Aufbau und Betrieb einer Kühlstufe zur Immobilisierung von C. elegans auf ihren Kulturplatten

Zusammenfassung

In diesem Artikel werden Protokolle für den Aufbau und Betrieb einer Kühlstufe beschrieben, um C. elegans massenhaft auf ihren ursprünglichen Kultivierungsplatten zu immobilisieren.

Zusammenfassung

Hochauflösende In-vivo-Mikroskopieansätze können subtile Informationen und feine Details im Inneren des Modelltiers Caenorhabditis elegans (C. elegans) aufdecken, erfordern jedoch eine starke Ruhigstellung der Tiere, um Bewegungsunschärfe in den Bildern zu vermeiden. Leider erfordern die meisten aktuellen Immobilisierungstechniken einen erheblichen manuellen Aufwand, so dass hochauflösende Bildgebung einen geringen Durchsatz aufweist. Die Immobilisierung von C. elegans wird durch die Verwendung eines Kühlansatzes, der ganze Populationen direkt auf ihren Kultivierungsplatten leicht immobilisieren kann, erheblich vereinfacht. Die Kühlstufe kann einen breiten Temperaturbereich mit einer gleichmäßigen Verteilung auf der Kultivierungsplatte aufbauen und aufrechterhalten. In diesem Artikel wird der gesamte Prozess des Aufbaus der Kühlstufe dokumentiert. Ziel ist es, dass ein typischer Forscher in seinem Labor problemlos eine betriebsbereite Kühlstufe nach diesem Protokoll aufbauen kann. Die Nutzung der Kühlstufe nach drei Protokollen wird gezeigt, und jedes Protokoll hat Vorteile für verschiedene Experimente. Ebenfalls gezeigt wird ein Beispiel für ein Kühlprofil der Stufe, wenn sie sich ihrer Endtemperatur nähert, und einige hilfreiche Tipps zur Verwendung der Kühlimmobilisierung.

Einleitung

Die hochauflösende optische Mikroskopie ist ein unverzichtbares Werkzeug für die Untersuchung biologischer Strukturen in vivo auf subzellulärer Ebene. Viele biologische Studien erfordern Bildgebung mit einer Auflösung im Submikrometerbereich, um subtile anatomische Details aufzuklären, einschließlich der Neuronenmorphologie ^1,2, der Membranstruktur^3,4 und der Proteinlokalisierung ^5,6. Ein hochauflösendes Bild benötigt je nach Abbildungsmodalität und Sonde eine Belichtungszeit von mehreren Millisekunden bis Sekunden ^7,8. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, ist es unerlässlich, mikroskopische Experimente sorgfältig zu planen und durchzuführen. Entscheidend dafür ist eine effiziente Tierpräparationsmethode, die eine hochauflösende Bildgebung ermöglicht.

Der Fadenwurm C. elegans ist ein weit verbreiteter Modellorganismus zur Untersuchung vieler biologischer Prozesse⁹. Diese kleinen Tiere werden in der Regel auf Agarplatten mit Nematodenwachstumsmedium (NGM) kultiviert und vermehren sich schnell durch Selbstbefruchtung, wodurch sie sich gut für groß angelegte Studien eignen. Ihre Transparenz und ein breites Spektrum an Beschriftungstechniken ermöglichen eine einfache Visualisierung ihrer inneren Anatomie^10,11. Die feinen Strukturen in C. elegans sind ideal für die Untersuchung biologischer Prozesse auf subzellulärer Ebene, wie z.B. Neuronenregeneration¹², Neuronendegeneration 13 und Zellteilung¹⁴. Solche Studien erfordern Bildgebung mit einer Auflösung im Submikrometerbereich und eine Immobilisierung der Tiere, die stark genug ist, um Bildunschärfe zu verhindern. Eine starke Immobilisierung ist besonders wichtig für Techniken, bei denen mehrere Bilder in Raum oder Zeit verwendet werden, wie z. B. 3D-Bildstapel (d. h. Z-Stapel) und Zeitrafferaufnahmen. Jede Tierbewegung zwischen den Aufnahmen kann das Ergebnis verfälschen. Bei C. elegans beinhaltet die starke Immobilisierung typischerweise die manuelle Manipulation einzelner Tiere und die Montage auf Objektträgern mit einem Betäubungsmittel^15,16. Diese zeit- und arbeitsintensiven Verfahren erschweren groß angelegte Experimente sehr. Eine Immobilisierungsstrategie, bei der die Tiere direkt und reversibel auf ihren ursprünglichen Kultivierungsplatten immobilisiert werden, könnte eine hochauflösende Bildgebung mit hohem Durchsatz ermöglichen.

Die kühlende Immobilisierung von C. elegans wurde in einigen Studien gezeigt, ist aber nicht weit verbreitet. Es wird in der Regel mit einem mikrofluidischen Gerät kombiniert, um die Tiere weiter zu fixieren^17,18,19. Mikrofluidische Geräte sind jedoch komplex, erfordern eine umfangreiche Betriebsausbildung und lassen sich nicht einfach in die typischen Arbeitsabläufe der Feststoffkultivierung von C. elegans-Experimenten integrieren. Daher wird die Mikrofluidik für die Immobilisierung von C. elegans nicht häufig eingesetzt. In Verbindung mit der jüngsten Veröffentlichung²⁰ des Chung Laboratory wird hier die Einführung eines neuen Ansatzes zur Immobilisierung der Kühlung vorgestellt, bei dem eine thermoelektrische Kühlstufe verwendet wird (Abbildung 1), um diese Mängel zu beheben. Mit der Kühlstufe kann eine typische 60-mm-Styropor-Kultivierungsplatte auf eine beliebige Zieltemperatur (_T-Set) zwischen -8 °C und Raumtemperatur heruntergekühlt werden. Dieser Ansatz der Kühlphase kann eine gesamte Tierpopulation mit minimalem Aufwand für den Benutzer leicht und reversibel immobilisieren, wodurch 98 % der Verarbeitungszeit der Tiere entfallen²⁰.

Im Folgenden werden die Verfahren zum Aufbau einer Kühlstufe von Grund auf beschrieben. Mit Ausnahme der Bearbeitung von Teilen und des 3D-Drucks wird das gesamte Verfahren voraussichtlich 4 Stunden dauern, ohne dass Spezialwerkzeuge oder Fachwissen erforderlich sind. Anschließend werden drei verschiedene Kühlstrategien mit unterschiedlichen Kühlraten und die Bemühungen des Benutzers, C. elegans auf einem typischen aufrechten Mikroskop zu immobilisieren, weiter beschrieben. Die bevorzugte Strategie kann von der Benutzeranwendung abhängen. Die Protokolle für diese drei Strategien zur Kühlung der Immobilisierung werden detailliert beschrieben.

Protokoll

1. Herstellung und Vorbereitung jeder Komponente der Kühlstufe

HINWEIS: Die Kühlstufe besteht aus mehreren Komponenten (siehe Materialtabelle). Die meisten Komponenten sind von der Stange. Das Saphirfenster erfordert eine Sonderanfertigung, während die Kupferplatte, die Haltehalterung und die Isolationsplatte vor Ort mit einer computergesteuerten Mühle oder einem 3D-Drucker hergestellt werden können. Nach der ersten Fertigung dauert der spätere Montageprozess ca. 2-3 h.

1. Verwenden Sie eine computergesteuerte Fräsmaschine, um die Kupferplatte aus einem 170 mm x 120 mm x 3 mm großen, zu 99,9 % reinen Kupferblech zu bearbeiten (Abbildung 2A). Die 2D-Zeichnung für diese Fertigung finden Sie in der Ergänzungsdatei 1. Verwenden Sie feinkörniges Schleifpapier, um scharfe Kanten und schmutzige Rückstände zu entfernen.
2. Verwenden Sie zur Herstellung der Haltehalterung und der Isolationsplatte einen 3D-Drucker und Polymilchsäure (PLA)-Filament mit einem Durchmesser von 1,75 mm (Abbildung 2B,C). Für eine bessere Qualität sollte der 3D-Drucker eine Schichthöhe bieten, die feiner als 0,2 mm ist.3D Modelle sind in Supplementary File 2 und Supplementary File 3 enthalten.

2. Aufbau der Wasserkühlung

1. Bereiten Sie den platingehärteten Silikonschlauch, den Pumpentank, den Kupferkühlblock und den Kühler (Abbildung 3A) für den Bau der Wasserkühlungsbaugruppe vor. Bereite eine Rasierklinge, eine Schere und einen Inbusschlüssel vor. Achten Sie auf elektrische Gefahren durch die Verwendung von Wasser während der gesamten Montage.
2. Schneiden Sie den Silikonschlauch in drei Abschnitte mit den empfohlenen Längen von 40 cm, 50 cm und 80 cm. Passen Sie die Länge bei Bedarf an.
3. Stecken Sie die Silikonschlauchabschnitte aus Schritt 2.2 in die Anschlüsse des Kühlers, des Pumpentanks und des Kupferkühlblocks, wie in Abbildung 3B gezeigt. Stellen Sie sicher, dass alle Anschlüsse wasserdicht sind. Die Wasserkühlung ist nun gebaut.
4. Bereiten Sie die Wasserkühlung, ein 12-V-Netzteil, drei rote und drei schwarze Überbrückungsdrähte, ein Steckbrett und 500 ml gereinigtes Wasser vor.
5. Stellen Sie sicher, dass die Werkbank frei von Flüssigkeit ist, um die elektrische Sicherheit zu gewährleisten.
6. Verbinden Sie die Pumpentanks und die Kabel des Kühlers über das Steckbrett mit der 12-V-Stromversorgung (Abbildung 3C). Das Steckbrett wird der Einfachheit halber verwendet.
   HINWEIS: Für eine dauerhaftere und sicherere Verbindung können Forscher die Steckplatine durch Lötdrähte ersetzen.
7. Öffnen Sie den Tankdeckel der Pumpe mit einem Schlitzschraubendreher. Verwenden Sie einen Trichter, um Wasser hinzuzufügen, bis der Pumpentank zu etwa 80 % gefüllt ist (Abbildung 3D). Verschließen Sie den Pumpentank nach dieser Befüllung nicht.
8. Schalten Sie die Wasserkühlung ein, indem Sie das 12-V-Netzteil einstecken oder einschalten (falls ein Schalter vorhanden ist). Nach dem Einschalten fließt das Wasser in die Baugruppe und die Lüfter am Kühler sollten durchbrennen.
9. Durch den Wasserfluss aus dem Pumpentank sinkt der Flüssigkeitsstand im Tank. Geben Sie mehr Wasser in den Pumpentank, bis er sich bei fast 2/3 voll stabilisiert hat (Abbildung 3E).
10. Schütteln Sie den Kühler, um Luftblasen zu entfernen, und verschließen Sie dann den Kühltank.
11. Schalten Sie die Stromversorgung aus, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.

3. Testen von kalten und heißen Peltier-Oberflächen

HINWEIS: Das Peltier, eine Schlüsselkomponente der Kühlstufe, ist eine aktive Festkörperwärmepumpe, die Wärme von einer Seite auf die andere überträgt²¹. Eine Oberfläche des Peltiers wird heiß und die andere Oberfläche kalt, wenn Strom bereitgestellt wird. Standardmäßig markieren Peltier-Hersteller die kalte Oberfläche vor dem Verkauf, aber es ist dennoch hilfreich, sie vor der Montage manuell zu testen.

1. Bereiten Sie das abstimmbare Netzteil und das Peltier vor, wie in Abbildung 4A gezeigt.
2. Stellen Sie sicher, dass das abstimmbare Netzteil ausgeschaltet ist, um mögliche elektrische Gefahren zu vermeiden.
3. Verbinden Sie das rote Kabel des Peltiers mit dem positiven Ausgang und das schwarze Kabel mit dem negativen Ausgang des abstimmbaren Netzteils mit Krokodilklemmen, die mit dem Netzteil geliefert werden (Abbildung 4B).
4. Schalten Sie das abstimmbare Netzteil ein und stellen Sie es auf etwa 2 V ein, indem Sie sowohl die Spannungs- als auch die Stromregler in der oberen Reihe des Netzteils modulieren. Verwenden Sie sofort einen bloßen Finger, um die beiden Oberflächen des Peltiers zu ertasten. Eine Oberfläche wird innerhalb weniger Sekunden kalt.
5. Nachdem Sie festgestellt haben, welche Oberfläche kalt ist, schalten Sie sofort die Stromversorgung aus und trennen Sie das Peltier.
6. Verwenden Sie einen Marker, um die kalte Oberfläche für die zukünftige Montage anzuzeigen.

4. Konstruktion der Baugruppe zur Kühlung des Peltiers mit Wasserkühlung

1. Wie in Abbildung 4A gezeigt, bereiten Sie die abgeschaltete Wasserkühlung, das Peltier (kalte Oberfläche markiert) und die Wärmeleitpaste (für eine verbesserte Wärmeleitung) vor.
2. Reinigen Sie alle Oberflächen des Kupferkühlblocks mit 70%igem Ethanol (oder einer anderen Reinigungslösung) in der Wasserkühlungsbaugruppe.
3. Tragen Sie ca. 0,4 g Wärmeleitpaste auf eine Oberfläche des Kupfer-Wasserkühlblocks auf und achten Sie darauf, dass diese Oberflächenausrichtung verhindert, dass sich die Rohre kreuzen oder verbiegen, wenn sie nach unten zeigen. Verwenden Sie einen Handschuh, um die Haut zu schützen, und versuchen Sie, die Wärmeleitpaste dünn und gleichmäßig zu verteilen (Abbildung 4C).
4. Reinigen Sie auf ähnliche Weise die heiße Oberfläche des Peltiers und tragen Sie dann die Wärmeleitpaste auf die Oberfläche auf (Abbildung 4D).
5. Verbinden Sie die heiße Peltier-Oberfläche mit der Kupfer-Kühlblockoberfläche mit Wärmeleitpaste. Üben Sie Druck aus, um sicherzustellen, dass es sicher ist. Befolgen Sie die Ausrichtung der Drähte am Peltier und an den Rohren des Kupferkühlblocks, wie in Abbildung 4E gezeigt. Reinigen Sie die überschüssige Wärmeleitpaste.
6. Lassen Sie sowohl das 12-V-Netzteil als auch das abstimmbare Netzteil ausgeschaltet. Schließen Sie das Peltier an die abstimmbare Stromversorgung an, wie in Abschnitt 3 beschrieben.
7. Überprüfen Sie erneut die Anschlüsse der elektrischen Baugruppe und der Wasserkühlung und schalten Sie dann nacheinander das 12-V-Netzteil und das abstimmbare Netzteil ein.
8. Drehen Sie das abstimmbare Netzteil allmählich auf 12 V. Mit dem vorgeschlagenen Peltier sollte der Strom bei etwa 7,3 A liegen.
9. Warten Sie 2 Minuten; Die Temperatur der kalten Peltier-Oberfläche sollte kälter als -35 °C werden. Messen Sie diese Temperatur mit einem Infrarot-Thermometer (Abbildung 4F). Berühren Sie nicht die kalte Oberfläche, um Verletzungen der Hände zu vermeiden.
10. Überprüfen Sie alle Anschlüsse und Komponenten, wenn die Temperatur nicht unter -30 °C fallen kann. Luftblasen im Inneren der Wasserkühlung sind ein möglicher Grund für eine suboptimale Kühlleistung.
11. Um die Sicherheit in späteren Schritten zu gewährleisten, schalten Sie das abstimmbare Netzteil aus, warten Sie 1 Minute und schalten Sie dann das 12-V-Netzteil aus.

5. Konstruktion der Kupferplatten- und Saphirfensterbaugruppe

1. Bereiten Sie die Kupferplatte, das Saphirfenster mit einem Durchmesser von 80 mm, Wärmeleitpaste, ein 4 Zoll breites Klebeband und eine scharfe Klinge zum Schneiden vor (Abbildung 5A).
2. Reinigen Sie die Kupferplatte und das Saphirfenster vorsichtig mit 70%igem Ethanol und glätten Sie raue Oberflächen mit feinkörnigem Schleifpapier.
3. Tragen Sie die Wärmeleitpaste auf drei Innenflächen auf, wie in Abbildung 5B gezeigt. Stellen Sie sicher, dass die Wärmeleitpaste alle drei Oberflächen bedeckt, aber nicht zu dick ist, etwa 0,5 mm.
4. Legen Sie die Kupferplatte mit Druckerpapier geschützt auf die Tischplatte. Das Papier erleichtert die spätere Reinigung.
5. Setzen Sie das Saphirfenster in das Loch der Kupferplatte ein (Abbildung 5C). Stellen Sie sicher, dass sich der Saphir während des Einsetzens nicht dreht, um zu verhindern, dass sich die Wärmeleitpaste in andere Bereiche bewegt. Überschüssige Wärmeleitpaste entfernen.
6. Kleben Sie das 4 Zoll breite Klebeband auf die Oberseite der Kupferplatte-Saphir-Fensterbaugruppe (die Oberfläche, die den quadratischen Vertiefungsbereich aufweist, wie in Abbildung 5D gezeigt). Vermeiden Sie Luftblasen zwischen dem Klebeband und den Kupferoberflächen während des Einklebens, indem Sie die Haftung langsam von einer Seite zur anderen führen.
7. Schneiden Sie die angegebenen blau gestrichelten Bereiche des Klebebandes mit einer scharfen Klinge aus und folgen Sie Abbildung 5E. Beim Schneiden werden die beiden Gewindelöcher, die quadratische Vertiefung und die Fläche des Saphirfensters mit einem Durchmesser von 70 mm freigelegt.
8. Kleben Sie die Unterseite der Kupferplatte-Saphir-Fensterbaugruppe ab und wiederholen Sie dann den Schneidevorgang (nur Saphirbereich) auf dieser Oberfläche, wie in Abbildung 5F gezeigt.
   HINWEIS: Jetzt ist das Saphirfenster an der Kupferplatte befestigt und die Kupferoberflächen sind vor Rost geschützt.

6. Endmontage der Kühlstufe

1. Stellen Sie sicher, dass alle wichtigen Unterbaugruppen und Komponenten bereit sind.
2. Tragen Sie etwa 0,4 g Wärmeleitpaste auf die quadratische Vertiefung der Kupferplatte auf (Abbildung 6A).
3. Tragen Sie ca. 0,4 g Wärmeleitpaste auf die kalte Oberfläche des Peltiers auf. Beachten Sie, dass das Peltier bereits am Kupferkühlblock befestigt ist (Abbildung 6B).
4. Verbinden Sie die kalte Peltier-Oberfläche mit der Vertiefung der Kupferplatte mit Abwärtsdruck. Reinigen Sie die überschüssige Wärmeleitpaste (Abbildung 6C).
5. Montieren Sie die 3D-gedruckte Halterung auf der Oberseite des Kupferkühlblocks und ziehen Sie dann mit einem Inbusschlüssel zwei 8-32, 0,5 Zoll lange Schrauben fest, um die Halterung an der Kupferplatte zu befestigen (Abbildung 6D). Verwenden Sie ein Anzugsdrehmoment mit geringem Drehmoment, damit die gedruckte Halterung nicht bricht oder sich verformt, um eine ordnungsgemäße Wärmeleitung vom Peltier zum Kupfer zu gewährleisten.
6. Legen Sie die Kupferplatte in die 3D-gedruckte Isolationsbasis, um sie während des Betriebs von der Tisch- oder Mikroskopbasis zu isolieren (Abbildung 6D).
7. Die Kühlstufe ist montiert und einsatzbereit (Abbildung 6E).
8. Für die Mikroskopie wird die fertige Kühlstufe auf eine aufrechte Mikroskopplattform gelegt (Abbildung 7A).
9. Die Montage der Kühlstufe ist abgeschlossen. Weitere Details sind der begleitenden Publikation des Chung Laboratory zu entnehmen, die die detaillierten Strategien und Tierbewegungen vollständig charakterisiert²⁰.

HINWEIS: In den folgenden Abschnitten werden langsame, schnelle und abrupte Kühlprotokolle erläutert. N2-Hermaphroditen im L4- oder jungen Erwachsenenalter wurden verwendet, um die folgenden Daten zu erhalten. Die Strategie der langsamen Abkühlung ist nützlich, um 20 °C kultivierte N2-Tiere bei 6 °C zu immobilisieren; 15 °C kultivierte N2-Tiere sind bei 1 °C am stärksten immobilisiert²⁰. Ein kurzer Vergleich zwischen diesen drei Kühlprotokollen ist in Tabelle 1 dargestellt.

7. Protokoll zur langsamen Kühlung der Immobilisierung

1. Stellen Sie die Anzuchtplatte mit Deckel auf einen 4 °C warmen Kühlschrank.
2. Nachdem Sie die Kultivierungsplatte in den Kühlschrank gebracht haben, schalten Sie die 12-V-Stromversorgung der Kühlstufe ein und stellen Sie die einstellbare Netzspannung auf 5,5 V ein.
3. Nachdem der Kultivierungsteller mit Deckel 1 h im 4 °C-Kühlschrank geblieben ist, überführen Sie den Teller sofort in die Kühlstufe und entfernen Sie den Deckel (Abbildung 7A). Solche Kultivierungsplatten haben in der Regel eine Temperatur von etwa 6 °C. Die vorgekühlte Stufe ist stabil und kalt genug, um die Agaroberfläche bei 6 °C zu halten.
4. Wenn sich die Oberflächentemperatur des Agars ändert, gemessen oder durch Feststellung von Tierbewegungen, die Spannung leicht anpassen, bis sie sich bei 6 °C stabilisiert hat.
5. Die Tiere werden zum Zeitpunkt des Transfers ordnungsgemäß ruhiggestellt.

8. Protokoll zur schnellen Kühlung der Immobilisierung

Anmerkungen: Die schnelle Abkühlstrategie ist die grundlegendste Immobilisierungsmethode (siehe Film 1); Agarplatten besetzen jedoch für längere Zeit untätig die Bühne, während sie das_T-Set erreichen. Auch wenn eine starke Immobilisierung erforderlich ist und der_T-Wert 6 °C beträgt, verlängert sich die Leerlaufzeit auf etwa 1 h²⁰.

1. Schalten Sie die 12-V-Stromversorgung der Kühlstufe ein und stellen Sie die einstellbare Netzspannung auf etwa 12 V ein. Warten Sie 10 Minuten.
2. Bringen Sie eine Anzuchtplatte aus dem Inkubator direkt in die Kühlphase und entfernen Sie den Deckel.
3. Sobald die Oberflächentemperatur des Agars auf (T-Satz + ΔT) °C sinkt, stellen Sie das einstellbare Netzteil auf_{V-Einstellung} ein und warten Sie, bis der Agar den_T-Satz erreicht. Der V-Satz ist die geeignete Spannung, um den Agar bei_T-Satz zu stabilisieren. Das ΔT ist eine Variable, die eine Unterkühlung verhindert. Siehe Tabelle 2 für die Kombination aus_T-Menge, ΔT und_V-Menge.
   HINWEIS: Die in Tabelle 2 dargestellten Daten beziehen sich speziell auf das Chung-Labor, daher ist zu beachten, dass die experimentellen Parameter je nach den einzigartigen Umgebungs- und Nutzungsbedingungen jedes einzelnen Experiments variieren können.
4. Die Tiere werden bewegungsunfähig gemacht, wenn der Agar den_T-Satz erreicht. Die Immobilisierung verbessert sich mit der Zeit bis ~50 min nach Beginn der Abkühlung.

9. Protokoll zur abrupten Kühlung der Immobilisierung

Anmerkungen: Die abrupte Kühlstrategie nimmt die meiste Benutzerzeit in Anspruch, immobilisiert die Tiere jedoch am schnellsten von ihrer Kultivierungstemperatur.

1. Schalten Sie die 12-V-Stromversorgung der Kühlstufe ein und drehen Sie die einstellbare Netzspannung auf etwa 12 V. 10 Min.
2. Bringen Sie eine unbesetzte Agarplatte in die Kühlphase. Verwenden Sie Schritt 8.3 im Protokoll zur schnellen Kühlung der Immobilisierung, um die Oberflächentemperatur des Agars bei_{T-Einstellung} zu stabilisieren.
3. Bringen Sie die Tiere von ihrer ursprünglichen Anzuchtplatte auf die gekühlte Platte, die sich auf der Kühlstufe befindet.
4. Aufgrund der Kleintiergröße wird erwartet, dass die Tiere in Sekundenschnelle auf den_T-Satz abkühlen und bewegungsunfähig gemacht werden. Die Immobilisierung verbessert sich mit der Zeit bis ~50 min nach Beginn der Abkühlung.

10. Wiederbelebung der Tiere nach der Kühlung der Immobilisierung

1. Bringen Sie die abgekühlte Kulturplatte zurück in den ursprünglichen Inkubator oder auf Raumtemperatur.
2. Warten Sie 20 Minuten bis 1 Stunde, bis alle Würmer auf dem Teller wieder zu ihrem normalen Krabbel- und Fressverhalten zurückgekehrt sind.

Ergebnisse

Messung der Kühltemperatur
Für die ersten Versuche zur Kühlung der Immobilisierung ist es wichtig, die Oberflächentemperatur des Agars zu verfolgen, um sicherzustellen, dass die Tiere ordnungsgemäß immobilisiert werden können. Zukünftige Experimente, die aus dem ursprünglichen Experiment repliziert werden, können die gleichen Parameter verwenden, in der Regel ohne häufige Temperaturverfolgung. Für die Temperaturmessung wird die Thermoelementspitze des Thermometers mit 70%iger Ethanollösung sterilisiert, wobei vor der Verwendung gewartet wird, bis das Ethanol vollständig verdampft ist. Anschließend wird die Thermoelementspitze 1 mm in den NGM-Agar eingeführt, um eine genaue Temperaturmessung zu gewährleisten. Die Thermometerspitze wird mit einem Klemmhalter oder anderen Haltern gehalten (Abbildung 7B).

Temperaturmessung mit einer Wärmebildkamera
Die Kühlstufe ist so konzipiert, dass die Temperaturverteilung im mittleren Bereich der Platte mit einem Durchmesser von 40 mm gleichmäßig ist. Eine vorausschauende Infrarotkamera (FLIR) wird verwendet, um die Temperaturverteilung auf der Agaroberfläche abzubilden. Die maximale Temperaturdifferenz beträgt etwa 1 °C, wenn der_T-Satz 1, 3 oder 6 °C beträgt (Abbildung 8A).

Beurteilung der Abkühlrate mit der Schnellkühlstrategie
Die Schnellkühlstrategie wird verwendet, um die Abkühlrate einer Stufe bei 12 V zu charakterisieren. Eine 20 °C-Platte wird auf die Kühlstufe gelegt und ein Thermoelement-Thermometer wird verwendet, um die Oberflächentemperatur zu verfolgen. Der Tisch kühlt die 20 °C-Platten in 6 Minuten auf 6 °C und in 10 Minuten auf 1 °C ab und stabilisiert sich schließlich in etwa 40 Minuten unter -7 °C (Abbildung 8B).

Verwendung des Kühltisches auf einer aufrechten Mikroskopplattform
Ein aufrechtes Mikroskop besteht in der Regel aus einem Objektiv für die Bildgebung, einem Tisch für die Probenaufnahme und einer Beleuchtung. Dieser Kühltisch ist für den Einsatz auf einem typischen aufrechten Mikroskoptisch mit einfachem Einsetzen und Entfernen ausgelegt (Abbildung 8C). Wenn für die Bildgebung oder das Screening eine kühlende Immobilisierung erforderlich ist, wird die Kühlstufe einfach auf den Mikroskoptisch gelegt, um die Installation abzuschließen, und umgekehrt.

Die Immobilisierung von Würmern auf der Kühlplatte wird in Film 1 gezeigt.

Abbildung 1: 3D-Modell der Kühlstufenapparatur. Elektronische Anschlüsse werden aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht angezeigt. Ein Tank pumpt Wasser durch den Kühlblock, um die Wärme abzuführen, die durch das in die Stufe eingebettete Peltier übertragen wird. Eine typische 60-mm-Styropor-Kultivierungsplatte kann auf dem transparenten Saphirfenster sitzen und stufenweise gekühlt werden. In Solidworks generiertes Modell. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: 3D-Modelle der zu fertigenden Bauteile. (A) Kupferplatte. (B) 3D-gedruckte Haltehalterung. (C) 3D-gedruckte Isolationsplatte. Modelle, die in Solidworks generiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Baugruppe Wasserkühlung . (A) Einzelne Komponenten. Rohre, die auf bestimmte Längen zugeschnitten sind. (B) Angeschlossene Wasserkühlungskomponenten. (C) Kabel, die den Pumpentank und den Kühler mit der 12-V-Stromversorgung verbinden. Im Allgemeinen werden rote Drähte mit dem positiven Ende und schwarze Drähte mit dem negativen Ende verbunden. (D) Gereinigtes Wasser wird in die Pumpe gegossen. (E) Der Tank ist zu mehr als zwei Dritteln gefüllt, um einen optimalen Pumpenwirkungsgrad zu erzielen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Verbinden der Peltier- und Wasserkühlungsbaugruppe . (A) Komponenten für den Betrieb des Peltiers. (B) Verwendung des abstimmbaren Netzteils zur Bestimmung der heißen und kalten Seite des Peltiers. Aus Sicherheitsgründen werden nicht mehr als 2 V verwendet. (C) Gleichmäßiges Auftragen von Wärmeleitpaste auf die Oberfläche des Kupferblocks. (D) Gleichmäßiges Auftragen von Wärmeleitpaste auf die heiße Peltier-Oberfläche. (E) Heiße Seite des Peltiers mit Wärmeleitpaste auf den Kupferblock gepresst. (F) Infrarot-Thermometer zur Messung der kalten Peltier-Oberflächentemperatur. Im Idealfall kann die Kältetemperatur nahe -35 °C erreichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Zusammenbau der Kupferplatte und des Saphirfensters . (A) Erforderliche Komponenten. (B) Wärmeleitpaste, die auf drei Innenflächen der Kupferplatte aufgetragen wird, wo das Saphirfenster in Kontakt kommt. Zwei nach unten gerichtete Ansichten der Kupferplatte, die die Lage der drei Oberflächen zeigen. (C) Saphirfenster im Kupferplattenloch. (D) Klebeband, das auf die Oberseite der Baugruppe aufgebracht wird. (E) Oberseite: Blaue gestrichelte Linien zeigen die Stellen an, an denen das Klebeband geschnitten und entfernt werden muss: quadratische Vertiefung, zwei Löcher und ein Saphirbereich mit einem Durchmesser von 70 mm. (F) Unterseite: Das Klebeband wird wie abgebildet abgeschnitten und entfernt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Endmontage der Kühlstufe . (A) Wärmeleitpaste, die auf die Vertiefung der Kupferplatte aufgetragen wird. (B) Wärmeleitpaste, die auf die kalte Seite des Peltiers aufgetragen wird. (C) Kalte Oberfläche des Peltiers, die mit der Vertiefung verbunden ist. (D) Kupferkühlblock, der mit Schrauben an der Kupferplatte befestigt ist. Kühlstufe im Isolationsboden. (E) Abgeschlossene Abkühlphase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7: Kühlstufe am Mikroskop und Thermoelementmessung . (A) Kühltisch auf der Mikroskopbasis für die Bildgebung. Das Saphirfenster ist transparent und ermöglicht eine Durchleuchtung. (B) Thermoelement-Thermometer zur Messung der NGM-Agar-Oberflächentemperatur. Die Spitze wird ca. 1 mm in den NGM-Agar eingeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 8: Charakterisierung und Verwendung der Kühlstufe . (A) Wärmebilder, die die auf 1, 3 und 6 °C gekühlte Agaroberfläche zeigen. Gleichmäßige Temperaturverteilung innerhalb des mittleren 40-mm-Bereichs (weißer gestrichelter Kreis). (B) Temperatur der NGM-Agaroberfläche im Zeitverlauf auf der Kühlstufe bei 12 V. Die NGM-Agaroberfläche kann unter -7 °C gekühlt werden. Die Temperatur wurde mit der Methode in Abbildung 7B gemessen. (C) Kühltisch bei Verwendung auf einem typischen aufrechten Mikroskop. Die Kühlstufe kann einfach ein- oder ausgebaut werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

	langsame Abkühlung	Schnelle Abkühlung	abrupte Abkühlung
Bühnenbesetzung	Minimum	lang	Mittel
Zeit, bis die Tiere bewegungsunfähig sind	lang	Mittel	sehr kurz
Immobilisierungs-Stärke	Stark	Mittel	Mittel
Aufwand für den Benutzer	Minimum	etwas mehr als das Minimum	Maximum

Tabelle 1: Vergleich der Kühlstrategien.

T-Satz (°C)	ΔT (°C)	V-Satz (V)
1	2	8
2	3	7.4
3	4.5	7
4	5.5	6.5
5	6	5.9
6	6	5.5

Tabelle 2: Parameter zum Erreichen der gewünschten Temperatur in der Schnellkühlstrategie.

Ergänzungsdatei 1: Kupferplatte in metrischer Form. A2D-Zeichnung für die Bearbeitung der Kupferplatte. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 2: Haltebügel. Eine 3D-Zeichnung einer Haltehalterung, die von Solidworks geöffnet oder geändert und in eine 3D-Drucksoftware exportiert werden kann. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 3: Isolationsplatte. Eine 3D-Zeichnung einer Isolationsplatte, die von Solidworks geöffnet oder geändert und in eine 3D-Drucksoftware exportiert werden kann. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Film 1: Video zum Kühlen. Immobilisierungswürmer auf der NGM-Agarplatte bei 2 °C. Die Platte wurde von Raumtemperatur auf 2 °C abgekühlt und blieb mehrere Minuten bei 2 °C. Dann wurde die Kühlstufe abgeschaltet und die Platten begannen sich auf natürliche Weise auf Raumtemperatur zu erwärmen. Das Video wird um das 10-fache beschleunigt, so dass ein 1-stündiges Video in 6 Minuten passt. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Preisschätzung Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die Herstellung, Montage und Verwendung der Kühlstufe wird in diesem Manuskript gezeigt. Bei den meisten Komponenten handelt es sich um Standardartikel, die online gekauft werden können. Einige Komponenten, wie die Kupferplatte und das Saphirfenster, benötigen eine Sonderanfertigung und die Herstellung kann bis zu 1 Monat dauern. Andere Komponenten, die 3D-gedruckt werden können, lassen sich in den meisten Forschungseinrichtungen problemlos herstellen (Ergänzende Tabelle 1). Der Montageprozess benötigt nur wenige Werkzeuge und kann von einem Laien in wenigen Stunden schnell durchgeführt werden. Daher sollten die meisten biologischen Labore in der Lage sein, dieses Gerät problemlos zu implementieren.

Die Kühlstufe und der Ansatz der Kühlimmobilisierung weisen mehrere signifikante Verbesserungen gegenüber bestehenden Immobilisierungsmethoden auf, die in der Originalpublikation²⁰ ausführlich beschrieben wurden. Kurz gesagt, die Kühlphase ermöglicht die starke Immobilisierung großer Populationen von C. elegans jeden Alters, einschließlich Embryonen und Dauers, auf ihren typischen Kulturplatten unter Standard-Mikroskopie-Workflows. Es macht komplexe Hardware-Setups wie Mikrofluidik überflüssig und bietet gleichzeitig einen stärkeren Immobilisierungseffekt. Darüber hinaus minimiert es die mögliche Exposition gegenüber toxischen Chemikalien für Tiere und Forscher, da keine Chemikalien verwendet werden, und bietet gleichzeitig einen ähnlichen Immobilisierungseffekt. Diese technischen Möglichkeiten ermöglichen die breite Anwendung dieses Geräts und Ansatzes für viele Experimente, die hochauflösende In-vivo-Mikroskopie an einer großen Anzahl von Tieren erfordern.

Es gibt einige kritische Schritte während des Baus des Geräts, einschließlich des gesamten Auftragens von Wärmeleitpaste und des breiten Klebebandes zur Befestigung des Saphirfensters an der Kupferplatte. Die Wärmeleitpaste sorgt für eine starke Wärmeleitfähigkeit, indem sie Spalten durch ein Material mit geringem Wärmewiderstand ersetzt. Um die gewünschte Kühlleistung zu erzielen, muss die Paste ordnungsgemäß zwischen alle anstoßenden/berührenden Oberflächen eingeführt werden, einschließlich der kalten Peltier-Oberfläche zur Kupferplatte, der heißen Peltier-Oberfläche zum Kupferkühlblock und der Kupferplatte zum Saphirfenster. Das breite Klebeband, das auf der Bühne angebracht ist, isoliert die Kupferplatte, um eine Erwärmung durch Luft und Kondensation zu verhindern, die zu Rost führt. Es verstärkt auch die Verbindung zwischen dem Saphirfenster und der Kupferplatte. Daher erfordern sowohl das Auftragen von Wärmeleitpaste als auch das breite Klebeband besondere Sorgfalt.

In einem tatsächlichen Experiment zur Kühlung der Immobilisierung hängen die in diesem Manuskript angegebenen Parameter, wie z. B. Spannungen und Zeiten, von den spezifischen Eigenschaften der Kultivierungsplatten und des Stadiums ab, wie z. B. der Menge an Agar in den Platten, der Effizienz des Stadiums sowie der Umgebungstemperatur und -feuchtigkeit. In zukünftigen Modifikationen könnte ein Feedback-Regler wie ein Proportional-Integral-Derivat (PID) installiert werden, um den Spannungseingang zur Kühlstufe aktiv anzupassen, um die gewünschte Temperatur zu erreichen und zu stabilisieren.

Es gibt mehrere Einschränkungen dieser Kühlphasen-Immobilisierung, die in der Originalpublikation²⁰ sorgfältig beschrieben werden. Kurz gesagt, Tiere, die bei unterschiedlichen Temperaturen aufgezogen werden, sind unterschiedlich stark immobilisiert, was möglicherweise eine zusätzliche Feinabstimmung erfordert. Außerdem ist diese aktuelle Kühlstufe nicht für ein inverses Mikroskop ausgelegt. Darüber hinaus kann die Bildgebung oder das Screening auf einer Kultivierungsplatte direkt zu einer Kontamination der Platte führen.

Wir entwickeln neue Versionen des Kühltisches, die für verschiedene Bildgebungsplattformen geeignet sind, einschließlich zusammengesetzter aufrechter Mikroskope und inverser Mikroskope. Diese neuen Designs ermöglichen eine direkte Immobilisierung der Tierkühlung auf Kulturplatten während der Bildgebung auf diesen Plattformen. Für die Bildgebung auf diesen Kühlstufen werden Luftimmersionsobjektive mit großem Arbeitsabstand verwendet, ähnlich wie bei der aufrechten Konfiguration. Heutzutage können Luftimmersionsobjektive eine numerische Apertur von bis zu 0,9 haben, was eine Auflösung von etwa 300 nm für die Bildgebung von grünen Fluoreszenzproteinen bietet. So könnte die Kombination eines neuen Kühltisches mit einem Mikroskop routinemäßig Fluoreszenzbildgebung mit Submikrometer-Auflösung ermöglichen.

Wir geben auch einige hilfreiche Tipps für die Verwendung der Kühlstufe nach unserer Erfahrung. Zum Beispiel sollten Einzelpersonen überprüfen, ob sich Luftblasen in der Wasserkühlung befinden. Luftblasen degradieren die Kühlung auf die heiße Peltier-Oberfläche und verschlechtern damit die Kühlwirkung der Kühlstufe. Wenn Luftblasen vorhanden sind, sollte die 12-V-Stromversorgung eingeschaltet werden, damit das Wasser fließt, und alle Komponenten des Wasserflusses sollten geschüttelt werden. Luftblasen können aus eingeschlossenen Bereichen ausgespült und durch den Pumpentank entlüftet werden. Forscher sollten sicherstellen, dass der Wasserdurchflussschlauch beim Zusammenbau der Wasserkühlungsbaugruppe nicht verbogen oder gekreuzt wird. Das Biegen oder Kreuzen von Rohren kann den ausreichenden Wasserfluss verhindern und die Kühleffizienz verringern. Die Schlauchverbindungen sollten richtig sitzen und fest sitzen. Bei Bedarf kann stattdessen ein weicher Schlauch mit einem anderen Durchmesser verwendet werden, um die Dichtheit zu gewährleisten. Paste sollte nicht aufgetragen werden, auch wenn die Verbindung nicht dicht genug ist, da die Paste bei späterem Gebrauch zu Verstopfungen führen kann. Die Raumfeuchte wirkt sich auf die Kühlleistung aus und führt Kondenswasser und Eis auf die Kühlstufe. Bevor Sie eine Kultivierungsplatte auf die Kühlstufe stellen, wird empfohlen, ein Papiertaschentuch zu verwenden, um Kondenswasser zu entfernen, oder einen Kühlkörper zu verwenden, um Eis zu entfernen, das sich auf dem Saphirfenster gebildet hat. Der Pumpentank und die Kühlerlüfter können im Mikroskop kleine Vibrationen verursachen, wenn sie auf demselben Tisch arbeiten. Mikroskopvibrationen verwischen das aufgenommene Bild und sollten daher vermieden werden. Ein Kissen kann verwendet werden, um den Tank und den Kühler mechanisch zu isolieren, oder sie können auf einen separaten Tisch in der Nähe gestellt werden. Die Kühlstufe kann durch Umkehren der elektrischen Verbindung zum Peltier zu einer Heizstufe werden.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-V power supply	ANYTITI	ledpower00	output DC 12V +/-0.5V, 5A power 60W
8-32 screw	arbitrary		for bracket fixation
bracket	N/A	N/A	3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model.
breadboard	DEYUE	7545924028	400 pin solderless board kit for DIY electric connection
copper cooling block	Kalolary	Kalolary-Heatsink001	40*40mm internal fin thickness 0.5mm
copper plate	arbitrary	N/A	Machined from a 170x120x3 mm 99.9% pure copper sheet.  See supplementary for 2D drawing for manufacturing.
digital thermocouple thermometer	Proster	4333090752	dual channel thermometer with two K-type thermocouple probes measuring range -50-300°C accuracy ±1.5% resolution 0.1°C /°F < 1000°
isolation base	N/A	N/A	3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model.
jumper wires	arbitrary		for electronic connection
multistage peltier	DigiKey	TEC1-12706	thermoelectric cooling device size 40*40*7.05 mm Umax 16.1 V  Imax 8.5 A ΔTmax @ Th 85°C @ 27°C Qmax @ Th 51.6W @ 27°C resistance 1.65 Ω
Nalgene 50 Platinum-Cured Silicone Tubing	ThermoScientific	14-176-332E	ultrasoft tube durometer hardness Shore A, 50 inner diameter 1/4 in outer diameter 9.5 mm
packaging tape	arbitrary		4 inch wide to cover the copper plate
pump tank	Yosoo	SC-300T	input power DC 12V flow rate 300L/h max
radiator	DIYhzWater	10463	12 pipe aluminum heat exchanger cooling water drain row with two 120mm fans
sapphire window	Altos Photonics, Inc.	N/A	Contact Altos for custom order size Ø 80mm, 3mm thick surface quality 60-40s/d uncoated
thermal paste	Corsair	XTM50	reduce thermal impedance between surfaces thermal conductivity 5.0W/mK
tunable power supply	Kungber	DY-SPS3010B	voltage range 0 – 30V current range 0 – 10A linear Power Supply with 4-Digits coarse and fine adjustments with alligator leads