些有用技巧。

引言

高分辨率光学显微镜为亚细胞水平的体内生物结构研究提供了不可或缺的工具。许多生物学研究需要亚微米分辨率成像来解析细微的解剖细节，包括神经元形态¹，²，膜结构³，⁴和蛋白质定位^5，6。高分辨率图像需要几毫秒到几秒钟的曝光时间，具体取决于成像模式和探头^7，8。为了获得最佳结果，必须仔细计划和进行基于显微镜的实验。这项工作的关键是一种有效的动物制备方法，该方法有助于高分辨率成像。

线虫秀丽隐杆线虫是一种广泛使用的模式生物，用于研究许多生物过程⁹。这种小动物通常在线虫生长培养基（NGM）琼脂平板上培养，它们通过自我受精快速繁殖，非常适合大规模研究。它们的透明度和广泛的标记技术允许直接可视化其内部解剖结构^10，11。秀丽隐杆线虫中的精细结构非常适合研究亚细胞水平的生物过程，例如神经元再生 12、神经元变性¹³ 和细胞分裂¹⁴。此类研究需要亚微米分辨率成像和足够强的动物固定以防止图像模糊。对于涉及空间或时间上的多个图像的技术，例如3D图像堆栈（即z堆栈）和延时成像，强固定化尤其重要。暴露之间的任何动物运动都会掩盖结果。对于秀丽隐杆线虫，强固定通常涉及手动操作单个动物并用麻醉剂将它们安装在载玻片^{上 15，16}。这些时间和劳动密集型程序使大规模实验变得非常困难。将动物直接和可逆地固定在其原始培养板上的固定策略可以实现高通量高分辨率成像。

秀丽隐杆线虫的冷却固定已在少数研究中显示，但并未广泛使用。它通常与微流体装置结合使用以进一步抑制动物¹⁷，^18，19。然而，微流体装置很复杂，需要大量的操作培训，并且不能轻易地与秀丽隐杆线虫实验的典型固体培养工作流程集成。因此，微流体并未广泛用于秀丽隐杆线虫固定化。这里结合Chung实验室最近的出版物²⁰，引入了一种新的冷却固定方法，使用热电冷却阶段（图1）来解决这些缺点。通过冷却阶段，典型的60 mm聚苯乙烯培养板可以冷却到-8°C至室温之间的任何目标温度（T_组）。这种冷却阶段方法可以以最少的用户工作量轻松且可逆地固定整个动物种群，从而消除了98%的动物处理时间²⁰。

下面描述了从头开始构建冷却阶段的过程。除了零件加工和3D打印外，整个过程预计需要4小时，无需特殊工具或专业知识。然后，进一步描述了三种不同的冷却策略，这些策略具有不同的冷却速率和用户在典型的正置显微镜上固定秀 丽隐杆线虫 的努力。首选策略可能取决于用户应用程序。详细描述了这三种冷却固定策略的协议。

研究方案

1. 制造和准备冷却阶段的每个组件

注意：冷却阶段由几个组件组成（参见 材料表）。大多数组件都是现成的。蓝宝石窗口需要定制订单，而铜板、固定支架和隔离板可以用计算机数控磨或 3D 打印机在现场制造。初始制造后，后期组装过程大约需要 2-3 小时。

1. 使用计算机数控铣床从 170 mm x 120 mm x 3 mm、99.9% 纯铜金属板加工铜板（图 2A）。此制造的 2D 图纸在 补充文件 1 中提供。使用细砂纸去除任何锋利的边缘和脏污的残留物。
2. 要制造固定支架和隔离板，请使用 3D 打印机和直径为 1.75 毫米的聚乳酸 （PLA） 灯丝（图 2B，C）。为了获得更好的质量，3D打印机应提供小于0.2毫米的层高.3D模型在 补充文件2 和 补充文件3中提供。

2. 构建水冷组件

1. 准备铂固化硅胶管、泵箱、铜冷却块和散热器（图 3A），用于构建水冷组件。准备剃须刀片、剪刀和六角扳手以备使用。请注意由于在整个组装过程中用水而导致的电气危险。
2. 将硅胶管切成三部分，建议长度为 40 厘米、50 厘米和 80 厘米。需要时调整长度。
3. 将步骤 2.2 中的硅胶管部分插入散热器、泵箱和铜冷却块的端口，如图 3B 所示。确保所有连接都防水。水冷组件现已建成。
4. 准备水冷组件、12 V 电源、三根红色和三根黑色跳线、一块面包板和 500 mL 纯净水。
5. 确保工作台不含液体以确保电气安全。
6. 通过试验板将泵箱和散热器的电线连接到 12 V 电源（图 3C）。面包板的使用是为了方便起见。
   注意：为了获得更持久和安全的连接，研究人员可以用焊丝代替试验板。
7. 使用平头螺丝刀打开泵箱盖。使用漏斗加水，直到泵箱装满约 80%（图 3D）。加注后不要盖上泵箱的盖子。
8. 通过插入 12 V 电源或将其打开（如果存在开关）来为水冷组件供电。通电后，水将流到组件内部，散热器上的风扇应该会吹。
9. 由于泵箱的水流，水箱中的液位会下降。向泵箱中加入更多水，直到其稳定在接近 2/3 满（图 3E）。
10. 摇晃散热器以清除气泡，然后盖上冷却水箱。
11. 在转到下一步之前关闭电源。

3. 测试帕尔贴冷热表面

注意：帕尔贴是冷却阶段的关键部件，是一种固态主动热泵，可将热量从一侧传递到另一侧²¹。帕尔贴的一个表面在提供电力时变热，另一个表面变冷。默认情况下，帕尔贴制造商在销售前标记冷表面，但在组装前手动测试它仍然很有帮助。

1. 准备可调电源和帕尔贴，如图 4A所示。
2. 确保可调电源已关闭，以防止可能的电气危险。
3. 将帕尔贴的红线连接到正输出，将黑线连接到可调电源的负输出，带有随电源提供的鳄鱼夹（图 4B）。
4. 打开可调谐电源，并通过调制电源顶排的电压和电流旋钮将其设置为 2 V 左右。立即用裸露的手指感受珀尔贴的两个表面。一个表面在几秒钟内变冷。
5. 确定哪个表面是冷的后，立即关闭电源并断开帕尔贴的连接。
6. 使用记号笔指示冷表面以供将来组装。

4. 构建组件以使用水冷组件冷却帕尔贴组件

1. 如图 4A 所示，准备关闭的水冷组件、帕尔贴（冷表面标记）和导热膏（用于改善导热）。
2. 在水冷组件中用 70% 乙醇（或其他清洁溶液）清洁铜冷却块的所有表面。
3. 在铜水冷块的一个表面上涂抹约0.4克导热膏，并确保该表面方向将防止管子在朝下时交叉或弯曲。使用手套保护皮肤，并尝试将导热膏薄而均匀地分布（图4C）。
4. 同样，清洁帕尔贴的热表面，然后将导热膏涂在表面上（图 4D）。
5. 用导热膏将帕尔贴热表面连接到铜冷却块表面。施加压力以确保其安全。沿着帕尔贴上的电线和铜冷却块的管子的方向，如图 4E所示。清洁多余的导热膏。
6. 保持 12 V 电源和可调谐电源关闭。将帕尔贴连接到可调电源，如第 3 节所示。
7. 重新检查电气和水冷组件连接，然后依次打开 12 V 电源和可调电源。
8. 逐渐将可调电源调至 12 V。使用建议的帕尔贴，电流应在 7.3 A 左右。
9. 等待2分钟;帕尔贴冷表面的温度应低于 -35 °C。 用红外温度计测量该温度（图4F）。请勿触摸冰冷的表面，以免伤到手。
10. 检查所有连接和组件，如果温度不能低于-30°C。 水冷组件内部的气泡可能是冷却性能欠佳的原因。
11. 为确保后续步骤的安全，请关闭可调电源，等待 1 分钟，然后关闭 12 V 电源。

5. 铜板和蓝宝石窗口组件的构造

1. 准备铜板、直径为 80 毫米的蓝宝石窗口、导热膏、4 英寸宽的胶带和用于切割的锋利刀片（图 5A）。
2. 用 70% 乙醇仔细清洁铜板和蓝宝石窗口，并使用细砂纸平滑粗糙表面。
3. 将导热膏涂在三个内表面上，如图 5B所示。确保导热膏覆盖所有三个表面积，但不要太厚，大约 0.5 毫米。
4. 将铜板放在用打印纸保护的台面上。纸张使以后的清理更容易。
5. 将蓝宝石窗口插入铜板孔（图5C）。确保蓝宝石在插入过程中不会旋转，以防止导热膏移动到其他区域。去除多余的导热膏。
6. 将 4 英寸宽的胶带粘附到铜板蓝宝石窗口组件的顶表面上（具有方形凹陷区域的表面，如图 5D 所示）。在粘贴过程中，通过将粘合从一侧缓慢引导到另一侧，避免胶带和铜表面之间出现气泡。
7. 使用锋利的刀片切出磁带的指定蓝色虚线区域，如图 5E所示。切割露出两个螺纹孔、方形凹陷和蓝宝石窗口的 70 毫米直径区域。
8. 用胶带粘住铜板-蓝宝石窗口组件的底面，然后在此表面上重复切割过程（仅限蓝宝石区域），如图 5F 所示。
   注意：现在，蓝宝石窗口固定在铜板上，铜表面防锈。

6. 冷却阶段最终组装

1. 确保所有必要的子组件和组件准备就绪。
2. 将约0.4g导热膏涂在铜板的方形凹陷处（图6A）。
3. 将约 0.4 克导热膏涂抹在帕尔贴的冷表面上。请注意，帕尔贴已经连接到铜冷却块（图 6B）。
4. 将珀尔贴冷表面向下压力连接到铜板凹陷处。清洁所有多余的导热膏（图6C）。
5. 将 3D 打印支架安装在铜冷却块的顶部，然后使用六角扳手拧紧两个 8-32、0.5 英寸长的螺钉，将支架固定到铜板上（图 6D）。使用低扭矩拧紧，使印刷支架不会断裂或变形，以确保从帕尔贴到铜的正常热传导。
6. 将铜板放入3D打印的隔离底座中，以便在操作过程中与台式或显微镜底座进行热隔离（图6D）。
7. 冷却阶段已组装好并准备使用（图6E）。
8. 对于显微镜，将完成的冷却台放在正置显微镜平台上（图7A）。
9. 冷却阶段的组装完成。更多细节可从钟实验室的配套出版物中获得，该出版物充分描述了详细的策略和动物运动²⁰。

注意：在以下部分中，将讨论慢速、快速和突然冷却协议。L4或年轻成年的N2雌雄同体用于产生以下数据。缓慢冷却策略可用于在6°C下固定20°C培养的N 2动物;15°C培养的N2动物在1°^C20下最强烈地固定。这三种冷却方案之间的简要比较如 表1所示。

7. 缓慢冷却固定方案

1. 将带盖的培养板移至4°C冰箱中。
2. 将培养板移至冰箱后，打开冷却阶段的 12 V 电源并将可调电源电压设置为 5.5 V。
3. 盖上盖的培养板在4°C冰箱中停留1小时后，立即将板转移到冷却阶段并取下盖子（图7A）。这种培养板通常在6°C左右。 预冷阶段稳定且足够冷，可将琼脂表面保持在6°C。
4. 如果琼脂表面温度发生变化，如测量或注意动物运动，稍微调整电压，直到稳定在6°C。
5. 动物在转移时被适当地固定。

8. 快速冷却固定方案

注意：快速冷却策略是最基本的固定方法（见视频1）;然而，琼脂平板在到达T_组时长时间闲置占据载物台。此外，当需要强固定并且T_组 为6°C时，空闲时间延长至约1h²⁰。

1. 打开冷却阶段的 12 V 电源，并将可调电源电压设置为 12 V 左右，等待 10 分钟。
2. 将培养板从培养箱直接带到冷却阶段并取下盖子。
3. 一旦琼脂表面温度降至（T_组+ ΔT）°C，将可调谐电源调节至V组，并等待琼脂达到T_组。V组是将琼脂稳定在T_组的适当电压。ΔT 是防止过冷的变量。有关 T_集、ΔT 和 V_组的组合，请参见表 2。
   注意： 表2 中提供的数据专门与Chung实验室有关，因此应该注意的是，实验参数可能会根据每个实验的独特环境和使用条件而有所不同。
4. 当琼脂达到T_组时，动物被固定。固定性随着时间的推移而改善，直到冷却开始后~50分钟。

9. 突然冷却固定方案

注意：突然冷却策略消耗的用户时间最多，但动物从培养温度中固定的速度最快。

1. 打开冷却级的 12 V 电源，并将可调电源电压调至 12 V 左右，保持 10 分钟。
2. 将未占用的琼脂平板带到冷却阶段。使用快速冷却固定方案中的步骤8.3将琼脂表面温度稳定在T_组。
3. 将动物从原来的培养盘移到冷却台上的冷却盘。
4. 根据小动物的大小，预计动物会在几秒钟内冷却到T_设置 并固定。固定性随着时间的推移而改善，直到冷却开始后~50分钟。

10.冷却固定后动物的复活

1. 将冷却的培养板移回原始培养箱或室温。
2. 等待20分钟至1小时，直到盘子上的所有蠕虫恢复到正常的爬行和进食行为。

讨论

冷却阶段的制造、组装和使用在本手稿中显示。大多数组件都是可以在线购买的现成物品。一些组件，如铜板和蓝宝石窗口，需要定制订单，可能需要长达 1 个月的时间来制造。其他可以3D打印的组件在大多数研究机构中很容易制造（补充表1）。组装过程只需要几个工具，非专家可以在几个小时内快速完成。因此，大多数生物实验室应该能够轻松实现该设备。

冷却阶段和冷却固定方法与现有的固定方法相比具有几个显着的改进，在原始出版物²⁰中仔细详细说明。简而言之，冷却阶段能够在标准显微镜工作流程下将包括胚胎和道尔在内的所有年龄段的 大量秀丽隐杆线虫 强力固定在其典型培养板上。它消除了对复杂硬件设置（如微流体）的需求，同时提供了更强的固定效果。此外，由于不使用化学品，它最大限度地减少了对动物和研究人员可能的有毒化学物质暴露，同时提供类似的固定效果。这些技术能力使该设备和方法能够广泛应用于许多需要对大量动物进行高分辨率 体内 显微镜的实验。

在构建设备的过程中有一些关键步骤，包括所有导热膏应用和将蓝宝石窗口固定到铜板上的宽胶带。导热膏通过用低热阻材料代替间隙来确保强大的导热性。为了达到所需的冷却性能，需要在所有相邻/接触表面之间正确引入浆料，包括帕尔贴冷表面到铜板，帕尔贴热表面到铜冷却块，铜板到蓝宝石窗口。应用于舞台的宽胶带隔离铜板，以防止空气加热和冷凝，从而导致生锈。它还加强了蓝宝石窗口和铜板之间的联系。因此，使用导热膏和宽胶带都需要格外小心。

在实际的冷却固定实验中，本手稿中提供的参数（例如电压和时间）取决于培养板和阶段的特定特性，例如平板中琼脂的量，阶段的效率以及环境温度和湿度。在未来的修改中，可以安装一个反馈控制器，如比例积分微分（PID），以主动调节冷却阶段的电压输入，以达到所需的温度并使其稳定。

这种冷却阶段固定有几个局限性，在原始出版物²⁰中仔细详细说明。简而言之，在不同温度下饲养的动物被固定到不同程度，这可能需要额外的微调。此外，目前的冷却阶段不是为倒置显微镜设计的。此外，直接在培养板上成像或筛选可能会将污染引入培养盘。

我们正在设计适用于不同成像平台的新版本冷却台，包括复合正置显微镜和倒置显微镜。这些新设计将允许在这些平台上成像期间直接将动物冷却固定在培养板上。这些冷却阶段的成像将使用长工作距离的空气浸没物镜，类似于直立配置。如今，空气浸没物镜的数值孔径可达0.9，可为绿色荧光蛋白成像提供约300 nm的分辨率。因此，新的冷却台与显微镜的结合可以常规地进行亚微米分辨率的荧光成像。

我们还根据我们的经验提供了一些使用冷却阶段的有用提示。例如，个人应检查水冷组件内是否有气泡。气泡会降低帕尔贴热表面的冷却效果，从而降低冷却阶段的冷却效果。如果存在气泡，应打开 12 V 电源以使水流动，并且应摇动水流的所有组件。气泡可以从被困区域冲洗出来，并由泵箱排出。研究人员在组装水冷组件时应确保水流管不弯曲或交叉。弯管或交叉可能会阻止足够的水流并降低冷却效率。管连接应正确贴合和紧密。如有必要，可以使用不同直径的软管来代替以确保密封性。即使连接不够紧密，也不应使用糊剂，因为膏体可能会在将来的使用中引入堵塞。室内湿度会影响冷却性能，并在冷却阶段引入冷凝和结冰。在将培养板放在冷却台上之前，建议使用纸巾去除冷凝或使用散热器快速去除蓝宝石窗口上形成的冰。如果泵箱和散热器风扇在同一台上工作，它们可能会在显微镜中引起小振动。显微镜振动会使采集到的图像模糊，因此应避免。垫子可用于机械绝缘水箱和散热器，也可以将它们放在附近的单独桌子上。冷却阶段可以通过反转与帕尔贴的电气连接而成为加热阶段。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-V power supply	ANYTITI	ledpower00	output DC 12V +/-0.5V, 5A power 60W
8-32 screw	arbitrary		for bracket fixation
bracket	N/A	N/A	3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model.
breadboard	DEYUE	7545924028	400 pin solderless board kit for DIY electric connection
copper cooling block	Kalolary	Kalolary-Heatsink001	40*40mm internal fin thickness 0.5mm
copper plate	arbitrary	N/A	Machined from a 170x120x3 mm 99.9% pure copper sheet.  See supplementary for 2D drawing for manufacturing.
digital thermocouple thermometer	Proster	4333090752	dual channel thermometer with two K-type thermocouple probes measuring range -50-300°C accuracy ±1.5% resolution 0.1°C /°F < 1000°
isolation base	N/A	N/A	3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model.
jumper wires	arbitrary		for electronic connection
multistage peltier	DigiKey	TEC1-12706	thermoelectric cooling device size 40*40*7.05 mm Umax 16.1 V  Imax 8.5 A ΔTmax @ Th 85°C @ 27°C Qmax @ Th 51.6W @ 27°C resistance 1.65 Ω
Nalgene 50 Platinum-Cured Silicone Tubing	ThermoScientific	14-176-332E	ultrasoft tube durometer hardness Shore A, 50 inner diameter 1/4 in outer diameter 9.5 mm
packaging tape	arbitrary		4 inch wide to cover the copper plate
pump tank	Yosoo	SC-300T	input power DC 12V flow rate 300L/h max
radiator	DIYhzWater	10463	12 pipe aluminum heat exchanger cooling water drain row with two 120mm fans
sapphire window	Altos Photonics, Inc.	N/A	Contact Altos for custom order size Ø 80mm, 3mm thick surface quality 60-40s/d uncoated
thermal paste	Corsair	XTM50	reduce thermal impedance between surfaces thermal conductivity 5.0W/mK
tunable power supply	Kungber	DY-SPS3010B	voltage range 0 – 30V current range 0 – 10A linear Power Supply with 4-Digits coarse and fine adjustments with alligator leads