JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تتمتع الخلايا اللحمية المتوسطة المشتقة من الدهون (AdMSCs) بخصائص مناعية قوية مفيدة لعلاج الأمراض المرتبطة بالالتهاب. نوضح كيفية عزل وزراعة الفئران AdMSCs والدبقية المختلطة الأولية ، وتحفيز AdMSCs لتنظيم الجينات المضادة للالتهابات وعوامل النمو ، وتقييم هجرة AdMSCs ، و AdMSCs للثقافة المشتركة مع الخلايا الدبقية الأولية المصابة بالبريون المختلط.

Abstract

الخلايا اللحمية المتوسطة (MSCs) هي منظمات قوية للالتهابات من خلال إنتاج السيتوكينات المضادة للالتهابات ، والكيموكينات ، وعوامل النمو. تظهر هذه الخلايا القدرة على تنظيم الالتهاب العصبي في سياق الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض البريون واضطرابات اختلال البروتين الأخرى. يمكن أن تكون أمراض البريون متفرقة أو مكتسبة أو وراثية. يمكن أن تنتج عن اختلال وتجميع بروتين البريون في الدماغ. هذه الأمراض قاتلة دائما ، مع عدم وجود علاجات متاحة.

واحدة من أولى علامات المرض هي تنشيط الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة والالتهابات المرتبطة بها ، والتي تحدث قبل تراكم البريون القابل للكشف وفقدان الخلايا العصبية. وبالتالي ، يمكن حصاد الخصائص المضادة للالتهابات والتنظيمية ل MSCs لعلاج داء النجوم في مرض البريون. في الآونة الأخيرة ، أظهرنا أن MSCs المشتقة من الدهون (AdMSCs) المزروعة بشكل مشترك مع خلايا BV2 أو الخلايا الدبقية المختلطة الأولية تقلل الالتهاب الناجم عن البريون من خلال إشارات paracrine. تصف هذه الورقة علاجا موثوقا به باستخدام AdMSCs المحفزة لتقليل الالتهاب الناجم عن البريون.

يمكن بسهولة عزل مجموعة متغايرة الزيجوت من AdMSCs من الأنسجة الدهنية للفئران وتوسيعها في الثقافة. إن تحفيز هذه الخلايا بالسيتوكينات الالتهابية يعزز قدرتها على الهجرة نحو تجانس الدماغ المصاب بالبريون وإنتاج معدلات مضادة للالتهابات استجابة لذلك. معا ، يمكن استخدام هذه التقنيات للتحقيق في الإمكانات العلاجية ل MSCs على عدوى البريون ويمكن تكييفها مع أمراض اختلال البروتين والالتهابات العصبية الأخرى.

Introduction

يلعب الالتهاب الدبقي دورا رئيسيا في مجموعة متنوعة من الأمراض التنكسية العصبية ، بما في ذلك مرض باركنسون والزهايمر ومرض البريون. على الرغم من أن تراكم البروتين غير الطبيعي يعزى إلى الكثير من التسبب في المرض والتنكس العصبي ، إلا أن الخلايا الدبقية تلعب أيضا دورا في تفاقم هذا 1،2،3. لذلك ، فإن استهداف الالتهاب الدبقي هو نهج علاجي واعد. في مرض البريون ، يختلط بروتين البريون الخلوي (PrPC) إلى بروتين البريون المرتبط بالمرض (PrPSc) ، والذي يشكل oligomers ويتجمع ويعطل التوازن في الدماغ 4،5،6.

واحدة من أولى علامات مرض البريون هي الاستجابة الالتهابية من الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة. أظهرت الدراسات التي تثبط هذه الاستجابة ، إما عن طريق إزالة الخلايا الدبقية الصغيرة أو تعديل الخلايا النجمية ، بشكل عام عدم وجود تحسن أو تفاقم التسبب في المرض في النماذج الحيوانية 7،8،9. يعد تعديل الالتهاب الدبقي دون القضاء عليه بديلا مثيرا للاهتمام كعلاج.

اتخذت الخلايا اللحمية المتوسطة (MSCs) المرحلة كعلاج لمجموعة متنوعة من الأمراض الالتهابية ، نظرا لقدرتها على تعديل الالتهاب بطريقة paracrine 10,11. لقد أظهروا القدرة على الهجرة إلى مواقع الالتهاب والاستجابة لجزيئات الإشارات في هذه البيئات عن طريق إفراز الجزيئات المضادة للالتهابات وعوامل النمو والحمض النووي الريبي الصغير والمزيد 10،12،13. لقد أثبتنا سابقا أن MSCs المشتقة من الأنسجة الدهنية (المشار إليها AdMSCs) قادرة على الهجرة نحو تجانس الدماغ المصاب بالبريون والاستجابة لهذا التجانس الدماغي عن طريق تنظيم التعبير الجيني للسيتوكينات المضادة للالتهابات وعوامل النمو.

علاوة على ذلك ، يمكن أن تقلل AdMSCs من التعبير عن الجينات المرتبطة بالعامل النووي-كابا B (NF-κB) ، ومجال بيرين عائلة المستقبلات الشبيهة بالإيماءة التي تحتوي على 3 (NLRP3) إشارات التهابية ، والتنشيط الدبقي ، في كل من الخلايا الدبقية الصغيرة BV2 والدبقية المختلطة الأولية 14. هنا ، نقدم بروتوكولات حول كيفية عزل كل من AdMSCs والدبقية المختلطة الأولية من الفئران ، وتحفيز AdMSCs على تنظيم الجينات المعدلة ، وتقييم هجرة AdMSC ، والمشاركة في زراعة AdMSCs مع الخلايا الدبقية المصابة بالبريون. نأمل أن توفر هذه الإجراءات أساسا لمزيد من التحقيق في دور MSCs في تنظيم الالتهاب الناجم عن الدبقية في الأمراض التنكسية العصبية وغيرها.

Protocol

تم تربية الفئران وصيانتها في مختبر الموارد الحيوانية في ولاية كولورادو ، المعتمد من قبل جمعية تقييم واعتماد المختبر رعاية الدولية ، وفقا للبروتوكول # 1138 ، الذي وافقت عليه لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في جامعة ولاية كولورادو.

1. عزل وإصابة الخلايا الدبقية المختلطة القشرية الأولية بالبريونات

  1. لعزل الخلايا الدبقية المختلطة الأولية التي تحتوي على كل من الخلايا النجمية والدبقية الصغيرة ، احصل على C57Bl / 6 من جراء الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين صفر إلى يومين.
    ملاحظة: هذا البروتوكول مقتبس من البروتوكولات السابقة 15،16.
  2. القتل الرحيم للجراء واحدا تلو الآخر عن طريق قطع الرأس واستخراج دماغهم ، وفصل والتخلص من المخيخ وجذع الدماغ.
    1. ضع الدماغ في طبق بتري 3 سم يحتوي على MEM / EBSS بارد مع 2x البنسلين / الستربتومايسين / النيومايسين (PSN). تحت نطاق تشريح ، افصل نصفي الكرة المخية وقم بإزالة الدماغ المتوسط والتخلص منه. إزالة وتجاهل الحصين والسحايا من القشرة.
    2. ضع نصفي الكرة القشرية في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 5 مل من MEM / EBSS + 2x PSN وضعه على الجليد.
  3. في غطاء زراعة الأنسجة ، قم بإزالة الوسائط من الأنبوب المخروطي سعة 50 مل عن طريق الشفط بلطف باستخدام ماصة ، مع ترك قطع الأنسجة القشرية في أسفل الأنبوب. باستخدام ماصة زجاجية مطلية ، أضف 10 مل من وسائط التفكك المسخنة مسبقا وسحن الأنسجة باستخدام الماصة الزجاجية 10-20x.
  4. انقل المعلق إلى دورق سعة 50 مل يحتوي على قضيب تقليب صغير وضعه على طبق تقليب عند أدنى إعداد ، حوالي 30 دورة في الدقيقة ، لمدة 10 دقائق. أخرج الدورق من لوحة التقليب وضعه بزاوية 30 درجة لمدة 3 دقائق للسماح للمنديل بالاستقرار في الأسفل. قم بإزالة تعليق الخلية (طاف) وانقله إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل على الجليد.
  5. أضف DNase-I (4000 وحدة / مل) إلى 10 مل من وسائط التفكك وأعد تعليق الأنسجة وحركها لمدة 10 دقائق إضافية. كرر ذلك عن طريق إضافة وسائط تفكك جديدة (بدون DNase-I) 2-4 مرات إضافية (مرة واحدة لكل اثنين من جرو الفأر المستخدمة) ، ونقل تعليق الخلية إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مل على الجليد ، حتى تبقى الأنسجة الليفية فقط في قاع الدورق.
  6. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية في الأنبوب المخروطي لمدة 10 دقائق عند 1000 × جم عند 4 درجات مئوية. نضح الطافد واستبدله بوسط نمو دبقية. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم ولوحة الخلايا بكثافة 106 في 10 سم أطباق معالجة بزراعة الخلايا. ضع في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  7. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة الوسائط واستبدالها بوسائط دبقية جديدة. دع الخلايا تصل إلى التقاء 100٪ في غضون 2 أسابيع ؛ ثم قم بتقسيمها وطبقها للتجريب.
  8. بالنسبة لعدوى البريون في المختبر ، فإن الدبقية الصفيحية عند 100000 خلية لكل بئر في 6 ألواح جيدة وتسمح بالوصول إلى التقاء 80٪ -100٪. تعريض تجانس الدماغ ، سواء البريون أو الطبيعي ، المخفف إلى 20٪ في PBS إلى ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة قبل إضافته إلى زراعة الخلايا. نضح الوسائط من الخلايا الدبقية المراد إصابتها ، وأضف إلى كل بئر 1.5-2 مل من وسائط النمو الدبقية التي تحتوي على حجم نهائي بنسبة 0.1٪ طبيعي أو بريون متجانس الدماغ.
  9. بعد 72 ساعة ، قم بشفط الوسائط وغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة أي تجانس دماغي متبقي. استبدل بوسائط نمو دبقية جديدة (لا تحتوي على تجانس الدماغ).
  10. لعزل خلايا AdMSCs ، استخدم ماصة مصلية واستنشق الأنسجة الدهنية برفق مع ~ 1 مل من محلول HBSS / Trypsin. انقله إلى طبق بتري 4 سم يحتوي على 2 مل من وسائط DMEM / F12 مع 200 وحدة / مل DNase-I و 400 وحدة / مل كولاجيناز / خليط ديسباز. باستخدام مقص صغير ، اقطع قطع الأنسجة الدهنية إلى قطع صغيرة (أقل من 5 مم في الحجم) واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
  11. انقل محتويات طبق بتري إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع ماصة مصلية وسحن الخليط ~ 10x باستخدام الماصة. تأكد من أن الأنسجة تتفكك بسهولة وتشكل خليطا متجانسا نسبيا. قم بطرد الخليط عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم لحبيبات الجزء الوعائي اللحمي ، والذي سيظهر باللون الأحمر.
  12. نضح المادة الطافية بعناية واغسل الحبيبات ب 5 مل من برنامج تلفزيوني معقم مسخن مسبقا وأجهزة طرد مركزي عند 4 درجات مئوية عند 1000 × جم لمدة 3 دقائق. نضح المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسائط AdMSC (انخفاض الجلوكوز DMEM الذي يحتوي على L-glutamine ومكمل بنسبة 15٪ مصل بقري جنيني معطل حراريا (hiFBS) ، 1٪ أحماض أمينية ، 1٪ أحماض أمينية غير أساسية ، و 1٪ PSN).
  13. ضع مصفاة خلية 40 ميكرومتر فوق أنبوب مخروطي معقم جديد سعة 50 مل وقم بسحب تعليق الخلية من خلال المصفاة لإزالة أي نسيج غير منفصل. أضف 9 مل من وسائط AdMSC إلى طبق معالج بزراعة الخلايا مقاس 10 سم وقم بسحب معلق الخلية المجهد في الطبق. ضع في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  14. قم بإزالة وسائط AdMSC الجديدة واستبدالها في اليوم التالي. انتظر حتى تصبح الخلايا متقاربة بنسبة 80-90٪ عندما تكون جاهزة للمرور بين 72 ساعة و 96 ساعة.
  15. عزل AdMSCs كما هو موضح أعلاه والمرور مرتين للحصول على مجموعة متجانسة متسقة 14. اغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني معقم وماصة 2 مل من التربسين المسخن مسبقا (0.25٪) على كل طبق. احتضان الخلايا على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أو حتى يتم إزاحتها بالكامل من اللوحة. أضف 8 مل من وسائط AdMSC المسخنة مسبقا إلى كل لوحة ، وماصة لخلط تعليق الخلية ، ونقلها إلى الأنبوب المخروطي ، وأجهزة الطرد المركزي عند 1000 × جم عند 4 درجات مئوية إلى الحبيبات.
  16. أعد تعليق AdMSCs في 3-10 مل من الوسائط (حسب عدد اللوحات المستخدمة) وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم. لوحة 100000 خلية / بئر في 6 ألواح آبار تحتوي على وسائط AdMSC. ضع في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 طوال الليل.
  17. في اليوم التالي ، حفز الخلايا إما بالسيتوكينات أو تجانس الدماغ.
    1. بالنسبة للخلايا المحفزة بالسيتوكينات ، اصنع وسائط AdMSC تحتوي إما على 10 نانوغرام / مل TNFα أو 200 نانوغرام / مل IFNγ. استخدم وسائط جديدة للتحكم في الآبار.
    2. بالنسبة لعلاجات تجانس الدماغ المصابة بالبريون ، احصل على 20٪ من تجانس الدماغ (في PBS) من فئران البريون المصابة بمرض عضال (سلالات 22L أو RML). جعل وسائط AdMSC بتركيز نهائي بنسبة 0.1٪ مصاب بالبريون أو تجانس دماغي طبيعي للضوابط.
    3. نضح الوسائط من الآبار وسحب 1.5 مل من الوسائط المحتوية على السيتوكين أو الدماغ المتجانس إلى الآبار المقابلة. أداء في ثلاث نسخ. لوحات العودة إلى الحاضنة.
  18. قم بإزالة الوسائط ، واغسل الخلايا 2x باستخدام PBS المسخن مسبقا ، واعزل الحمض النووي الريبي عن طريق إضافة 350 مل من محلول التحلل الذي يحتوي على 1٪ βME لكل بئر ، واستخدم رافع الخلايا لإزالة محللات الخلايا. قم بإجراء عزل الحمض النووي الريبي باتباع بروتوكول الشركة المصنعة للمجموعة الصغيرة ، بما في ذلك خطوة هضم DNase. بالنسبة ل RT-qPCR ، قم بنسخ 25 نانوغرام من الحمض النووي الريبي لكل عينة وتضخيم cDNA باستخدام SYBR Green والبادئات لكل جين عند 10 mM. تحليل تعبير mRNA باستخدام طريقة 2-ΔΔCT وتطبيع التعبير عن الجين المرجعي β-actin 17.
    ملاحظة: تم إجراء جميع RT-PCR وفقا لإرشادات MIQE.
  19. لوحة BV2 microglia عند 50000 خلية لكل بئر ، أو الدبقية الأولية المختلطة عند 100000 خلية لكل بئر في لوحة 6 آبار. عالج خلايا BV2 في اليوم التالي بوسائط تحتوي على 0.1٪ مصاب بالبريون أو تجانس دماغي طبيعي. بالنسبة للخلايا الدبقية المختلطة ، انتظر حتى تتلاقى الخلايا بنسبة 80-90٪ لتصيب بتجانس الدماغ.
  20. احتضان الخلايا في الوسائط التي تحتوي على تجانس الدماغ لمدة 72 ساعة. اغسل الخلايا 2x باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة تجانس الدماغ المتبقي وإضافة وسائط جديدة والعودة إلى الحاضنة.
  21. استخدم AdMSCs في المقطع 3 للثقافة المشتركة. في حالة تحفيز AdMSCs ، استخدم الوسائط التي تحتوي على 10 نانوغرام / مل TNFα وعالجها لمدة 24 ساعة قبل الزراعة المشتركة مع BV2 أو الخلايا الدبقية المختلطة. اغسل AdMSCs المحفزة 3x باستخدام PBS لإزالة أي TNFα متبقية.
  22. trypsinize AdMSCs كما هو موضح في الخطوة 1.15 وإعادة التعليق في وسائط AdMSC.
  23. قم بتدوير تعليق AdMSC عند 1000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. خلال هذا الوقت ، استبدل الوسائط الموجودة على خلايا BV2 أو الدبقية المختلطة ب 2 مل لكل بئر من وسائط AdMSC وضع إدخالات لألواح 6 آبار بحجم مسام 0.4 ميكرومتر في نصف الآبار. أضف 2 مل من وسائط AdMSC إلى كل إدراج و2 مل إضافية من الوسائط إلى الآبار التي لا تتلقى إدراجات.
  24. عند الانتهاء من تكوير AdMSCs ، أعد تعليق الحبيبات في وسائط AdMSC. عد AdMSCs باستخدام مقياس الدم وأضف 50,000-100,000 خلية إلى كل إدراج.
  25. بالنسبة لخلايا BV2 ، احتضان الثقافات المشتركة لمدة 24 ساعة. بالنسبة للخلايا الدبقية المختلطة ، احتضان لمدة 24 ساعة وما يصل إلى 7 أيام.
  26. بعد الحضانة مع AdMSCs للوقت المطلوب ، قم بإزالة الإدخالات وتجاهلها ، أو ضعها في لوحة جديدة ذات 6 آبار ، واغسل إدراجات 2x باستخدام PBS ، وأضف المخزن المؤقت الذي توفره مجموعة عزل الحمض النووي الريبي إلى الخلايا الدبقية المختلطة أو خلايا BV2 ، وكشط الإدخالات لتحليل AdMSC RNA.
  27. عالج AdMSCs عند المقطع 2 بوسائط تحتوي على 10 نانوغرام / مل TNFα. في اليوم التالي ، اغسل الخلايا باستخدام PBS 3x المعقم المسخن مسبقا واحتضانها في وسائط AdMSC الخالية من المصل لمدة 4 ساعات.
  28. لإجراء فحص الخلايا المهاجرة ، أضف 25000 AdMSCs لكل إدخال واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. خلال هذا الوقت ، ستنتقل الخلايا المهاجرة من الغرفة العلوية للملحق وتلتصق بالجانب السفلي من الإدخال. قم بشفط محتويات كل من البئر والإدخالات بعناية واغسل 2x باستخدام PBS ، مع ترك 1 مل من PBS في كل بئر لضمان بقاء الحشوات رطبة على كل جانب.
  29. واحدا تلو الآخر ، باستخدام الملقط ، قم بإزالة الإدخالات وامسح الحجرة العلوية برفق ولكن بدقة باستخدام قطعة قطن لإزالة أي خلايا لم تهاجر. قم بنضح ما تبقى من PBS وماصة 500 ميكرولتر من محلول الكريستال البنفسجي إلى كل من البئر والغرفة العلوية للإدخال ، مما يضمن غمر غشاء الإدخال بالكامل.
  30. احتضان إدراج لمدة 1 ساعة في محلول البنفسجي الكريستال في درجة حرارة الغرفة. للاحتفاظ باللون بشكل أفضل، قم بتنفيذ الخطوات التالية بسرعة، مع إدراج واحد فقط في كل مرة.
    1. نضح محلول الكريستال البنفسجي من البئر والغرفة العلوية للإدراج واغسل 3x باستخدام برنامج تلفزيوني. امسح الغرفة العلوية مرة أخرى بقطعة قطن.
    2. ضع الملحق في بئر في لوحة جديدة من 24 بئرا تحتوي على 1 مل من برنامج تلفزيوني. ضع اللوحة فوق مجهر مقلوب مع كاميرا متصلة. باستخدام الهدف 10x ، التقط صورا لأربع مناطق عشوائية باتجاه مركز الإدراج ، مع التركيز فقط على الجانب السفلي من الإدخال.
  31. بعد إجراء ذلك مع كل بئر ، قم بتحميل الصور إلى برنامج معالجة الصور الذي تختاره ، واضبط الخلفية لتحسين التباين مع الخلايا الملطخة باللون الأرجواني. عد الخلايا يدويا باستخدام عداد خلية.

النتائج

تحفيز AdMSCs مع TNFα أو إنترفيرون جاما (IFNγ) لمدة 24 ساعة يؤدي إلى تغييرات في التعبير عن الجزيئات المضادة للالتهابات وعوامل النمو. يؤدي علاج AdMSCs باستخدام TNFα أو إنترفيرون جاما (IFNγ) إلى زيادة الجين المحفز لعامل نخر الورم 6 (TSG-6) mRNA ، في حين أن TNFα ، ولكن ليس IFNγ ، يسبب زيادة في تحويل عامل النمو بيت?...

Discussion

نوضح هنا بروتوكولا موثوقا وغير مكلف نسبيا لتقييم آثار الخلايا اللحمية المتوسطة المشتقة من الدهون (AdMSCs) في تقليل الالتهاب الناجم عن البريون في نموذج الخلايا الدبقية. يمكن بسهولة عزل AdMSCs وتوسيعها في الثقافة لاستخدامها في أقل من أسبوع 1. ينتج هذا البروتوكول باستمرار مجموعة غير متجانسة من الخ...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون Lab Animal Resources على تربية. تشمل مصادر تمويلنا لهذه المخطوطة صندوق Boettcher ، وصندوق Murphy Turner ، وكلية CSU للطب البيطري ، ومجلس أبحاث كلية العلوم الطبية الحيوية. تم إنشاء الشكل 2A والشكل 2C والشكل 3A باستخدام BioRender.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% TrypsinCytivaSH30042.01
5 mL serological pipetsCelltreat229005B
6-well tissue culture platesCelltreat229106
10 cm cell culture dishesPeak SerumPS-4002
10 ml serological pipetsCelltreat229210
15 mL conical tubesCelltreat667015B
50 mL conical tubesCelltreat667050B
BV2 microglia cell lineAcceGen BiotechABC-TC212S
Cell lifterBiologix Research Company70-2180
Crystal violetElectron Microscopy Sciences 12785
DispaseThermo Scientific17105041
DMEM/F12Caisson LabsDFL14-500ML
DNase-ISigma Aldrich11284932001
Essential amino acidsThermo Scientific11130051
Ethanol (100%)EMD MilliporeEX0276-1
Fetal bovine serum (heat inactivated)Peak SerumPS-FB4Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory
FormaldehydeEMD Millipore1.04003.1000
Glass 10 mL serological pipetCorning 7077-10N
Hank’s Balances Salt SolutionSigma AldrichH8264-500ML
Hemocytometer/Neubauer ChamberDaiggerHU-3100
High Glucose DMEMCytivaSH30022.01
low glucose DMEM containing L-glutamineCytivaSH30021.01
MEM/EBSSCytivaSH30024.FS
non-essential amino acidsSigma-AldrichM7145-100M
Paraformaldehyde (16%)MP Biomedicals219998320
Penicillin/streptomycin/neomycinSigma-AldrichP4083-100ML
Phosphate buffered salineCytiva SH30256.01
Recombinant Mouse IFN-gamma ProteinR&D Systems485-MI
Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CFR&D Systems410-MT
RNeasy mini kitQiagen74104
SigmacoteSigma AldrichSL2-100MLCoat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later.
StemxymeWorthington Biochemical CorporationLS004106Collagenase/Dispase mixture
Sterile, individually wrapped cotton swabPuritan Medical 25-8061WC
Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µmGreiner Bio-One662638
Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µmGreiner Bio-One657641

References

  1. Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).
  2. Smith, H. L., et al. Astrocyte unfolded protein response induces a specific reactivity state that causes non-cell-autonomous neuronal degeneration. Neuron. 105 (5), 855-866 (2020).
  3. Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
  4. Collinge, J., Clarke, A. R. A general model of prion strains and their pathogenicity. Science. 318 (5852), 930-936 (2007).
  5. Gajdusek, D. C. Transmissible and non-transmissible amyloidoses: autocatalytic post-translational conversion of host precursor proteins to beta-pleated sheet configurations. J Neuroimmunol. 20 (2-3), 95-110 (1988).
  6. Come, J. H., Fraser, P. E., Lansbury, P. T. A kinetic model for amyloid formation in the prion diseases: importance of seeding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (13), 5959-5963 (1993).
  7. Hartmann, K., et al. Complement 3(+)-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 83 (2019).
  8. Carroll, J. A., Race, B., Williams, K., Striebel, J., Chesebro, B. Microglia are critical in host defense against prion disease. Journal of Virology. 92 (15), e00549 (2018).
  9. Bradford, B. M., McGuire, L. I., Hume, D. A., Pridans, C., Mabbott, N. A. Microglia deficiency accelerates prion disease but does not enhance prion accumulation in the brain. Glia. 70 (11), 2169-2187 (2022).
  10. Li, M., Chen, H., Zhu, M. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine in central nervous system. Frontiers in Neuroscience. 16, 1068114 (2022).
  11. Sanchez-Castillo, A. I., et al. Switching roles: beneficial effects of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells on microglia and their implication in neurodegenerative diseases. Biomolecules. 12 (2), 219 (2022).
  12. Fu, X., et al. Mesenchymal stem cell migration and tissue repair. Cells. 8 (8), 784 (2019).
  13. Xiao, Q., et al. TNF-alpha increases bone marrow mesenchymal stem cell migration to ischemic tissues. Cell Biochemistry and Biophysics. 62 (3), 409-414 (2012).
  14. Hay, A. J. D., Murphy, T. J., Popichak, K. A., Zabel, M. D., Moreno, J. A. Adipose-derived mesenchymal stromal cells decrease prion-induced glial inflammation in vitro. Scientific Reports. 12 (1), 22567 (2022).
  15. Kirkley, K. S., Popichak, K. A., Afzali, M. F., Legare, M. E., Tjalkens, R. B. Microglia amplify inflammatory activation of astrocytes in manganese neurotoxicity. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 99 (2017).
  16. Popichak, K. A., Afzali, M. F., Kirkley, K. S., Tjalkens, R. B. Glial-neuronal signaling mechanisms underlying the neuroinflammatory effects of manganese. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 324 (2018).
  17. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  18. Hass, R., Otte, A. Mesenchymal stem cells as all-round supporters in a normal and neoplastic microenvironment. Cell Communication and Signaling: CCS. 10 (1), 26 (2012).
  19. Carroll, J. A., et al. Prion strain differences in accumulation of PrPSc on neurons and glia are associated with similar expression profiles of neuroinflammatory genes: comparison of three prion strains. PLoS Pathogens. 12 (4), 1005551 (2016).
  20. Carroll, J. A., Race, B., Williams, K., Chesebro, B. Toll-like receptor 2 confers partial neuroprotection during prion disease. PLoS One. 13 (12), e0208559 (2018).
  21. Yu, Y., et al. Hypoxia and low-dose inflammatory stimulus synergistically enhance bone marrow mesenchymal stem cell migration. Cell Proliferation. 50 (1), e12309 (2017).
  22. Hay, A. J. D., et al. Intranasally delivered mesenchymal stromal cells decrease glial inflammation early in prion disease. Frontiers in Neuroscience. 17, 1158408 (2023).
  23. English, K., Barry, F. P., Field-Corbett, C. P., Mahon, B. P. IFN-gamma and TNF-alpha differentially regulate immunomodulation by murine mesenchymal stem cells. Immunology Letters. 110 (2), 91-100 (2007).
  24. Hemeda, H., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha differentially affect cytokine expression and migration properties of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 19 (5), 693-706 (2010).
  25. Carta, M., Aguzzi, A. Molecular foundations of prion strain diversity. Current Opinion in Neurobiology. 72, 22-31 (2022).
  26. Yu, F., et al. Phagocytic microglia and macrophages in brain injury and repair. CNS Neuroscience and Therapeutics. 28 (9), 1279-1293 (2022).
  27. Sinha, A., et al. Phagocytic activities of reactive microglia and astrocytes associated with prion diseases are dysregulated in opposite directions. Cells. 10 (7), 1728 (2021).
  28. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9, 115 (2012).
  29. Shan, Z., et al. Therapeutic effect of autologous compact bone-derived mesenchymal stem cell transplantation on prion disease. Journal of General Virology. 98 (10), 2615-2627 (2017).
  30. Johnson, T. E., et al. Monitoring immune cells trafficking fluorescent prion rods hours after intraperitoneal infection. Journal of Visualized Experiments. (45), e2349 (2010).
  31. Liu, F., et al. MSC-secreted TGF-beta regulates lipopolysaccharide-stimulated macrophage M2-like polarization via the Akt/FoxO1 pathway. Stem Cell Research and Therapy. 10, 345 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved