Montaje y operación de una etapa de enfriamiento para inmovilizar C. elegans en sus placas de cultivo

Resumen

Este documento describe los protocolos para construir y operar una etapa de enfriamiento para inmovilizar C. elegans en sus placas de cultivo originales en masa.

Resumen

Los enfoques de microscopía in vivo de alta resolución pueden revelar información sutil y detalles finos dentro del animal modelo Caenorhabditis elegans (C. elegans), pero requieren una fuerte inmovilización animal para evitar el desenfoque de movimiento en las imágenes. Desafortunadamente, la mayoría de las técnicas de inmovilización actuales requieren un esfuerzo manual sustancial, lo que hace que las imágenes de alta resolución tengan un rendimiento bajo. La inmovilización de C. elegans se simplifica enormemente mediante el uso de un enfoque de enfriamiento que puede inmovilizar fácilmente poblaciones enteras directamente en sus placas de cultivo. La etapa de enfriamiento puede establecer y mantener un amplio rango de temperaturas con una distribución uniforme en la placa de cultivo. En este artículo, se documenta todo el proceso de construcción de la etapa de enfriamiento. El objetivo es que un investigador típico pueda construir una etapa de enfriamiento operacional en su laboratorio siguiendo este protocolo sin dificultad. Se muestra la utilización de la etapa de enfriamiento siguiendo tres protocolos, y cada protocolo tiene ventajas para diferentes experimentos. También se muestra un ejemplo de perfil de enfriamiento de la etapa a medida que se acerca a su temperatura final y algunos consejos útiles para usar la inmovilización de enfriamiento.

Introducción

La microscopía óptica de alta resolución proporciona una herramienta indispensable para estudiar las estructuras biológicas in vivo a nivel subcelular. Muchos estudios biológicos requieren imágenes de resolución submicrónica para resolver detalles anatómicos sutiles, incluida la morfología neuronal^1,2, la estructura de la membrana^3,4 y la localización de proteínas ^5,6. Una imagen de alta resolución requiere un tiempo de exposición de varios milisegundos a segundos, dependiendo de la modalidad de imagen y la sonda ^7,8. Para lograr resultados óptimos, es esencial planificar y realizar cuidadosamente experimentos basados en microscopía. Crucial para este esfuerzo es un método eficiente de preparación de animales que facilite las imágenes de alta resolución.

El nematodo C. elegans es un organismo modelo ampliamente utilizado para estudiar muchos procesos biológicos⁹. Este pequeño animal se cultiva típicamente en placas de agar del medio de crecimiento de nematodos (NGM), y se reproducen rápidamente por autofertilización, lo que los hace adecuados para estudios a gran escala. Su transparencia y una amplia gama de técnicas de etiquetado permiten la visualización directa de su anatomía interna^10,11. Las estructuras finas en C. elegans son ideales para estudiar procesos biológicos a nivel subcelular, como la regeneración neuronal 12, la degeneración neuronal¹³ y la división celular¹⁴. Tales estudios requieren imágenes a resolución submicrónica e inmovilización de animales lo suficientemente fuerte como para evitar el desenfoque de la imagen. La inmovilización fuerte es especialmente crucial para las técnicas que involucran múltiples imágenes en el espacio o el tiempo, como las pilas de imágenes 3D (es decir, pilas z) y las imágenes de lapso de tiempo. Cualquier movimiento animal entre las exposiciones puede oscurecer el resultado. Para C. elegans, la inmovilización fuerte típicamente implica la manipulación manual de animales individuales y montarlos en portaobjetos con un anestésico^15,16. Estos procedimientos que requieren mucho tiempo y mano de obra hacen que los experimentos a gran escala sean muy difíciles. Una estrategia de inmovilización en la que los animales se inmovilizan directa y reversiblemente en sus placas de cultivo originales podría permitir imágenes de alta resolución de alto rendimiento.

La inmovilización por enfriamiento de C. elegans se ha demostrado en algunos estudios, pero no se utiliza ampliamente. Por lo general, se combina con un dispositivo microfluídico para restringir aún más a los animales^17,18,19. Sin embargo, los dispositivos microfluídicos son complejos, requieren una capacitación operativa significativa y no se pueden integrar fácilmente con los flujos de trabajo de cultivo de sólidos típicos de los experimentos de C. elegans. Por lo tanto, los microfluídicos no se utilizan ampliamente para la inmovilización de C. elegans. Aquí, junto con la reciente publicación²⁰ del Laboratorio Chung, se presenta la introducción de un nuevo enfoque de inmovilización por enfriamiento utilizando una etapa de enfriamiento termoeléctrico (Figura 1) para abordar estas deficiencias. Con la etapa de enfriamiento, una placa de cultivo de poliestireno típica de 60 mm se puede enfriar a cualquier temperatura objetivo (_conjunto T) entre -8 ° C a temperatura ambiente. Este enfoque de etapa de enfriamiento puede inmovilizar fácil y reversiblemente a toda una población animal con un mínimo esfuerzo del usuario, eliminando el 98% del tiempo de procesamiento animal²⁰.

A continuación, se describen los procedimientos para construir una etapa de enfriamiento desde cero. A excepción del mecanizado de piezas y la impresión 3D, se espera que todo el procedimiento tome 4 horas sin el requisito de herramientas especiales o experiencia. Luego, se describen tres estrategias de enfriamiento diferentes con diferentes velocidades de enfriamiento y los esfuerzos del usuario para inmovilizar C. elegans en un microscopio vertical típico. La estrategia preferida puede depender de la aplicación del usuario. Los protocolos para esas tres estrategias de inmovilización por enfriamiento se describen en detalle.

Protocolo

1. Fabricación y preparación de cada componente de la etapa de enfriamiento

NOTA: La etapa de enfriamiento comprende varios componentes (consulte la Tabla de materiales). La mayoría de los componentes están listos para usar. La ventana de zafiro requiere un pedido personalizado, mientras que la placa de cobre, el soporte de sujeción y la placa de aislamiento se pueden fabricar in situ con un molino de control numérico por computadora o una impresora 3D. Después de la fabricación inicial, el proceso de montaje posterior toma alrededor de 2-3 h.

1. Utilice un molino de control numérico computarizado para mecanizar la placa de cobre a partir de una lámina de cobre puro de 170 mm x 120 mm x 3 mm, 99,9% (Figura 2A). El dibujo 2D para esta fabricación se proporciona en el Archivo Suplementario 1. Use papel de lija de grano fino para eliminar los bordes afilados y los residuos sucios.
2. Para fabricar el soporte de sujeción y la placa de aislamiento, utilice una impresora 3D y un filamento de ácido poliláctico (PLA) de 1,75 mm de diámetro (Figura 2B, C). Para una mejor calidad, la impresora 3D debe proporcionar una altura de capa superior a 0,2 mm.3D los modelos se proporcionan en el Archivo complementario 2 y el Archivo complementario 3.

2. Construcción del conjunto de refrigeración por agua

1. Prepare el tubo de silicona curado con platino, el tanque de la bomba, el bloque de enfriamiento de cobre y el radiador (Figura 3A) para construir el conjunto de enfriamiento por agua. Prepare una hoja de afeitar, tijeras y una llave hexagonal lista para usar. Tenga en cuenta los peligros eléctricos debidos al uso de agua durante el montaje.
2. Corte el tubo de silicona en tres secciones con longitudes sugeridas de 40 cm, 50 cm y 80 cm. Ajuste la longitud cuando sea necesario.
3. Enchufe las secciones del tubo de silicona del paso 2.2 en los puertos del radiador, el tanque de la bomba y el bloque de enfriamiento de cobre, como se muestra en la Figura 3B. Asegúrese de que todas las conexiones sean herméticas. El conjunto de refrigeración por agua ya está construido.
4. Prepare el conjunto de refrigeración por agua, una fuente de alimentación de 12 V, tres cables de puente rojos y tres negros, una placa de pruebas y 500 ml de agua purificada.
5. Asegúrese de que el banco de trabajo esté libre de líquido para la seguridad eléctrica.
6. Conecte los tanques de la bomba y los cables del radiador a la fuente de alimentación de 12 V a través de la placa de pruebas (Figura 3C). La placa de pruebas se utiliza para mayor comodidad.
   NOTA: Para una conexión más permanente y segura, los investigadores pueden reemplazar la placa de pruebas con cables de soldadura.
7. Abra la tapa del tanque de la bomba con un destornillador de cabeza plana. Use un embudo para agregar agua hasta que el tanque de la bomba esté lleno en un 80% (Figura 3D). No tape el tanque de la bomba después de este llenado.
8. Encienda el conjunto de refrigeración por agua enchufando la fuente de alimentación de 12 V o encendiéndolo (si hay un interruptor). Después de encender, el agua fluirá dentro del conjunto y los ventiladores del radiador deberían soplar.
9. Debido al flujo de agua del tanque de la bomba, el nivel de líquido en el tanque disminuirá. Agregue más agua al tanque de la bomba hasta que se estabilice a casi 2/3 de su capacidad (Figura 3E).
10. Agite el radiador para deshacerse de las burbujas de aire y luego tape el tanque de enfriamiento.
11. Apague la fuente de alimentación antes de pasar al siguiente paso.

3. Prueba de superficies frías y calientes Peltier

NOTA: La Peltier, un componente clave de la etapa de enfriamiento, es una bomba de calor activa de estado sólido que transfiere calor de un lado al otro²¹. Una superficie del Peltier se calienta y la otra superficie se enfría cuando se proporciona energía eléctrica. De forma predeterminada, los fabricantes de Peltier marcan la superficie fría antes de venderla, pero aún así es útil probarla manualmente antes de ensamblarla.

1. Prepare la fuente de alimentación sintonizable y el Peltier, como se muestra en la figura 4A.
2. Asegúrese de que la fuente de alimentación sintonizable esté apagada para evitar posibles riesgos eléctricos.
3. Conecte el cable rojo del Peltier a la salida positiva y el cable negro a la salida negativa de la fuente de alimentación sintonizable con pinzas de cocodrilo, que se proporcionan con la fuente de alimentación (Figura 4B).
4. Encienda la fuente de alimentación sintonizable y configúrela en alrededor de 2 V modulando las perillas de voltaje y corriente en la fila superior de la fuente de alimentación. Inmediatamente use un dedo desnudo para sentir las dos superficies del Peltier. Una superficie se enfría en pocos segundos.
5. Después de identificar qué superficie está fría, apague inmediatamente la fuente de alimentación y desconecte el Peltier.
6. Utilice un marcador para indicar la superficie fría para el montaje futuro.

4. Construcción del conjunto para enfriar el Peltier utilizando un conjunto de refrigeración por agua

1. Como se muestra en la Figura 4A, prepare el conjunto de refrigeración por agua apagado, el Peltier (marcado con superficie fría) y la pasta térmica (para mejorar la conducción térmica).
2. Limpie todas las superficies del bloque de enfriamiento de cobre con etanol al 70% (u otra solución más limpia) en el conjunto de enfriamiento por agua.
3. Aplique alrededor de 0,4 g de pasta térmica a una superficie del bloque de refrigeración por agua de cobre y asegúrese de que esta orientación de la superficie evitará que los tubos se crucen o se doblen cuando miren hacia abajo. Use un guante para proteger la piel y trate de distribuir la pasta térmica de manera fina y uniforme (Figura 4C).
4. Del mismo modo, limpie la superficie caliente del Peltier, luego aplique la pasta térmica a la superficie (Figura 4D).
5. Conecte la superficie caliente Peltier a la superficie del bloque de enfriamiento de cobre con pasta térmica. Aplique presión para asegurarse de que sea seguro. Siga la orientación de los cables en el Peltier y los tubos del bloque de enfriamiento de cobre, como se muestra en la Figura 4E. Limpie el exceso de pasta térmica.
6. Mantenga apagadas tanto la fuente de alimentación de 12 V como la fuente de alimentación sintonizable. Conecte el Peltier a la fuente de alimentación sintonizable, como se indica en la sección 3.
7. Vuelva a comprobar las conexiones del conjunto eléctrico y de refrigeración por agua y, a continuación, encienda la fuente de alimentación de 12 V y la fuente de alimentación sintonizable secuencialmente.
8. Gire gradualmente la fuente de alimentación sintonizable a 12 V. Con el Peltier sugerido, la corriente debería ser de alrededor de 7.3 A.
9. Espere 2 minutos; la temperatura de la superficie fría de Peltier debe ser más fría que -35 °C. Mida esta temperatura con un termómetro infrarrojo (Figura 4F). No toque la superficie fría para evitar lesiones en las manos.
10. Compruebe todas las conexiones y componentes si la temperatura no puede alcanzar menos de -30 °C. Las burbujas de aire dentro del conjunto de refrigeración por agua son una posible razón para un rendimiento de refrigeración subóptimo.
11. Para garantizar la seguridad en pasos posteriores, apague la fuente de alimentación ajustable, espere 1 minuto y, a continuación, apague la fuente de alimentación de 12 V.

5. Construcción de placa de cobre y conjunto de ventanas de zafiro

1. Prepare la placa de cobre, la ventana de zafiro de 80 mm de diámetro, la pasta térmica, una cinta de 4 pulgadas de ancho y una cuchilla afilada para cortar (Figura 5A).
2. Limpie cuidadosamente la placa de cobre y la ventana de zafiro con etanol al 70% y use papel de lija de grano fino para alisar superficies rugosas.
3. Aplique la pasta térmica en tres superficies internas, como se muestra en la Figura 5B. Asegúrese de que la pasta térmica cubra las tres áreas de superficie, pero no sea demasiado gruesa, alrededor de 0,5 mm.
4. Coloque la placa de cobre sobre la mesa protegida con papel de impresora. El papel facilita la limpieza posterior.
5. Inserte la ventana de zafiro en el orificio de la placa de cobre (Figura 5C). Asegúrese de que el zafiro no gire durante la inserción para evitar que la pasta térmica se mueva a otras áreas. Retire el exceso de pasta térmica.
6. Adhiera la cinta de 4 pulgadas de ancho a la superficie superior del conjunto de ventana de zafiro de placa de cobre (la superficie que tiene el área de depresión cuadrada, como se muestra en la Figura 5D). Evite las burbujas de aire entre la cinta y las superficies de cobre durante el pegado guiando la adhesión lentamente de un lado a otro.
7. Recorte las áreas discontinuas azules especificadas de la cinta con una cuchilla afilada, siguiendo la Figura 5E. El corte expone los dos orificios de rosca, la depresión cuadrada y el área de 70 mm de diámetro de la ventana de zafiro.
8. Pegue con cinta adhesiva la superficie inferior del conjunto de ventana de zafiro y placa de cobre y luego repita el procedimiento de corte (solo área de zafiro) en esta superficie, como se muestra en la Figura 5F.
   NOTA: Ahora, la ventana de zafiro está fijada a la placa de cobre y las superficies de cobre están protegidas del óxido.

6. Montaje final de la etapa de enfriamiento

1. Asegúrese de que todos los subconjuntos y componentes esenciales estén listos.
2. Aplique aproximadamente 0,4 g de pasta térmica a la depresión cuadrada de la placa de cobre (Figura 6A).
3. Aplique aproximadamente 0,4 g de pasta térmica sobre la superficie fría del Peltier. Tenga en cuenta que el Peltier ya está conectado al bloque de enfriamiento de cobre (Figura 6B).
4. Conecte la superficie fría Peltier a la depresión de la placa de cobre con presión descendente. Limpie todo el exceso de pasta térmica (Figura 6C).
5. Monte el soporte impreso en 3D en la parte superior del bloque de enfriamiento de cobre y luego use una llave hexagonal para apretar dos tornillos de 8-32 pulgadas de largo de 0.5 pulgadas para fijar el soporte a la placa de cobre (Figura 6D). Utilice un apriete de par bajo para que el soporte impreso no se rompa o se deforme para garantizar una conducción térmica adecuada desde el Peltier hasta el cobre.
6. Coloque la placa de cobre en la base de aislamiento impresa en 3D para el aislamiento térmico de la base de sobremesa o microscopio durante la operación (Figura 6D).
7. La etapa de enfriamiento está ensamblada y lista para usar (Figura 6E).
8. Para la microscopía, coloque la etapa de enfriamiento completa en una plataforma de microscopio vertical (Figura 7A).
9. Se completa el montaje de la etapa de enfriamiento. Más detalles están disponibles en la publicación complementaria del Laboratorio Chung, que caracteriza completamente las estrategias detalladas y el movimiento de animales²⁰.

NOTA: En las siguientes secciones, se describen los protocolos de enfriamiento lento, rápido y abrupto. Se utilizaron hermafroditas N2 a la edad de L4 o adultos jóvenes para producir los siguientes datos. La estrategia de enfriamiento lento es útil para inmovilizar 20 °C animales cultivados N2 a 6 °C; Los animales N2 cultivados a 15 °C se inmovilizan más fuertemente a 1 °C²⁰. Una breve comparación entre estos tres protocolos de enfriamiento se muestra en la Tabla 1.

7. Protocolo de inmovilización de enfriamiento lento

1. Mover la placa de cultivo con tapa a una nevera a 4 °C.
2. Después de mover la placa de cultivo al refrigerador, encienda la fuente de alimentación de 12 V de la etapa de enfriamiento y ajuste el voltaje de la fuente de alimentación sintonizable a 5.5 V.
3. Después de que la placa de cultivo con tapa haya permanecido en el refrigerador a 4 °C durante 1 h, transfiera la placa inmediatamente a la etapa de enfriamiento y retire la tapa (Figura 7A). Tales placas de cultivo suelen estar alrededor de 6 ° C. La etapa preenfriada es lo suficientemente estable y fría como para mantener la superficie del agar a 6 °C.
4. Si la temperatura de la superficie del agar cambia, medida o observando el movimiento del animal, ajuste ligeramente el voltaje hasta que se estabilice a 6 °C.
5. Los animales están debidamente inmovilizados en el momento de la transferencia.

8. Protocolo de inmovilización de enfriamiento rápido

NOTA: La estrategia de enfriamiento rápido es el método de inmovilización más básico (ver Película 1); sin embargo, las placas de agar ocupan ociosamente el escenario durante un tiempo prolongado mientras alcanzan el_conjunto T. Además, cuando se necesita una inmovilización fuerte y el_conjunto T es de 6 ° C, el tiempo de inactividad se extiende a alrededor de 1 h²⁰.

1. Encienda la fuente de alimentación de 12 V de la etapa de refrigeración y ajuste el voltaje de la fuente de alimentación sintonizable a alrededor de 12 V. Espere 10 min.
2. Lleve una placa de cultivo de su incubadora directamente a la etapa de enfriamiento y retire la tapa.
3. Una vez que la temperatura de la superficie del agar disminuya a (conjunto T + ΔT) °C, ajuste la fuente de alimentación sintonizable al conjunto V y espere hasta que el_agar alcance el_{conjunto T.} El conjunto V es el voltaje apropiado para estabilizar el agar en el_conjunto T. El ΔT es una variable que evita el sobreenfriamiento. Ver Tabla 2 para la combinación de_conjunto T, ΔT_{y conjunto V}.
   NOTA: Los datos presentados en la Tabla 2 se refieren específicamente al Laboratorio Chung y, por lo tanto, debe tenerse en cuenta que los parámetros experimentales pueden variar según las condiciones ambientales y de uso únicas de cada experimento individual.
4. Los animales son inmovilizados cuando el agar alcanza el_conjunto T. La inmovilización mejora con el tiempo hasta ~ 50 minutos después del inicio del enfriamiento.

9. Protocolo de inmovilización por enfriamiento brusco

NOTA: La estrategia de enfriamiento abrupto consume la mayor parte del tiempo del usuario, pero inmoviliza a los animales más rápidamente de su temperatura de cultivo.

1. Encienda la fuente de alimentación de 12 V de la etapa de enfriamiento y gire el voltaje de la fuente de alimentación sintonizable a alrededor de 12 V. Mantener durante 10 min.
2. Lleve una placa de agar desocupada a la etapa de enfriamiento. Utilice el paso 8.3 del protocolo de inmovilización de enfriamiento rápido para estabilizar la temperatura de la superficie del agar en_{el conjunto} T.
3. Mueva a los animales de su placa de cultivo original a la placa enfriada que se encuentra en la etapa de enfriamiento.
4. Según el pequeño tamaño del animal, se espera que los animales se enfríen a T_en segundos y sean inmovilizados. La inmovilización mejora con el tiempo hasta ~ 50 minutos después del inicio del enfriamiento.

10. Reactivación de los animales después de la inmovilización por enfriamiento

1. Mueva la placa de cultivo enfriada de nuevo a la incubadora original o a temperatura ambiente.
2. Espere de 20 minutos a 1 h hasta que todos los gusanos en el plato revivan a su comportamiento normal de gateo y alimentación.

Resultados

Medición de la temperatura de enfriamiento
Para los experimentos iniciales de inmovilización por enfriamiento, es importante rastrear la temperatura de la superficie del agar para garantizar que los animales puedan inmovilizarse adecuadamente. Los experimentos futuros que se replican desde el inicial pueden utilizar los mismos parámetros, generalmente sin un seguimiento frecuente de la temperatura. Para la medición de la temperatura, la punta del termopar del termómetro se esteriliza con una solución de etanol al 70%, esperando hasta que el etanol se evapore completamente antes de usarlo. Luego, la punta del termopar se inserta 1 mm en el agar NGM para garantizar una lectura precisa de la temperatura. La punta del termómetro se sujeta con un soporte de abrazadera u otros soportes (Figura 7B).

Medición de temperatura con cámara infrarroja
La etapa de enfriamiento está diseñada para garantizar que la distribución de la temperatura en el área central de 40 mm de diámetro de la placa sea uniforme. Se utiliza una cámara infrarroja prospectiva (FLIR) para obtener imágenes de la distribución de la temperatura en la superficie del agar. La diferencia máxima de temperatura es de alrededor de 1 °C cuando el_conjunto T es de 1, 3 o 6 °C (Figura 8A).

Evaluación de la velocidad de enfriamiento con la estrategia de enfriamiento rápido
La estrategia de enfriamiento rápido se utiliza para caracterizar la velocidad de enfriamiento de una etapa a 12 V. Se coloca una placa de 20 °C en la etapa de enfriamiento y se utiliza un termómetro de termopar para rastrear la temperatura de la superficie. La etapa enfría las placas de 20 °C a 6 °C en 6 min, a 1 °C en 10 min, y finalmente se estabiliza por debajo de -7 °C en unos 40 min (Figura 8B).

Uso de la etapa de enfriamiento en una plataforma de microscopio vertical
Un microscopio vertical generalmente comprende un objetivo para la obtención de imágenes, una etapa para la retención de muestras y la iluminación. Esta etapa de enfriamiento está diseñada para su uso en una etapa típica de microscopio vertical con fácil inserción y extracción (Figura 8C). Cuando se necesita la inmovilización por enfriamiento para obtener imágenes o cribado, la etapa de enfriamiento simplemente se coloca en la etapa de microscopio para terminar la instalación y viceversa.

La inmovilización de gusanos en la placa de enfriamiento se muestra en la película 1.

Figura 1: Modelo 3D del aparato de la etapa de enfriamiento. Las conexiones electrónicas no se muestran para mayor claridad. Un tanque bombea agua a través del bloque de enfriamiento para eliminar el calor transferido por el Peltier incrustado en el escenario. Una placa de cultivo de poliestireno típica de 60 mm puede colocarse en la ventana de zafiro transparente y enfriarse por etapa. Modelo generado en Solidworks. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Modelos 3D de componentes a fabricar. (A) Placa de cobre. (B) Soporte de sujeción impreso en 3D. (C) Placa de aislamiento impresa en 3D. Modelos generados en Solidworks. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Conjunto de refrigeración por agua . (A) Componentes individuales. Tubos cortados a longitudes especificadas. (B) Componentes de refrigeración por agua conectados. (C) Cables que conectan el tanque de la bomba y el radiador a la fuente de alimentación de 12 V. En general, los cables rojos se conectan al extremo positivo y los cables negros al extremo negativo. (D) Agua purificada vertida en la bomba. (E) El tanque se llenó a más de dos tercios para una eficiencia óptima de la bomba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Conexión del Peltier y del conjunto de refrigeración por agua. (A) Componentes para operar el Peltier. (B) Utilizar la fuente de alimentación sintonizable para determinar los lados caliente y frío del Peltier. Por seguridad, no se utilizan más de 2 V. (C) Aplicación uniforme de pasta térmica a la superficie del bloque de cobre. (D) Aplicación uniforme de pasta térmica a la superficie caliente de Peltier. (E) Lado caliente del Peltier presionado sobre el bloque de cobre con pasta térmica. (F) Termómetro infrarrojo utilizado para medir la temperatura de la superficie fría de Peltier. Idealmente, la temperatura fría puede alcanzar cerca de -35 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Montaje de la placa de cobre y la ventana de zafiro . (A) Componentes necesarios. (B) Pasta térmica aplicada a tres superficies internas de la placa de cobre donde la ventana de zafiro entrará en contacto. Dos vistas hacia abajo de la placa de cobre que muestran la ubicación de las tres superficies. (C) Ventana de zafiro en el orificio de la placa de cobre. (D) Cinta aplicada a la superficie superior del conjunto. (E) Parte superior: las líneas discontinuas azules indican los lugares para cortar y quitar la cinta: depresión cuadrada, dos agujeros y un área de zafiro de 70 mm de diámetro. (F) Parte inferior: La cinta se corta y se retira como se muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Montaje final de la etapa de enfriamiento . (A) Pasta térmica aplicada a la depresión de la placa de cobre. (B) Pasta térmica aplicada al lado frío del Peltier. (C) Superficie fría del Peltier conectada a la depresión. (D) Bloque de enfriamiento de cobre fijado a la placa de cobre mediante tornillos. Etapa de enfriamiento en la base de aislamiento. (E) Etapa de enfriamiento completada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Etapa de enfriamiento en el microscopio y medición del termopar. (A) Etapa de enfriamiento colocada en la base del microscopio para la obtención de imágenes. La ventana de zafiro es transparente, lo que permite la transiluminación. (B) Termómetro de termopar utilizado para medir la temperatura superficial del agar NGM. La punta insertó alrededor de 1 mm en el agar NGM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Caracterización y uso de la etapa de enfriamiento . (A) Imágenes térmicas que muestran la superficie de agar enfriada a 1, 3 y 6 °C. Distribución uniforme de la temperatura dentro del área central de 40 mm (círculo discontinuo blanco). (B) Temperatura de la superficie de agar NGM a lo largo del tiempo en la etapa de enfriamiento a 12 V. La superficie de agar NGM se puede enfriar por debajo de -7 °C. Temperatura medida por el método de la figura 7B. (C) Etapa de enfriamiento en uso en un microscopio vertical típico. La etapa de enfriamiento se puede instalar o quitar fácilmente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

	Enfriamiento lento	Enfriamiento rápido	enfriamiento abrupto
Ocupación escénica	mínimo	largo	Medio
tiempo hasta que los animales sean inmovilizados	largo	Medio	muy corto
Fuerza de inmovilización	fuerte	Medio	Medio
Esfuerzo del usuario	mínimo	ligeramente más que el mínimo	máximo

Tabla 1: Comparación de estrategias de enfriamiento.

Conjunto T (°C)	ΔT (°C)	Conjunto V (V)
1	2	8
2	3	7.4
3	4.5	7
4	5.5	6.5
5	6	5.9
6	6	5.5

Tabla 2: Parámetros para alcanzar la temperatura deseada en la estrategia de enfriamiento rápido.

Archivo complementario 1: Placa de cobre en métrica. Dibujo A2D para el mecanizado de la placa de cobre. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Soporte de sujeción. Un dibujo 3D de un soporte de sujeción que Solidworks puede abrir o modificar y exportar al software de impresión 3D. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente complementario 3: Placa de aislamiento. Un dibujo 3D de una placa de aislamiento que Solidworks puede abrir o modificar y exportar al software de impresión 3D. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Película 1: Enfriamiento de video. Gusanos de inmovilización en la placa de agar NGM a 2 °C. La placa se enfrió de temperatura ambiente a 2 °C, y se mantuvo a 2 °C durante varios minutos. Luego, la etapa de enfriamiento se apagó y las placas comenzaron a calentarse a temperatura ambiente de forma natural. El video se acelera 10x para adaptarse a un video de 1 hora en 6 minutos. Haga clic aquí para descargar esta película.

Tabla suplementaria 1: Estimación de precios Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La etapa de enfriamiento, fabricación, ensamblaje y uso se muestra en este manuscrito. La mayoría de los componentes son artículos listos para usar que se pueden comprar en línea. Algunos componentes, como la placa de cobre y la ventana de zafiro, necesitan un pedido personalizado y pueden tardar hasta 1 mes en fabricarse. Otros componentes que pueden imprimirse en 3D se fabrican fácilmente en la mayoría de las instituciones de investigación (Tabla suplementaria 1). El proceso de montaje necesita solo unas pocas herramientas y puede ser realizado rápidamente por un no experto en unas pocas horas. Por lo tanto, la mayoría de los laboratorios biológicos deberían poder implementar fácilmente este dispositivo.

La etapa de enfriamiento y el enfoque de inmovilización de enfriamiento poseen varias mejoras significativas sobre los métodos de inmovilización existentes, cuidadosamente detallados en la publicación original²⁰. En resumen, la etapa de enfriamiento permite la fuerte inmovilización de grandes poblaciones de C. elegans de todas las edades, incluidos embriones y dauers, en sus placas de cultivo típicas bajo flujos de trabajo de microscopía estándar. Elimina la necesidad de configuraciones de hardware complejas, como la microfluídica, al tiempo que proporciona un efecto de inmovilización más fuerte. Además, minimiza la posible exposición química tóxica a animales e investigadores, ya que no se utilizan productos químicos, al tiempo que proporciona un efecto de inmovilización similar. Estas capacidades técnicas permiten la amplia aplicación de este dispositivo y el enfoque de muchos experimentos que requieren microscopía in vivo de alta resolución en un gran número de animales.

Hay algunos pasos críticos durante la construcción del dispositivo, incluida toda la aplicación de pasta térmica y la cinta ancha para fijar la ventana de zafiro a la placa de cobre. La pasta térmica garantiza una fuerte conductividad térmica al reemplazar los huecos con un material de baja resistencia térmica. Para lograr el rendimiento de enfriamiento deseado, la pasta debe introducirse correctamente entre todas las superficies contiguas / de contacto, incluida la superficie fría Peltier a la placa de cobre, la superficie caliente Peltier al bloque de enfriamiento de cobre y la placa de cobre a la ventana de zafiro. La cinta ancha aplicada a la plataforma aísla la placa de cobre para evitar el calentamiento del aire y la condensación, lo que conduce a la oxidación. También fortalece la conexión entre la ventana de zafiro y la placa de cobre. Por lo tanto, tanto la aplicación de pasta térmica como la cinta ancha requieren un cuidado adicional.

En un experimento real de inmovilización por enfriamiento, los parámetros proporcionados en este manuscrito, como voltajes y tiempos, dependen de las propiedades específicas de las placas de cultivo y la etapa, como la cantidad de agar en las placas, la eficiencia de la etapa y la temperatura y humedad ambiente. En futuras modificaciones, se podría instalar un controlador de retroalimentación, como un derivado proporcional-integral (PID), para ajustar activamente la entrada de voltaje a la etapa de enfriamiento para lograr la temperatura deseada y estabilizarla.

Existen varias limitaciones de esta etapa de enfriamiento de inmovilización, cuidadosamente detalladas en la publicación original²⁰. En resumen, los animales criados a diferentes temperaturas son inmovilizados en diferentes grados, lo que puede necesitar un ajuste adicional. Además, esta etapa de enfriamiento actual no está diseñada para un microscopio invertido. Además, las imágenes o el cribado en una placa de cultivo directamente pueden introducir contaminación en la placa.

Estamos diseñando nuevas versiones de la etapa de enfriamiento adecuadas para diferentes plataformas de imágenes, incluidos microscopios verticales compuestos y microscopios invertidos. Estos nuevos diseños permitirán la inmovilización directa del enfriamiento de los animales en las placas de cultivo durante la obtención de imágenes en estas plataformas. Las imágenes en estas etapas de enfriamiento utilizarán objetivos de inmersión de aire de larga distancia de trabajo, similares a la configuración vertical. Hoy en día, los objetivos de inmersión en el aire pueden tener una apertura numérica de hasta 0,9, lo que proporciona una resolución de alrededor de 300 nm para imágenes de proteínas de fluorescencia verde. Por lo tanto, la combinación de una nueva etapa de enfriamiento con un microscopio podría permitir imágenes de fluorescencia de resolución submicrónica de forma rutinaria.

También proporcionamos algunos consejos útiles para utilizar la etapa de enfriamiento de acuerdo con nuestra experiencia. Por ejemplo, las personas deben verificar si hay burbujas de aire dentro del conjunto de refrigeración por agua. Las burbujas de aire degradan el enfriamiento a la superficie caliente de Peltier y, por lo tanto, degradan la efectividad de enfriamiento de la etapa de enfriamiento. Si hay burbujas de aire, la fuente de alimentación de 12 V debe encenderse para que el agua fluya y todos los componentes del flujo de agua deben agitarse. Las burbujas de aire pueden ser expulsadas de las áreas atrapadas y ventiladas por el tanque de la bomba. Los investigadores deben asegurarse de que el tubo de flujo de agua no esté doblado o cruzado al ensamblar el conjunto de enfriamiento por agua. La flexión o el cruce del tubo pueden impedir el flujo adecuado de agua y reducir la eficacia de enfriamiento. Las conexiones de los tubos deben estar bien ajustadas y apretadas. Si es necesario, se puede usar un tubo blando con un diámetro diferente para garantizar la estanqueidad. No se debe aplicar pegado, incluso si la conexión no es lo suficientemente apretada, ya que la pasta puede introducir obstrucciones durante el uso futuro. La humedad de la habitación afecta el rendimiento de enfriamiento e introduce condensación y hielo en la etapa de enfriamiento. Antes de colocar una placa de cultivo en la etapa de enfriamiento, se recomienda usar un pañuelo de papel para eliminar la condensación o usar un disipador de calor para eliminar rápidamente el hielo que se ha formado en la ventana de zafiro. El tanque de la bomba y los ventiladores del radiador pueden causar pequeñas vibraciones en el microscopio si trabajan en la misma mesa. La vibración del microscopio difumina la imagen adquirida y, por lo tanto, debe evitarse. Se puede usar un cojín para aislar mecánicamente el tanque y el radiador, o se pueden colocar en una mesa cercana separada. La etapa de enfriamiento puede convertirse en una etapa de calentamiento invirtiendo la conexión eléctrica al Peltier.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-V power supply	ANYTITI	ledpower00	output DC 12V +/-0.5V, 5A power 60W
8-32 screw	arbitrary		for bracket fixation
bracket	N/A	N/A	3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model.
breadboard	DEYUE	7545924028	400 pin solderless board kit for DIY electric connection
copper cooling block	Kalolary	Kalolary-Heatsink001	40*40mm internal fin thickness 0.5mm
copper plate	arbitrary	N/A	Machined from a 170x120x3 mm 99.9% pure copper sheet.  See supplementary for 2D drawing for manufacturing.
digital thermocouple thermometer	Proster	4333090752	dual channel thermometer with two K-type thermocouple probes measuring range -50-300°C accuracy ±1.5% resolution 0.1°C /°F < 1000°
isolation base	N/A	N/A	3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model.
jumper wires	arbitrary		for electronic connection
multistage peltier	DigiKey	TEC1-12706	thermoelectric cooling device size 40*40*7.05 mm Umax 16.1 V  Imax 8.5 A ΔTmax @ Th 85°C @ 27°C Qmax @ Th 51.6W @ 27°C resistance 1.65 Ω
Nalgene 50 Platinum-Cured Silicone Tubing	ThermoScientific	14-176-332E	ultrasoft tube durometer hardness Shore A, 50 inner diameter 1/4 in outer diameter 9.5 mm
packaging tape	arbitrary		4 inch wide to cover the copper plate
pump tank	Yosoo	SC-300T	input power DC 12V flow rate 300L/h max
radiator	DIYhzWater	10463	12 pipe aluminum heat exchanger cooling water drain row with two 120mm fans
sapphire window	Altos Photonics, Inc.	N/A	Contact Altos for custom order size Ø 80mm, 3mm thick surface quality 60-40s/d uncoated
thermal paste	Corsair	XTM50	reduce thermal impedance between surfaces thermal conductivity 5.0W/mK
tunable power supply	Kungber	DY-SPS3010B	voltage range 0 – 30V current range 0 – 10A linear Power Supply with 4-Digits coarse and fine adjustments with alligator leads