في هذا البروتوكول ، نناقش تنفيذ نموذج لزراعة الكبد التقويمية الناجحة (OLT) في الفئران. بالإضافة إلى ذلك ، تتم مناقشة المواد المساعدة لمزيد من تحليل سالكية الطعم الخيفي بعد نجاح OLT في الماوس ، وتحديدا باستخدام فحوصات التصوير المقطعي المحوسب (microCT).
تصوير الأوعية بالتصوير المقطعي المجهري (microCT) هو مورد لا يقدر بثمن للباحثين. سمحت التطورات الجديدة في هذه التكنولوجيا بالحصول على صور عالية الجودة للأوعية الدموية الدقيقة وهي أدوات عالية الدقة في مجال زراعة الأعضاء. في هذا النموذج من زراعة الكبد التقويمية (OLT) في الفئران ، يتيح microCT الفرصة لتقييم مفاغرة الطعم الخيفي في الوقت الفعلي وله فائدة إضافية تتمثل في عدم الاضطرار إلى التضحية بالحيوانات الدراسية. يؤدي اختيار التباين ، بالإضافة إلى إعدادات الحصول على الصور ، إلى إنشاء صورة عالية الدقة ، مما يمنح الباحثين معلومات لا تقدر بثمن. وهذا يسمح بتقييم الجوانب التقنية للإجراء بالإضافة إلى تقييم العلاجات المختلفة على مدى فترة زمنية طويلة. في هذا البروتوكول ، نقوم بتفصيل نموذج OLT في الفئران بطريقة تدريجية وأخيرا نصف بروتوكول microCT الذي يمكن أن يعطي صورا عالية الجودة ، مما يساعد الباحثين في التحليل المتعمق لزراعة الأعضاء الصلبة. نحن نقدم دليلا خطوة بخطوة لزراعة الكبد في الماوس ، بالإضافة إلى مناقشة موجزة لبروتوكول لتقييم سالكية الكسب غير المشروع من خلال تصوير الأوعية بالأشعة المقطعية الدقيقة.
الزرع هو العلاج الفعال الوحيد لمرض الكبد في المرحلة النهائية. لا يمكن إنكار أن فائدة زراعة الكبد ممتازة ، حيث يبلغ متوسط البقاء على قيد الحياة 11.6 سنة مقابل 3.1 سنة في قائمة الانتظار1. ومع ذلك ، هناك قيود كبيرة تحد من التطبيق الواسع لزراعة الكبد ، وتشمل الأهم من ذلك ، نقص الأعضاء المانحة المناسبة وعالية الجودة. وبالتالي ، سيتطلب توسيع مجموعة الأعضاء المانحة استراتيجيات مبتكرة تسمح باستخدام الطعم الخيفي الذي يعتبر حاليا غير مناسب اليوم ، مما يزيد من هامش الأمان للزرع. لذلك ، لتحسين الوصول إلى زراعة الكبد ، لا بد من إجراء دراسات قبل السريرية في الصغيرة.
أهمية خاصة لأبحاث زرع الأعضاء هي في الجسم الحي نماذج من زرع. زرع الكبد التقويمي للفأر (OLT) موجود منذ ما يقرب من 30 عاما2 وهو أمر حيوي لدراسة العديد من جوانب الزرع ، بما في ذلك توصيف الاستجابات المناعية ، وإصابة نقص التروية ، والرفض الحاد ، والآثار العلاجية للعوامل الجديدة ، والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل3،4،5،6،7. يعد استخدام الفئران لدراسة الزرع أمرا حيويا لأنه يسمح باستخدام خطوط الفئران المعدلة وراثيا لدراسة تأثير مسارات جزيئية محددة على نتائج الزرع. تم وصف البروتوكولات المعمول بها لزراعة كبد الفأر بشكل جيد سابقا 8,9.
توجد طرق متعددة للمفاغرة للوريد الأجوف السفلي فوق وتحت الكبد (IVC) والوريد البابي (PV) والقناة الصفراوية المشتركة (CBD). يعتمدون عادة على مفاغرة اليد أو تقنية الكفة الوعائية المعدلة المشابهة لزراعة رئة الفئران10،11،12. خطوة مهمة في الدراسة طويلة الأجل وبقاء الفئران المتلقية ، بالإضافة إلى تطوير برنامج مستدام لزراعة كبد الفأر ، هي القدرة على تقييم هذه المفاغرة الحرجة. غالبا ما تعتمد طرق التصوير لتقييم سالكية الطعم الخيفي للكبد على الموجات فوق الصوتية والتصوير المقطعي المحوسب (CT) في الإعداد السريري13,14. يتمتع التصوير المقطعي المحوسب بميزة واضحة على الموجات فوق الصوتية حيث يمكن أن يوفر مناظر للبطن بالكامل لتشمل كل مفاغرة ، على الرغم من أن الحصول على هذه المشاهدات بالموجات فوق الصوتية قد يكون صعبا بشكل خاص في الصغيرة. تم تخصيص أبحاث وموارد كبيرة لتطوير التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لغرض تعزيز الدراسات على والمعلومات التي يمكننا جمعها من هذه النماذج للإصابة والمرض15،16. نصف هنا بروتوكولا لزراعة كبد الفأر التقويمي (الشكل 1) ونصف بإيجاز بروتوكولا للتصوير المقطعي المحوسب لتقييم سالكية الطعم الخيفي ومتانة المفاغرة.
تم إيواء ذكور الفئران C57BL / 6J (30 جم من وزن الجسم) في ظروف خالية من مسببات الأمراض في مرفق بمستشفى الأطفال الوطني. تم تنفيذ جميع الإجراءات بشكل إنساني وفقا للمعاهد الوطنية للصحة ودليل المجلس القومي للبحوث للرعاية الإنسانية واستخدام المختبر وبموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في مستشفى الأطفال على الصعيد الوطني (بروتوكول IACUC AR17-00045). راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والأدوات والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. الإعداد الأولي لجراحة زرع الأعضاء
2. شراء الفئران المانحة
3. إعداد الجدول الخلفي من الطعم الخيفي الكبد
4. عملية المستلم
ملاحظة: بما أن هذه عملية معقمة، استخدم القفازات ومعدات الحماية الشخصية المناسبة وتناول المضادات الحيوية. تطبيق 0.1 ملغ/ كغ من البوبرينورفين تحت الجلد كتسكين قبل الجراحة وقت الجراحة.
5. تصوير الأوعية المجهرية للفأر
بالنسبة لأولئك الباحثين الذين ليسوا جراحين ، أو ليسوا على دراية بالتشريح ، أو غير مرتاحين لتفسير النتائج الإشعاعية ، يجب إجراء تحليل مناسب للصور من قبل موظفين لديهم تدريب مناسب. يظهر نجاح OLT في الماوس في البروتوكول أعلاه. علاوة على ذلك ، لتعزيز مقاييس الدراسة وتقديم ملاحظات في الوقت الفعلي لنجاح عملية الزرع ، وكذلك القضاء على الحاجة إلى التشريح ، يمكن استخدام فحص تصوير الأوعية بالأشعة المقطعية الدقيقة لتوفير صور دقيقة وواضحة. الصور التمثيلية مضمنة في هذه المخطوطة (الشكل 11). يمكن رؤية صور تمثيلية للمفاغرة الفاشلة في الجسم الحي في الشكل 12.
يمكن لأولئك المطلعين على التشريح الكبدي والأوعية الدموية رؤية مفاغرة وريدية براءة اختراع من IVC. في بعض الحالات ، يمكن تصور الوريد البابي أيضا ، والذي يتم بسهولة في هذا النموذج بسبب صفعة الوريد البابي. يشير عرض المفاغرة المفتوحة إلى النجاح التقني للعملية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن توفر إعادة بناء 3D لهذه الصور معلومات إضافية للباحثين وصورة أكثر تفصيلا لتشريح الأوعية الدموية. باستخدام هذا النموذج أعلاه ، فإن معدل الوفيات في مجموعة الفئران OLT هو ~ 40-45٪.
الشكل 1: نظرة عامة على زراعة الكبد التقويمية. (أ) رسم بياني يصور المفاغرة الأربعة المختلفة: أ) مفاغرة IVC فوق الكبدية ، ب) مفاغرة IVC تحت الكبد ، ج: مفاغرة الوريد البابي ، د) مفاغرة القناة الصفراوية المشتركة. يشير كل سهم إلى موقع نسبي للمكان الذي يجب أن يكون فيه الوعاء أو القناة IVC فوق الكبدي (خطوة البروتوكول 2.13) ، IVC تحت الكبد (خطوة البروتوكول 2.11) ، الوريد البابي (خطوة البروتوكول 2.10) ، والقناة الصفراوية المشتركة (خطوة البروتوكول 2.7). ب: مخطط مفاغرة في الجسم الحي . شريط المقياس = 2 مم. اختصار: IVC = الوريد الأجوف السفلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الأدوات الجراحية المستخدمة في الجراحة. (أ) ملقط دقيق 45 درجة ، (B-E) ملقط دقيق ، (F) حامل إبرة منحني / ملقط ، (G) ملقط مستقيم ، (H) تطبيق مشبك الأوعية الدموية ، (I) مرقئ ، (J) حامل إبرة ، (K) جهاز كي كهربائي ، (L) شفرة # 11 ، (M) مبعدة للبطن ، (N ، O) مقص دقيق ، (P) مقص ناعم ، (Q) مقص جراحي ، (R ، S) مشابك Yasargil ، (T) مشبك الوريد البلدغ ، (U) المشبك الأوعية الدموية الدقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: سوار الوريد البابي ودعامة القناة الصفراوية. صورة خارج الجسم الحي للدعامات والأصفاد قبل الاستخدام. شريط المقياس = 3.5 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: دعامات القناة الصفراوية الشائعة أثناء عملية المتبرع. أ: إدخال دعامة القناة الصفراوية في القناة الصفراوية المشتركة. (ب) دعامة القناة الصفراوية المثبتة داخل القناة الصفراوية. شريط المقياس = 2 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: وضع الكفة الوريدية البابية أثناء تحضير الطعم الخيفي الكبدي على الطاولة الخلفية. أ: خيط الوريد البابي عبر الكفة الوريدية. (ب) الوريد المقطوع فوق الكفة. شريط المقياس = 2 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: مفاغرة الوريد البابي أثناء عملية المتلقي. (أ) إدخال الكفة الوريدية في الوريد البابي المتلقي. ب: مفاغرة الوريد البابي مثبتة بالخيط. شريط المقياس = 2 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: مفاغرة IVC فوق الكبدية أثناء العملية المتلقية. (أ) اكتمل الجدار الخلفي للمفاغرة. (ب) مفاغرة SHIVC المكتملة. شريط المقياس = 2 مم. الاختصارات: IVC = الوريد الأجوف السفلي. SHIVC = IVC فوق الكبد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: مفاغرة IVC تحت الكبد أثناء عملية المتلقي. (أ) اكتمل الجدار الخلفي للمفاغرة. (ب) مفاغرة IHIVC المكتمل. شريط المقياس = 2 مم. الاختصارات: IVC = الوريد الأجوف السفلي. IHIVC = IVC تحت الكبد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: مفاغرة القناة الصفراوية الشائعة أثناء عملية المتلقي. أ: وضع دعامة القناة الصفراوية داخل القناة الصفراوية المشتركة المتلقية. ب: تأمين مفاغرة القناة الصفراوية. شريط المقياس = 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 10: تصوير الأوعية بالأشعة المقطعية الدقيقة للفأر تحضير. أ: حقن وريد ذيل الفأر لإدارة التباين. (ب) تمرير الفأر عبر جهاز التصوير المقطعي المحوسب الدقيق. اختصار: microCT = التصوير المقطعي المحوسب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 11: صور تمثيلية توضح تصوير الأوعية بالتصوير المقطعي المحوسب الدقيق لسالكية الطعم الخيفي. (أ ، ب) يمكن رؤية التباين في جميع أنحاء IVC ، مما يدل على سالكية مفاغرة فوق الكبد وتحت الكبد. (ج) التباين في الوريد البابي ، مما يدل مرة أخرى على المباح. د: 3D إعادة بناء الأوعية الدموية. الاختصارات: microCT = التصوير المقطعي المحوسب ؛ IVC = الوريد الأجوف السفلي ؛ PV = الوريد البابي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 12: صور تمثيلية تظهر مفاغرة فاشلة في الجسم الحي . (أ) فشل مفاغرة الوريد البابي بسبب تشوه الوريد مما يؤدي إلى نقص تدفق الدم. ب: فشل مفاغرة IVC فوق الكبدية بسبب النزيف المفرط. شريط المقياس = 2 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم وصف OLT في القوارض بشكل جيد في الأدبيات2،8. لإجراء هذا الإجراء الذي يتطلب الكثير من الناحية الفنية ، غالبا ما تكون هناك حاجة إلى عدة سنوات من الجراحة المجهرية (أو الجراحة بشكل عام) لأن هذا ينطوي على فهم قوي للتشريح والقدرة التقنية. في تطوير هذا النموذج ، واجهنا العديد من المشكلات الفنية التي تدور جميعها حول المفاغرة. خاصة مع مفاغرة PV ، غالبا ما يكون من الصعب تثبيت الوريد لمفاغرة. لقد وجدنا أن وضع واحد أو اثنين من الغرز (تفضيل الجراح) يساعد في تسهيل وضع الكفة. وتجدر الإشارة إلى أن وضع المزيد من الغرز يزيد من وقت الجراحة.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن SHIVC عميق داخل تجويف البطن ويصعب وضع مشبك عليه لإعطاء التعرض الكافي. لقد وجدنا أنه إذا كان الماوس مسترخيا قدر الإمكان في ضبط النفس ، فإن ذلك سيضيف إلى مرونة الوريد. في النهاية ، سيكون الأمر متروكا للجراح لتحديد الموضع المناسب مع الممارسة. علاوة على ذلك ، مع مفاغرة CBD ، تكون القناة مرة أخرى حساسة للغاية. قد يكون من الصعب وضع خيوط البقاء لتثبيت القناة ، وربما يساعد وضعها على قطعة صغيرة من الشاش في تثبيتها. أخيرا ، نظرا لأن جميع الثدييات الصغيرة حساسة بشكل فريد فيما يتعلق بوقت التخدير ، فمن المهم إجراء الجراحة في أسرع وقت ممكن. الأوقات الجراحية المثالية هي كما يلي: 1) عملية مانحة ، 45-60 دقيقة. 2) إعداد الجدول الخلفي ، 15 دقيقة ؛ 3) عملية المستلم ، 60-80 دقيقة. الممارسة سوف تساعد في تقليل الحركة الضائعة.
مع تقدم النماذج الحيوانية ، تقدمت أيضا القدرة على تقييم نجاح التدخلات الدراسية. تم استخدام MicroCT لأول مرة لإجراء دراسات حول الأوعية الدموية في الفئران في أواخر تسعينيات القرن العشرين17. هناك العديد من التحديات لإجراء دراسات تصوير الأوعية المجهرية الدقيقة والواضحة في القوارض. ومع ذلك ، فإن معظم التحديات تنشأ من دورات القلب والجهاز التنفسي القصيرة لهذه الثدييات. يتم التغلب على ذلك باستخدام التعرضات القصيرة للحد من آثار الحركة بالإضافة إلى ارتفاع معدلات طلاقة الفوتون18. بشكل عام ، وجدنا أن استخدام بوابات القلب ، وكذلك تعديل تركيزات الأيزوفلوران لتقليل معدل التنفس ، أنتج أوضح الصور. لقد وجدنا أيضا أن استخدام توقيت التباين الخاص بالقوارض لمراحل محددة: المرحلة الشريانية الكبدية ، والمرحلة البابية الوريدية ، والمرحلة المتأخرة قد حسنت أيضا التصور19. يتميز استخدام تباين ExiTron nano 12000 بالعديد من المزايا ويمكن أن يحسن جودة الصورة الإجمالية. يوفر أقوى تعزيز للتباين في الكبد20 والدم21. ميزة أخرى هي أن التباين موجود في الكبد لمدة تصل إلى 120 ساعة بعد الحقن الأولي ، مما قد يقلل من سمية الكبد المرتبطة به حيث يلزم تقليل التباين إذا كانت هناك حاجة إلى فحوصات متكررة20.
علاوة على ذلك ، نظرا لإجراء عمليات المسح باستخدام الفأر المخدر بالإيزوفلوران ، لا يتغير تحسين التباين مع هذا التغيير في علم وظائف الأعضاء20. من خلال استخدام تقنيات التصوير هذه وتباين ExiTron ، يمكن إجراء تقييم واضح للمفاغرة الناجحة في OLT. يسمح التصوير المقطعي المحوسب بالتقييم غير الجراحي للطعم الخيفي في الجسم الحي على مدى فترة طويلة. يقلل هذا البروتوكول من عدد التي يجب التضحية بها لتقييم مفاغرة الأوعية الدموية وإتاحة الفرصة لدراسة العلاجات على مدى عدة أسابيع وتأثيرها على الأوعية الدموية.
القيود
تجدر الإشارة إلى أنه في حين حدثت مراجعات متعددة لنموذج OLT لإتقان تقنيته ، فإن تصور المفاغرة باستخدام microCT لا يزال عملية مستمرة. علاوة على ذلك ، يقدم الماوس OLT نظرة ثاقبة فريدة في طب الزرع. ومع ذلك ، فهو ليس نموذجا شاملا لأنه من الصعب إبقاء هذه الفئران على قيد الحياة بعد أسبوع 1. يجب استخدام نماذج زرع إضافية أيضا لإثبات التجارب قبل السريرية.
الاستنتاجات
تقدم التقدم في التصوير المقطعي المحوسب بسرعة خلال العقد الماضي ، مما وفر للباحثين أدوات جديدة لا تقدر بثمن في مجال النماذج الحيوانية وزرعها. في المستقبل ، سيقدم التصوير 3D الأكثر تفصيلا مزيدا من الأفكار حول البحث والاكتشاف.
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
يتم دعم SMB من قبل المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (NIDDK) منحة R01DK1234750. يتم دعم BAW من خلال منحة المعهد الوطني للقلب والرئة والدم من المعاهد الوطنية للصحة R01HL143000.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
#11 Blade | Fisher Scientific | 3120030 | |
4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
10-0 nylon suture | AD Surgical | M-N510R19-B | |
20 G Angiocath | Boundtree | 602032D | |
30 G Needle | Med Needles | BD-305106 | |
Baytril (enrofloxacin) Antibacterial Tablets | Elanco | NA | |
Bovie Chang-A-Tip High Temp Cauterizer | USA Medical and Surgical Supplies | BM-DEL1 | |
Bulldog Vein Clamp 1 1/8 | Ambler Surgical USA | 18-181 | |
C57BL/6J mice | Jackson Labs | ||
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Store | RS-5668 | |
Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | |
Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11252-50 | |
Dumont Medical #5/45 Forceps - Angled 45° | Fine Science tools | 11253-25 | |
ExiTron nano 12000 | Miltenyi Biotec | 130 - 095 - 698 | CT contrast agent |
Forceps | Fine Science tools | 11027-12 | |
Halsted-Mosquito Hemostat | Roboz Surgical | RS-7112 | |
heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
histidine-trypotophan-ketoglutarate | University Pharmacy | NA | |
Insulated Container | YETI | ROADIE 24 HARD COOLER | https://www.yeti.com/coolers/hard-coolers/roadie/10022350000.html |
Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
Mirco Serrefines | Fine Science tools | 18055-05 | |
Mouse Rectal Temperature Probe | WPI Inc | NA | |
NEEDLE HOLDER/FORCEPS straight | Micrins | MI1540 | |
PE10 Tubing | Fisher Scientific | BD 427400 | |
perfadex | XVIVO Perfusion AB | REF99450 | |
PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | NA | |
saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
Scissors | Fine Science tools | 14090-11 | |
Small Mouse Restraint – 1” inner diameter | Pro Lab Corp | MH-100 | |
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent scientific | SS-MVG-Module | |
Surgical microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
U-CTHR | MI Labs | NA | CT Scanner software |
Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
Yasagil clamp | Aesculap | FT351T | |
Yasagil clamp | Aesculap | FT261T | |
Yasagil clamp applicator | Aesculap | FT484T |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved