ゼブラフィッシュ成体における尾柄の骨格筋再生研究のための凍結損傷モデル

要約

このプロトコルは、成体ゼブラフィッシュにおけるいくつかの尾側筋腫の深刻な損傷を誘発するための凍結損傷モデルについて説明しています。この方法は、非哺乳類脊椎動物の重度の組織喪失後の骨格筋再生を研究するための新しいアプローチを提供します。

要約

骨格筋は、軽傷を負った後、衛星様幹細胞の活性化により再生と回復を遂げます。筋肉組織の重傷はしばしば人間の線維症を引き起こします。哺乳類と比較して、ゼブラフィッシュは臓器再生のためのより高い生来の能力を持っており、臓器への広範な損傷後の組織修復を研究するための強力なモデルを提供します。ここでは、凍結損傷モデルが、成体のゼブラフィッシュの尾柄の4つの筋腫に深刻な損傷を誘発することが説明されています。カスタムメイドのクライオプローブは、体型にフィットし、皮膚から正中線までの外側の筋肉組織を再現性よく傷つけるように設計されています。重要なことに、体の完全性は損なわれず、魚は水泳活動を続けました。骨格筋の変化は、組織切片上のサルコメアタンパク質の組織学的染色および蛍光染色によって評価された。この方法は、骨格筋の変性がどのように修復反応を誘発し、したがって成体ゼブラフィッシュの筋原性プログラムの再活性化を促進するかを理解することを目的とした新しい研究の道を開くでしょう。

概要

脊椎動物では、さまざまな組織の損傷した部分が生涯にわたって恒常性の再生と回復を受けます。再生および回復のためのこの能力は、典型的には、コンピテント幹細胞の存在または成熟細胞の増殖能力に依存する^1,2。骨格筋は、サテライト細胞と呼ばれる局所幹細胞に関連する有糸分裂後筋線維を含む^3,4,5,6。したがって、この組織は、中断された連続性の領域を効率的に密封するため、または軽度の創傷を修復するための細胞源を含む。しかし、哺乳類の骨格筋におけるより大きな体積損失の後には、線維症などの非再生的修復が続く^{ことがよくあります7。}動物モデルは、広範囲に損傷した臓器の再生を促進する生物学的メカニズムに関する新しい洞察を提供する可能性があります。

ゼブラフィッシュは、高い再生能力を持つ定評のあるモデル生物です。成体のゼブラフィッシュは、尾鰭の切断された部分または心室の切除された頂点を再生することができます^8,9,10,11。さらに、凍結損傷法は、ゼブラフィッシュのひれと心臓の再生を研究するために以前に適用されています¹²、¹³、^14、15。内臓の場合、凍結損傷法は、臓器の完全性を破壊することなく細胞死を誘導し、生理学的条件を模倣するという利点を有する^16,17。組織破片は、創傷治癒中の自然なクリアランスによって崩壊し、その後修復プロセスが続きます。しかし、この方法を骨格筋に適用できるかどうかは、まだ確立されていません。

魚では、横方向の筋肉組織は水泳中に体幹を左右に曲げることを可能にします¹⁸。骨格筋は、^{結合組織5,19}によって分離されたミオメアと呼ばれるメタメリックユニットに編成されています。ゼブラフィッシュは、レーザーアブレーションや刺し傷20,21,22,23,24によって引き起こされるような軽微な組織破壊の後に筋肉を再生することができますが、広範囲の損傷後に筋腫全体が再生できるかどうかは不明です。この知識のギャップは、おそらく適切な傷害モデルの欠如によるものです。このプロトコルは、複数の筋腫にまたがる骨格筋の広範な損傷を誘発するための新しいアプローチを確立します。記載された凍結損傷方法は、予冷されたステンレス鋼器具による筋線維の急速凍結および融解に基づいている。甚大な被害にもかかわらず、魚の健康はひどく損なわれませんでした。筋腫全体が復元される可能性があり、したがって、この研究は、成体のゼブラフィッシュの筋肉組織再生のメカニズムを研究するための新しいモデルシステムを提供します。

プロトコル

この研究は、関連するすべての倫理規則に同意して実施されました。ゼブラフィッシュは、欧州実験動物科学協会連盟(FELASA)のガイドライン²⁵に従って飼育、飼育、維持されました。動物の飼育とすべての実験手順は、スイスのフリブールの州獣医事務所によって承認されました。

1.機器とセットアップ

1. 研究用の機器を製造できる技術ワークショップでステンレス鋼クライオプローブの製造を手配します。
   注意: 特定の寸法の機器の設計を提供します(図1A)。
2. 手順中のプローブの取り扱い中に凍傷を避けるために、ハンドルをピペットチップに挿入し、テープで包みます。
3. 麻酔作業液用のビーカー、魚を扱うためのスプーン、湿ったスポンジ、および処置後に魚が回復するようにシステム水の入ったタンクを準備します。
4. すべての実験の前に、作業溶液を新たに準備してください。作業溶液を調製するには、ビーカー内の4 mLのシステム水に100 mLのトリカイン原液を加えます。
   注:麻酔ストック溶液は、4 mLの蒸留水に溶解した980 gのトリカインで構成されています。1 M Tris-HCl、pH 9でpHを7に調整した後、蒸留水で溶液を1 Lまで満たします。原液は光に敏感で、琥珀色のボトルに4°Cで保存する必要があります。

2.筋肉凍結損傷の手順

1. プローブを液体窒素に最低3分間浸すことから手順を開始します。スポンジをシステム水で濡らし、平らな面に置きます。
2. 1匹の成体のゼブラフィッシュをトリカイン作業溶液に移し、1分または2分後にスプーンで魚にそっと触れて反応しないことを確認します。魚がまだ反応している場合は、もう少し待ちます。
3. 麻酔をかけた魚を濡れたスポンジの上に置きます。尾柄を臀鰭の後方、尾鰭の前に配置します。
4. 液体窒素からクライオプローブを取り外します。プローブを軽く振って、先端に液体窒素が残っていないことを確認します。
5. へらの端を尾柄の体に垂直に置きます(図1C)。圧力をかけずにプローブをこの位置に6秒間保持します(図1D)。
   注意: クライオプローブの重量は、機器と組織との接触を確保するのに十分です。
6. 組織からクライオプローブを解放し、システム水を入れたタンクに魚を移します。
7. 麻酔から目覚めた後、呼吸と水泳を再開する間、魚を監視します。30秒経っても手術運動が起こらない場合は、動物が自分で呼吸を開始するまで、システムの水をえらにピペッティングして魚を刺激します。
   注意: 魚は回収タンクで数分以内に泳ぎを再開する必要があります。
   注:次の日には、魚を撮影して水泳活動を監視することができます(ビデオ1 および ビデオ2)。ビデオ録画の前に、コントロールと負傷した魚を半透明の交配タンクに移し、少なくとも1分間慣れさせます。

3.尾柄の収集と固定

1. その後のアッセイに適した2 mLの4%ホルマリンまたはその他の固定液、シャーレ、鉗子、および外科用はさみを準備します。
2. 凍結損傷後の選択された時点で、地域の獣医事務所によって与えられた法的許可に従って魚を安楽死させます。
   注:安楽死は、トリカイン溶液(300 mg / L)を約10分間過剰摂取することによって行われます。えらの動きの喪失と尾びれのつまみ反射は死を確認します。安楽死の時点は、再生の段階に応じて選択する必要があります:たとえば、凍結損傷後1日(dpci)から創傷クリアランスの3 dpciまで。筋肉再生の開始のための3 dpciから10 dpci;再生を進めるための10 dpciから30 dpciまで。そして組織修復の完了のために30 dpciの後。したがって、筋肉の変性と再生のさまざまなステップと生物学的プロセスを評価するには、凍結損傷後のさまざまな時点で魚のグループを安楽死させる必要があります。
3. 安楽死させた魚を脱イオン水の入ったペトリ皿に入れます。はさみを使用して、尾柄の前後に体を切断します(図1E)。シャーレの脱イオン水で組織を出血させます。
4. 尾柄を収集し、鉗子でマイクロ遠心チューブ内の準備した固定液に移します。
   注意: チューブを数回慎重に反転させ、4°Cで一晩保持します。

4.尾柄の取り付け

1. 固定した組織を1x PBSでロッカーで10分間洗浄します。次に、4°Cの脱イオン水中で予冷した30%スクロースを入れた2 mLのマイクロ遠心チューブに移し、チューブを数回静かに反転させます。微量遠心チューブを4°Cで24時間以上直立させておきます。
   注意: 尾柄はスクロース溶液の上に浮かび、組織が脱水するにつれて沈み始めます。
2. 埋め込み型に O.C.T. 封入剤の 5 mm 層を充填します。鉗子を使用して、培地の尾柄を調整します。金型の下部に配置し、横断セクションまたは冠状セクションの向きを調整します(図1F)。
3. ドライアイスの箱で培地を凍らせます。組織が希望の位置に安定したらすぐに、O.C.T.が完全に凍結する前に金型の残りの部分を充填します。金型は-80°Cで最低1時間保管してください。
   注:これらの条件下では、組織は何ヶ月も保存することができます。

5.クライオスタットで切片を切断する

1. 切断厚さ25μmのクライオスタットを設置します。チャンバー温度を-26°C、試験片温度を-24°C、切断角度を12°に調整します。
2. 凍結したブロックを検体と一緒にクライオスタットに入れ、ブロックの底と平行に切断するためにその向きを固定します。試料に到達するまで切断し、ブロックをトリミングしてサンプルの収集を容易にします。
3. 6枚の接着スライドを用意します。サンプルの反復を準備するために、スライドに連続した番号でラベルを付けます。
4. 切断を開始し、ラベル付けされた接着スライド上の組織切片を収集します。さらなる実験的要求に従ってスライド上のセクションを配置します。
5. スライドを室温で1時間乾燥させます。-20°Cの密閉箱に保管してください。
   注意: スライドは、この状態で最大1年間安全に保管できます。

ディスカッション

ゼブラフィッシュは、筋肉再生のメカニズムを研究するためのアナムニオテ脊椎動物モデル生物を提供します。レーザーアブレーションまたは刺し傷などの既存の損傷方法のほとんどは、比較的軽微な組織破壊をもたらす^20、21、^22、23。外眼筋²⁶では大切除が行われている。しかし、この外科的アプローチは、体壁を切断することによる健康被害のため、おそらく外側の筋肉組織にはあまり適していないでしょう。このような侵襲的な処置を避けるために、このプロトコルは、それにもかかわらず、尾柄に深刻な損傷をもたらす、より軽度の損傷について説明しています。このアプローチは、体の片側にあるいくつかの筋腫を非常に正確に標的にすることを可能にする表面的な操作に依存しています。凍結損傷モデルの強みは、その再現性と広範な筋肉変性を引き起こす能力にあります。これらの強みに基づいて、このモデルは、体が重大な筋肉の喪失にどのように反応するかを研究するための新しいパスを提供します。

極端な寒さの適用は熱ショックを引き起こし、それは影響を受けた筋肉組織の原形質膜および細胞小器官を破壊する²⁷。その結果、損傷した筋線維は「偶発的な」細胞死を経験します²⁸。その結果、損傷した組織は、創傷クリアランスの自然なメカニズムによって再吸収され得る。ゼブラフィッシュは、予冷されたプローブが正確な期間にわたって体に正しく配置されていたため、この研究の生存率はほぼ100%であったため、凍結損傷手順によく耐えます。ただし、傷が広すぎる場合(たとえば、圧力をかけすぎたり、凍結損傷の持続時間が長すぎたりした場合)、魚は手順の直後に異常な水泳運動を示す可能性があり、動物は人道的なエンドポイントとして安楽死させる必要があります。他の魚種の場合、クライオプローブへの曝露時間は体のサイズに応じて調整する必要があります。

凍結損傷後、魚は異常な動きの症状なしに水泳活動を再開することができます。ただし、凍結損傷を受けた魚は、対照魚よりも動的に泳ぐことができず、軽度の障害を示しています。凍結損傷後のさまざまな時点での魚の行動のさらなる定量化は、水泳パフォーマンスの時間的変化を決定するために必要になります。

尾柄の他の非筋肉組織に対する凍結損傷法の効果はまだ解明されていません。明らかに、最も外側の体層(すなわち、皮膚)は、処置によって損傷を受ける。これに関連して、凍結損傷法は、創傷治癒、スケール再生、および色素沈着パターンの回復を研究するための新しい戦略を提供することができます。さらに、筋腫の血管系と神経支配も凍結損傷の影響を受ける可能性があり、これらのトピックはさらなる調査が必要です。

凍結損傷モデルは、ゼブラフィッシュの心臓再生を調査するために以前に使用されてきました¹³、^14、15、29。この方法は、コラーゲンに富む瘢痕の一過性の沈着のために心室切除方法¹⁰と比較していくつかの利点を示し、これはヒトにおける梗塞治癒応答をよりよく模倣する³⁰。驚くべきことに、ゼブラフィッシュは複数の凍結損傷の後に心臓を再生することができます³¹。興味深いことに、凍結損傷はゼブラフィッシュヒレにも適用されており、組織溶解プロセスをもたらしています¹²。古典的なひれ切断とは対照的に、残りの凍結損傷した切り株には、死んだ物質と健康な細胞の混合物で歪んだマージンが含まれています。ゼブラフィッシュの臓器である心臓とヒレの両方を用いた研究は、大規模な組織損傷の後でも元の機能成分を回復するゼブラフィッシュの強力な能力を明らかにしました。凍結損傷した骨格筋が修復プロセスと再生プロセスの間の相互作用を活性化するかどうかは、将来の研究を保証します。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Program
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)
Photoshop Version 23.5.3	Adobe
Material/ Equipment
35/10 mm Petri Dish	Greiner Bio-one	Item No.: 627102
Camera	Sony	/	HDR-PJ410
Cryostat	Histcom	HRA C50
Formaldehyde ~36%	Sigma-Aldrich	47630
Macro 50 mm f/2.8 EX DG lens	Sigma	/	Discontinued lense
Peel-A-Way Embedding Truncated Molds T8	Polyscience, Inc.	18985
Slides Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15
Sponge	any	any	flat sponge, c.a. 7cm x 3 cm x 1 cm
Stainless steel cryoprobe	Custom-made	/	specifics in the article
Sucrose	Sigma-Aldrich	84100
Surgical scissors	Any	/
TCS SP2	Leica	/	Discontinoued product
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura Finetek	4583
Tricaine (Anestethic)	Sigma	E10521
Dyes and Antibodies
Dapi	Sigma	10236276001	Concentration: 1/2000
Phalloidin-Atto-565 (F-actin)	Sigma	94072	Concentration: 1 / 500
Tropomyosin (TPM1)	DHSB	CH1	Concentration: 1 / 50
Recipies/Solutions
1x PBS	123 mM NaCl	Sigma
	2.7 mM KCl	Sigma
	10 mM Na2HPO4	Sigma
	1.8 mM KH2PO4	Sigma
AFOG solution	3 g Fuchsin	Fisher Scientific
	2 g Orange G	Sigma
	1 g Anilin blue	Fulka AG
	200 ml acifidied distilled H2O (pH 1.1)