يصف هذا البروتوكول نموذج الإصابة بالتبريد للحث على تلف عميق للعديد من الميومرات الذيلية في أسماك الزرد البالغة. توفر هذه الطريقة نهجا جديدا لدراسة تجديد العضلات والهيكل العظمي بعد الفقدان الشديد للأنسجة في الفقاريات غير الثديية.
تخضع العضلات الهيكلية للتجديد والترميم بعد إصابة طفيفة من خلال تنشيط الخلايا الجذعية الشبيهة بالأقمار الصناعية. غالبا ما تؤدي الإصابات الشديدة في الجهاز العضلي إلى التليف عند البشر. بالمقارنة مع الثدييات ، تمتلك أسماك الزرد قدرة فطرية أعلى على تجديد الأعضاء ، مما يوفر نموذجا قويا لدراسة استعادة الأنسجة بعد الأضرار الجسيمة التي لحقت بالعضو. هنا ، تم وصف نموذج الإصابة بالتبريد لإحداث تلف عميق لأربعة عضل من السويقة الذيلية في الزرد البالغ. تم تصميم مسبار التبريد المصنوع خصيصا ليناسب شكل الجسم وإصابة العضلات الجانبية بشكل متكرر من الجلد إلى خط الوسط. الأهم من ذلك ، ظلت سلامة الجسم سليمة ، وواصلت الأسماك نشاط السباحة. تم تقييم التغييرات التي طرأت على العضلات الهيكلية عن طريق التلوين النسيجي وتلطيخ مضان البروتينات الساركومية على أقسام الأنسجة. ستفتح هذه الطريقة طرقا جديدة للبحث تهدف إلى فهم كيف يؤدي تنكس العضلات الهيكلية إلى استجابات تعويضية ، وبالتالي إعادة تنشيط البرنامج العضلي في الزرد البالغ.
في الفقاريات ، تخضع الأجزاء التالفة من الأنسجة المختلفة لتجديد واستعادة الاستتباب خلال العمر. تعتمد هذه القدرة على التجديد والاستعادة عادة على وجود الخلايا الجذعية المختصة أو القدرة التكاثرية للخلايا الناضجة 1,2. تتكون العضلات الهيكلية من ألياف عضلية ما بعد الانقسام ، والتي ترتبط بالخلايا الجذعية المحلية ، تسمى الخلايا الساتلية3،4،5،6. وبالتالي ، يحتوي هذا النسيج على مصادر خلوية للإغلاق الفعال لمناطق الاستمرارية المتقطعة أو لإصلاح الجروح الطفيفة. ومع ذلك ، غالبا ما يتبع الخسائر الحجمية الأكبر في عضلات الهيكل العظمي للثدييات إصلاح غير متجدد ، مثل التليف7. يمكن أن توفر النماذج الحيوانية رؤى جديدة حول الآليات البيولوجية التي تعزز تجديد الأعضاء التالفة على نطاق واسع.
الزرد هو كائن نموذجي راسخ يتمتع بقدرة عالية على التجدد. يمكن لسمك الزرد البالغ تجديد جزء مبتور من الزعنفة الذيلية أو القمة المقطوعة للبطين القلبي8،9،10،11. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطبيق طريقة الإصابة بالتبريد سابقا لدراسة تجديد الزعانف والقلب في الزرد12،13،14،15. في حالة الأعضاء الداخلية ، تتمتع طريقة الإصابة بالتبريد بميزة إحداث موت الخلايا دون تعطيل سلامة الأعضاء ، وبالتالي محاكاة الظروف الفسيولوجية16,17. يتم تفكيك بقايا الأنسجة عن طريق الإزالة الطبيعية أثناء التئام الجروح ، تليها عمليات التعويض. ومع ذلك ، لا يزال يتعين تحديد ما إذا كان يمكن تطبيق هذه الطريقة على العضلات الهيكلية.
في الأسماك ، تتيح العضلات الجانبية ثني الجذع من جانب إلى آخر أثناء السباحة18. يتم تنظيم عضلات الهيكل العظمي في وحدات metameric ، تسمى myomeres ، والتي يتم فصلها بواسطة النسيج الضام 5,19. يمكن لسمك الزرد تجديد عضلاته بعد اضطرابات طفيفة في الأنسجة ، مثل تلك الناجمة عن الاستئصال بالليزر أو جرح الطعنة20،21،22،23،24 ، ولكن ما إذا كان يمكن أن يتجدد عضل كامل بعد إصابة واسعة النطاق لا يزال غير معروف. ربما ترجع هذه الفجوة في المعرفة إلى عدم وجود نموذج مناسب للإصابة. يؤسس هذا البروتوكول نهجا جديدا للحث على إصابة واسعة النطاق للعضلات الهيكلية ، تمتد عبر عضلات متعددة. تعتمد طريقة الإصابة بالتبريد الموصوفة على التجميد السريع وذوبان الألياف العضلية باستخدام أداة من الفولاذ المقاوم للصدأ مبردة مسبقا. على الرغم من الأضرار الجسيمة ، لم تتأثر رفاهية الأسماك بشدة. يمكن استعادة الميوميرات بأكملها ، وبالتالي ، يوفر هذا العمل نظاما نموذجيا جديدا لدراسة آليات تجديد العضلات في الزرد البالغ.
أجريت هذه الدراسة بالاتفاق مع جميع اللوائح الأخلاقية ذات الصلة. تم تربية الزرد وتربيته وصيانته وفقا لإرشادات الاتحاد الأوروبي لجمعيات علوم المختبر (FELASA)25. تمت الموافقة على سكن الحيوانات وجميع الإجراءات التجريبية من قبل المكتب البيطري في كانتون فريبورغ ، سويسرا.
1. المعدات والإعداد
2. إجراء الإصابة بالتبريد العضلي
3. جمع السويقة الذيلية وتثبيتها
4. تركيب السويقة الذيلية
5. قطع المقاطع باستخدام cryostat
مراقبة الأسماك بعد الإصابة بالتبريد
لتحديد تأثير الإصابة بالتبريد العضلي على الحيوانات ، تم إجراء تسجيل فيديو للأسماك الضابطة والمصابة بالتبريد في 1 أيام بعد الإصابة بالتبريد (dpci) و 5 dpci. احتوت كل مجموعة على خمسة أسماك. عند 1 نقطة في البوصة ، كانت الأسماك المصابة بالتبريد تسبح بشكل أقل نشاطا ، لكنها لم تظهر أي حركات غير طبيعية ، مثل الدوران أو الالتفاف أو انخفاض التوازن (الفيديو 1). في نظام التربية ، كان وضعهم في الخزان وتناول الطعام مشابها لمواقع الأسماك غير المصابة. استمر السلوك الطبيعي طوال الأيام التالية ، كما يتضح من الفيديو عند 5 dpci (الفيديو 2). في الختام ، لم يؤثر إجراء الإصابة بالتبريد للسويقة الذيلية بشدة على رفاهية الحيوانات.
التحليل النسيجي لأقسام السويقة الذيلية
لتقييم مدى الإصابة ، تم اختيار النقطة الزمنية 4 dpci ، حيث يتم امتصاص حطام الألياف العضلية بالكامل في الجرح. لتحليل آثار الإصابة بالتبريد على طول المحاور الظهرية البطنية والأمامية الخلفية للجسم ، تم استخدام مجموعتين من الأسماك (أي الأقسام الإكليلية والمستعرضة للسويقة الذيلية ، على التوالي) (الشكل 1F).
تم تحليل الأقسام بواسطة تلطيخ ثلاثي الألوان يتكون من أزرق الأنيلين وحمض الفوشين والبرتقالي G (AFOG). باستخدام هذا المزيج من الكواشف ، تم عرض العضلات السليمة باللون البرتقالي ، والحبل الشوكي باللون الأحمر الداكن ، والمصفوفة الكولاجينية باللون الأزرق. لتحديد عدد العضل التالف ، وهي الوحدات metameric من العضلات السمكية ، تم تحليل سلسلة من الأقسام (الشكل 2). تم تحديد حدود العضل ، التي تسمى myocommata ، عن طريق ترسب الكولاجين ، كما تم اكتشافه بواسطة اللون الأزرق. تم تحديد المناطق المتضررة من خلال عدم وجود تلطيخ برتقالي. وكشف الفحص الدقيق للعينات ذات الميوكوماتا الواضحة أن ما يقرب من أربعة ميومرات متتالية قد تضررت، كما يستدل عليه من عدم وجود تلطيخ برتقالي (n، عدد الأسماك = 4; الشكل 3 أ ، أ '). كان الجانب غير المصاب من نفس السمكة بمثابة المرجع الداخلي.
لفحص عمق الجرح عموديا على محور الجسم ، تم تحضير مقاطع مستعرضة باستخدام الزرد عند 4 dpci و 7 dpci. تتوافق النقطة الزمنية الأخيرة مع تنشيط البرنامج العضلي ، وبالتالي بداية تجديد العضلات. أظهر تلطيخ AFOG لهذه العينات نقصا كبيرا في تلطيخ اللون البرتقالي في الجناح المصاب بالتبريد من الجسم ، مما أدى إلى ترسيم منطقة العضلات الهيكلية المتدهورة (الشكل 3B ، C). عند 4 dpci و 7 dpci ، امتدت منطقة الجرح الأنسجة من الجلد نحو الحاجز العمودي. يوضح هذا أن طريقة الإصابة بالتبريد استهدفت بعمق نصفا جانبيا من السويقة الذيلية ، والتي ظلت خالية من العضلات الوظيفية لمدة 7 أيام بعد العملية. مجتمعة ، تضررت أربعة عضل عميق على جانب واحد من السويقة الذيلية.
تحليل التألق المناعي للمقاطع المستعرضة
لتقييم ديناميكيات تجديد العضلات ، تم القتل الرحيم لمجموعات تجريبية من الأسماك عند 4 dpci و 7 dpci و 10 dpci و 30 dpci. تم تمييز المقاطع المستعرضة للسويقة الذيلية بواسطة تلطيخ مضان متعدد الألوان باستخدام Phalloidin (الذي يرتبط بالأكتين الخيطي [F-actin]) ، والجسم المضاد Tropomyosin-1 ، الذي يكتشف بروتين القطعة العضلية ، و DAPI ، الذي يسمي النوى. في جميع النقاط الزمنية ، يوفر النصف غير المصاب من الجسم رقابة داخلية. تم اكتشاف كل من F-actin و Tropomyosin 1 بقوة في أجزاء التحكم غير المصابة ، مما يشير إلى الأنسجة غير التالفة (الشكل 4).
عند 4 dpci ، احتوى الجانب المصاب من السويقة الذيلية على خلايا إيجابية DAPI وفيرة ، ولكن لوحظ القليل من التألق المناعي F-actin و Tropomyosin 1 ، مما يشير إلى منطقة الجرح ذات العضلات المتدهورة (الشكل 4A-B). عند 7 نقطة في البوصة ، يمكن اكتشاف Tropomyosin 1 و F-actin في جزء من الجرح بالقرب من خط الوسط الرأسي للجسم (الشكل 4C-D '). يحدد نمط التعبير هذا الموضع الذي يبدأ فيه تكوين ألياف عضلية جديدة في السويقة الذيلية. عند 10 نقطة في البوصة ، توسعت كلتا علامتي العضلات نحو سطح الجسم ، مما يشير إلى تقدم تجديد العضلات الهيكلية (الشكل 4E-F). عند 30 نقطة في البوصة ، أظهر كلا جانبي الجسم توزيعا مشابها لتلطيخ F-actin (الشكل 4G-H '). تشير هذه النتيجة إلى أن العضلات الهيكلية قد تم استعادتها بكفاءة بعد الإصابة بالتبريد للسويقة الذيلية.
الشكل 1: الإعداد التجريبي للإصابة البردية للعضل . (أ) أبعاد مسبار التبريد المصنع خصيصا والمصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ. يتكون الجزء البعيد من الأداة من ملعقة ذات حافة مقعرة على عمق 1 مم لحساب انحناء جسم الزرد. يتكون الجزء الأوسط من الأداة من أسطوانة تعمل كوزن وخزان للحفاظ على درجة حرارة منخفضة للملعقة أثناء الإجراء. الطرف القريب من الأداة على شكل مقبض معدني رفيع. (ب، ج) تخدير الأسماك البالغة على اسفنجة رطبة مع cryoprobe على السويقة الذيلية. كان المسبار في درجة حرارة الغرفة. (ب) يوضع هامش المسبار أفقيا بالقرب من السويقة الذيلية لعرض الحجم النسبي بين السمكة والأداة. (ج) بالنسبة للإصابة بالتبريد، يوضع طرف الأداة عموديا على السمكة. (د) رسم تخطيطي لإجراء الإصابة بالتبريد من الجانب البطني للأسماك لإظهار التلاعب بطريقة شاملة. تم تبريد المسبار المبرد مسبقا في النيتروجين السائل ووضعه على الفور على جانب واحد من السمكة لمدة 6 ثوان. (ه) في نقطة زمنية محددة بعد الإصابة بالتبريد ، تم القتل الرحيم للأسماك ، وتم جمع ساقيها الذيلية للتثبيت. (F) تمت معالجة المادة الثابتة نسيجيا وتقسيمها على طول المستويات الإكليلية أو المستعرضة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التحليل النسيجي للعضل التالف في السويقة الذيلية من الموضع الظهري إلى الوضع البطني للجسم. تلطيخ AFOG لسلسلة من الأقسام الإكليلية في 4 أيام بعد الإصابة بالتبريد (dpci). الأقسام من الظهرية باتجاه الجانب البطني ، كما هو موضح في الجزء العلوي من اللوحة الأولى والأخيرة. الأقسام غير متجاورة ، مع فاصل زمني يبلغ حوالي 150 ميكرومتر بينهما. يتم الكشف عن العضلات غير المصابة عن طريق تلطيخ العضلات باللون البرتقالي ، في حين أن الأنسجة المصابة تفتقر إلى هذا التلوين وتبدو رمادية (منطقة محاطة بخط متقطع). الأنسجة المحتوية على الكولاجين ، مثل الجلد ، ملطخة باللون الأزرق. يظهر الحبل الشوكي كهيكل يشبه القضيب وملطخ باللون الأحمر. عدد الأسماك ، ن = 4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تقييم عمق الإصابة في السويقة الذيلية باستخدام تلطيخ AFOG. (أ ، أ) القسم الإكليلي على مستوى الحبل الشوكي (قضيب أفقي مصبوغ باللون الأحمر). تظهر الصورة السفلية منطقة مكبرة محاطة بإطار في الصورة العلوية. تظهر حدود العضل المتسلسل كخطوط كولاجينية (زرقاء) موضوعة بشكل غير مباشر على الحبل الشوكي (أسهم حمراء في الصورة المكبرة A'). (ب، ج) تعرض المقاطع العرضية الجناح غير المصاب بعضلات ملطخة باللون البرتقالي والجناح المصاب بالتبريد مع تلطيخ رمادي. المنطقة المتضررة محاطة بخط أسود متقطع. يقسم الحاجز العمودي (الموضح بخط أحمر متقطع) الجسم إلى جوانب التحكم والإصابة بالتبريد. عدد الأسماك ، ن = 4 لكل نقطة زمنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الكشف المناعي عن البروتينات العضلية بعد الإصابة بالتبريد. تلطيخ مضان للمقاطع العرضية عند 4 dpci و 7 dpci و 10 dpci و 30 dpci ، كما هو موضح على الجانب الأيسر وأعلى الألواح (A-B'). عند 4 نقطة في البوصة ، يكون النسيج المصاب (المحاط بالخط المتقطع) إيجابيا ل DAPI (أزرق) ولكنه خال من تلطيخ Phalloidin (أخضر) أو النشاط المناعي Tropomyosin-1 (أحمر) ، مما يشير إلى تنكس ألياف العضلات بعد الإصابة بالتبريد. (C-D') عند 7 dpci ، تظهر كلتا علامتي العضلات تدريجيا في المنطقة المصابة ، مما يشير إلى عملية التجدد. يبدو التروبوميوسين -1 أكثر كثافة من F-actin في الألياف المشكلة حديثا. (إ-ف') عند 10 نقطة في البوصة ، تمتلئ منطقة الإصابة بألياف عضلية جديدة تظهر كثافة أعلى من النشاط المناعي للتروبوميوسين -1 مقارنة ب F-actin. (G-H') عند 30 نقطة في البوصة ، يتم الكشف عن نمط مماثل من الألياف العضلية في كلا جانبي الجسم. تشمل الإطارات في اللوحات A و C و E و H المساحات المكبرة في الصور المجاورة إلى اليمين. تم مسح القشور الجلدية ، المنبعثة من التألق خارج العضل ، من الصور باستخدام Adobe Photoshop. عدد الأسماك ، ن = 4 لكل نقطة زمنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يوفر الزرد كائنا نموذجيا للفقاريات لدراسة آليات تجديد العضلات. معظم طرق الإصابة الحالية ، مثل الاستئصال بالليزر أو جرح الطعنات ، تؤدي إلى اضطراب بسيط نسبيا في الأنسجة20،21،22،23. تم إجراء عمليات استئصال رئيسية على العضلات خارج العين26. ومع ذلك ، من المحتمل أن يكون هذا النهج الجراحي أقل ملاءمة للعضلات الجانبية بسبب المخاطر الصحية لقطع جدار الجسم. لتجنب مثل هذه الإجراءات الغازية ، يصف هذا البروتوكول شكلا أكثر اعتدالا من الإصابة التي ، مع ذلك ، تؤدي إلى أضرار جسيمة للسويقة الذيلية. يعتمد هذا النهج على التلاعب السطحي الذي يسمح بالاستهداف الدقيق للغاية لعدد قليل من العضل على جانب واحد من الجسم. تكمن نقاط القوة في نموذج الإصابة بالتبريد في قابليته للتكاثر وقدرته على إنتاج تنكس عضلي واسع النطاق. بناء على نقاط القوة هذه ، يوفر هذا النموذج مسارا جديدا لدراسة كيفية تفاعل الجسم مع فقدان العضلات بشكل كبير.
يؤدي تطبيق البرد الشديد إلى صدمة حرارية تدمر غشاء البلازما والعضيات في الأنسجة العضلية المصابة27. نتيجة لذلك ، تخضع الألياف العضلية المصابة لموت الخلايا "العرضي"28. وبالتالي ، يمكن امتصاص الأنسجة التالفة بواسطة الآليات الطبيعية لإزالة الجرح. يتحمل الزرد إجراء الإصابة بالتبريد جيدا ، حيث كان معدل البقاء على قيد الحياة في هذه الدراسة ما يقرب من 100٪ ، نظرا لأن المسبار المبرد مسبقا تم وضعه بشكل صحيح على الجسم طوال المدة المحددة. ومع ذلك ، إذا كان الجرح واسعا جدا (على سبيل المثال ، إذا تم تطبيق الكثير من الضغط أو كانت مدة الإصابة بالتبريد طويلة جدا) ، فقد تظهر الأسماك حركات سباحة شاذة بعد فترة وجيزة من الإجراء ، ويجب القتل الرحيم للحيوان كنقطة نهاية إنسانية. بالنسبة لأنواع الأسماك الأخرى ، يجب ضبط وقت التعرض للمسبار بالتبريد وفقا لحجم الجسم.
بعد الإصابة بالتبريد ، يمكن للأسماك استئناف نشاط السباحة دون أي أعراض لحركة غير طبيعية. ومع ذلك ، فإن الأسماك المصابة بالتبريد تسبح بشكل أقل ديناميكية من الأسماك الضابطة ، مما يشير إلى بعض الإعاقات الخفيفة. سيكون من الضروري إجراء مزيد من القياس الكمي لسلوك الأسماك في نقاط زمنية مختلفة بعد الإصابة بالتبريد لتحديد التغيرات الزمنية في أداء السباحة.
لا يزال يتعين توضيح تأثير طريقة الإصابة بالتبريد على الأنسجة غير العضلية الأخرى للسويقة الذيلية. من الواضح أن الطبقة الخارجية من الجسم (أي الجلد) تالفة بسبب الإجراء. في هذا السياق ، يمكن أن توفر طريقة الإصابة بالتبريد استراتيجية جديدة لدراسة التئام الجروح وتجديد القشور واستعادة نمط التصبغ. علاوة على ذلك ، يمكن أن تتأثر الأوعية الدموية وتعصيب العضل أيضا بالإصابة بالتبريد ، وتتطلب هذه الموضوعات مزيدا من التحقيق.
تم استخدام نموذج الإصابة بالتبريد سابقا للتحقيق في تجديد قلب الزرد13،14،15،29. أظهرت هذه الطريقة بعض المزايا مقارنة بطريقة استئصال البطين10 بسبب الترسب العابر لندبة غنية بالكولاجين ، والتي تحاكي بشكل أفضل استجابة الشفاء من الاحتشاء لدى البشر30. بشكل ملحوظ ، يمكن لسمك الزرد تجديد قلبه بعد إصابات التبريدالمتعددة 31. ومن المثير للاهتمام ، تم تطبيق الإصابة بالتبريد أيضا على زعنفة الزرد ، مما أدى إلى عمليات تحلل الأنسجة12. على عكس بتر الزعنفة الكلاسيكي ، يحتوي الجذع المتبقي المصاب بالتبريد على هامش مشوه بمزيج من المواد الميتة والخلايا السليمة. كشفت الدراسات التي أجريت على كل من أعضاء الزرد ، القلب والزعنفة ، عن القدرة القوية لسمك الزرد على استعادة مكوناتها الوظيفية الأصلية حتى بعد تلف الأنسجة على نطاق واسع. ما إذا كانت العضلات الهيكلية المصابة بالتبريد تنشط التفاعل بين العمليات التعويضية والتجديدية تستدعي دراسات مستقبلية.
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
نشكر V. Zimmermann على رعاية الأسماك ، وكذلك الدكتور توماس بيز ، والدكتورة كاثرين فيفرلي ، وليا جيجون على بدء هذا المشروع ونتائجهم الأولية. تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم ، رقم المنحة 310030_208170.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Program | |||
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
Photoshop Version 23.5.3 | Adobe | ||
Material/ Equipment | |||
35/10 mm Petri Dish | Greiner Bio-one | Item No.: 627102 | |
Camera | Sony | / | HDR-PJ410 |
Cryostat | Histcom | HRA C50 | |
Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 | |
Macro 50 mm f/2.8 EX DG lens | Sigma | / | Discontinued lense |
Peel-A-Way Embedding Truncated Molds T8 | Polyscience, Inc. | 18985 | |
Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Sponge | any | any | flat sponge, c.a. 7cm x 3 cm x 1 cm |
Stainless steel cryoprobe | Custom-made | / | specifics in the article |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
Surgical scissors | Any | / | |
TCS SP2 | Leica | / | Discontinoued product |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 | |
Dyes and Antibodies | |||
Dapi | Sigma | 10236276001 | Concentration: 1/2000 |
Phalloidin-Atto-565 (F-actin) | Sigma | 94072 | Concentration: 1 / 500 |
Tropomyosin (TPM1) | DHSB | CH1 | Concentration: 1 / 50 |
Recipies/Solutions | |||
1x PBS | 123 mM NaCl | Sigma | |
2.7 mM KCl | Sigma | ||
10 mM Na2HPO4 | Sigma | ||
1.8 mM KH2PO4 | Sigma | ||
AFOG solution | 3 g Fuchsin | Fisher Scientific | |
2 g Orange G | Sigma | ||
1 g Anilin blue | Fulka AG | ||
200 ml acifidied distilled H2O (pH 1.1) |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved