Aus Fett gewonnene mesenchymale Stromazellen, die mit primären gemischten Gliazellen kokultiviert wurden, um Prionen-induzierte Entzündungen zu reduzieren

Zusammenfassung

Aus Fett gewonnene mesenchymale Stromazellen (AdMSCs) haben starke immunmodulatorische Eigenschaften, die bei der Behandlung von Krankheiten, die mit Entzündungen verbunden sind, nützlich sind. Wir zeigen, wie murine AdMSCs und primäre gemischte Gliazellen isoliert und kultiviert, AdMSCs zur Hochregulierung entzündungshemmender Gene und Wachstumsfaktoren stimuliert, die Migration von AdMSCs bewertet und AdMSCs mit primär gemischten Prionen-infizierten Gliazellen co-kultiviert werden.

Zusammenfassung

Mesenchymale Stromazellen (MSCs) sind durch die Produktion von entzündungshemmenden Zytokinen, Chemokinen und Wachstumsfaktoren starke Regulatoren von Entzündungen. Diese Zellen zeigen die Fähigkeit, Neuroinflammation im Rahmen von neurodegenerativen Erkrankungen wie der Prionenkrankheit und anderen Proteinfehlfaltungsstörungen zu regulieren. Prionenkrankheiten können sporadisch, erworben oder genetisch bedingt sein; Sie können aus der Fehlfaltung und Aggregation des Prionproteins im Gehirn resultieren. Diese Krankheiten verlaufen ausnahmslos tödlich, und es gibt keine Behandlungsmöglichkeiten.

Eines der frühesten Anzeichen einer Krankheit ist die Aktivierung von Astrozyten und Mikroglia und die damit verbundene Entzündung, die vor der nachweisbaren Prionenaggregation und dem neuronalen Verlust auftritt. So können die entzündungshemmenden und regulatorischen Eigenschaften von MSCs zur Behandlung von Astrogliose bei Prionenkrankheit genutzt werden. Kürzlich haben wir gezeigt, dass aus Fett gewonnene MSCs (AdMSCs), die mit BV2-Zellen oder primären gemischten Gliazellen kokultiviert werden, Prionen-induzierte Entzündungen durch parakrine Signalwege reduzieren. In dieser Arbeit wird eine zuverlässige Behandlung mit stimulierten AdMSCs beschrieben, um die Prionen-induzierte Entzündung zu verringern.

Eine heterozygote Population von AdMSCs kann leicht aus murinem Fettgewebe isoliert und in Kultur expandiert werden. Die Stimulation dieser Zellen mit inflammatorischen Zytokinen verbessert ihre Fähigkeit, sowohl in Richtung Prionen-infiziertes Gehirnhomogenat zu wandern als auch als Reaktion darauf entzündungshemmende Modulatoren zu produzieren. Zusammen können diese Techniken verwendet werden, um das therapeutische Potenzial von MSCs bei Prioneninfektionen zu untersuchen und können für andere Proteinfehlfaltungen und neuroinflammatorische Erkrankungen angepasst werden.

Einleitung

Gliaentzündungen spielen eine Schlüsselrolle bei einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen, darunter Parkinson, Alzheimer und Prionen. Obwohl die abnormale Proteinaggregation auf einen Großteil der Krankheitspathogenese und Neurodegeneration zurückgeführt wird, spielen Gliazellen auch eine Rolle bei der Verschlimmerung dieser ^{Situation 1,2,3}. Daher ist die gezielte Behandlung von glialinduzierten Entzündungen ein vielversprechender therapeutischer Ansatz. Bei der Prionenerkrankung faltet sich das zelluläre Prionprotein (PrP^C) falsch zum krankheitsassoziierten Prionprotein (PrP^Sc), das Oligomere und Aggregate bildet und die Homöostase im Gehirn stört ^4,5,6.

Eines der frühesten Anzeichen einer Prionenerkrankung ist eine Entzündungsreaktion von Astrozyten und Mikroglia. Studien, die diese Reaktion unterdrückten, entweder durch Entfernung von Mikroglia oder Modifikation von Astrozyten, haben im Tiermodellen im Allgemeinen keine Verbesserung oder Verschlechterung der Krankheitspathogenese gezeigt ^7,8,9. Die Modulation der Gliaentzündung, ohne sie zu beseitigen, ist eine faszinierende Alternative als Therapeutikum.

Mesenchymale Stromazellen (MSCs) haben aufgrund ihrer Fähigkeit, Entzündungen auf parakrine Weise zu modulieren, die Bühne zur Behandlung einer Vielzahl von entzündlichen Erkrankungen übernommen ^10,11. Sie haben die Fähigkeit gezeigt, zu Entzündungsherden zu wandern und auf Signalmoleküle in diesen Umgebungen zu reagieren, indem sie entzündungshemmende Moleküle, Wachstumsfaktoren, microRNAs und mehr sezernieren 10,12,13. Wir haben bereits gezeigt, dass MSCs, die aus Fettgewebe gewonnen werden (als AdMSCs bezeichnet), in der Lage sind, in Richtung Prionen-infiziertes Gehirnhomogenat zu migrieren und auf dieses Gehirnhomogenat zu reagieren, indem sie die Genexpression für entzündungshemmende Zytokine und Wachstumsfaktoren hochregulieren.

Darüber hinaus können AdMSCs die Expression von Genen verringern, die mit dem Kernfaktor-kappa B (NF-κB), der Pyrindomäne der Nod-like-Rezeptorfamilie, die den 3 (NLRP3)-Inflammasom-Signalweg enthält, und der Gliaaktivierung sowohl in BV2-Mikroglia als auch in primären gemischten Gliazellen ¹⁴ assoziiert sind. Hier stellen wir Protokolle zur Verfügung, wie sowohl AdMSCs als auch primäre gemischte Gliazellen aus Mäusen isoliert, AdMSCs zur Hochregulierung modulatorischer Gene stimuliert, die AdMSC-Migration bewertet und AdMSCs mit Prionen-infizierten Gliazellen co-kultiviert werden. Wir hoffen, dass diese Verfahren eine Grundlage für die weitere Erforschung der Rolle von MSCs bei der Regulierung glialinduzierter Entzündungen bei neurodegenerativen und anderen Erkrankungen bilden können.

Protokoll

Die Mäuse wurden bei den Labortierressourcen des Bundesstaates Colorado gezüchtet und gepflegt, die von der Association for Assessment and Accreditation of Lab Animal Care International akkreditiert sind, in Übereinstimmung mit dem Protokoll #1138, das vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Colorado State University genehmigt wurde.

1. Isolierung und Infektion primärer kortikaler gemischter Gliazellen mit Prionen

1. Um primäre gemischte Gliazellen zu isolieren, die sowohl Astrozyten als auch Mikroglia enthalten, erhalten Sie C57Bl/6-Mauswelpen im Alter von null bis zwei Tagen.
   HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von den vorherigen Protokollen ^15,16 übernommen.
2. Euthanasiere die Welpen nacheinander durch Enthauptung und entferne ihr Gehirn, indem du das Kleinhirn und den Hirnstamm trennst und entwirfst.
   1. Platzieren Sie das Gehirn in einer 3 cm großen Petrischale, die kaltes MEM/EBSS mit 2x Penicillin/Streptomycin/Neomycin (PSN) enthält. Trennen Sie unter einem Präparierfernrohr die Gehirnhälften und entfernen Sie das Mittelhirn und entsorgen Sie es. Entfernen und entsorgen Sie den Hippocampus und die Hirnhäute aus dem Kortex.
   2. Legen Sie beide kortikalen Hemisphären in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 5 mL MEM/EBSS + 2x PSN und legen Sie es auf Eis.
3. Entfernen Sie in einer Gewebekulturhaube das Medium aus dem konischen 50-ml-Röhrchen, indem Sie es vorsichtig mit einer Pipette ansaugen, wobei Sie die kortikalen Gewebestücke am Boden des Röhrchens belassen. Mit einer beschichteten Glaspipette 10 mL vorgewärmtes Dissoziationsmedium zugeben und das Gewebe mit der Glaspipette 10-20x verreiben.
4. Die Suspension wird in ein 50-ml-Becherglas mit einem kleinen Rührstab umgefüllt und auf einer Rührplatte auf der niedrigsten Stufe, ca. 30 U/min, 10 Minuten lang aufbewahrt. Nehmen Sie das Becherglas aus der Rührplatte und stellen Sie es 3 min lang in einem Winkel von 30° auf, damit sich das Gewebe am Boden absetzen kann. Entfernen Sie die Zellsuspension (Überstand) und geben Sie sie in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen auf Eis.
5. Geben Sie DNase-I (4.000 U/ml) in 10 mL Dissoziationsmedium, resuspendieren Sie das Gewebe und rühren Sie weitere 10 Minuten lang. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie 2-4 weitere Male frisches Dissoziationsmedium (ohne DNase-I) hinzufügen (einmal für jeweils zwei verwendete Maus-Welpen) und die Zellsuspension in das konische 50-ml-Röhrchen auf Eis übertragen, bis nur noch faseriges Gewebe am Boden des Becherglases verbleibt.
6. Die Zellsuspension wird im konischen Röhrchen 10 min bei 1.000 × g bei 4 °C zentrifugiert. Den Überstand aspirieren und durch gliales Wachstumsmedium ersetzen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und plattieren Sie die Zellen mit einer Dichte von 10⁶ in 10 cm großen Zellkulturschalen. In einen Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂ stellen.
7. Entfernen Sie nach 24 Stunden das Medium und ersetzen Sie es durch frisches Gliamedium. Lassen Sie die Zellen innerhalb von 2 Wochen 100% Konfluenz erreichen; Teilen Sie sie dann und verteilen Sie sie zum Experimentieren.
8. Für eine In-vitro-Prioneninfektion wird die Glia mit 100.000 Zellen pro Well in 6-Well-Platten plattiert und eine Konfluenz von 80 % bis 100 % erreicht. Setzen Sie Gehirnhomogenate, sowohl Prionen als auch normale, die auf 20 % in PBS verdünnt sind, 30 Minuten lang UV-Licht aus, bevor Sie sie der Zellkultur hinzufügen. Aspirieren Sie Medien von den zu infizierenden Gliazellen und fügen Sie in jede Vertiefung 1,5-2 ml gliales Wachstumsmedium mit einem Endvolumen von 0,1 % Normal- oder Prionen-Gehirnhomogenat hinzu.
9. Nach 72 Stunden aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit PBS, um alle verbleibenden Gehirnhomogenate zu entfernen. Ersetzen Sie es durch frisches gliales Wachstumsmedium (enthält keine Gehirnhomogenate).
10. Um AdMSCs-Zellen zu isolieren, verwenden Sie eine serologische Pipette und aspirieren Sie das Fettgewebe vorsichtig zusammen mit ~1 ml HBSS/Trypsin-Lösung. In eine 4-cm-Petrischale mit 2 mL DMEM/F12-Medium mit 200 U/mL DNase-I und 400 U/mL Kollagenase/Dispase-Gemisch geben. Schneiden Sie die Fettgewebestücke mit einer kleinen Schere in kleine Stücke (weniger als 5 mm groß) und inkubieren Sie sie 1,5 h lang bei 37 °C.
11. Übertragen Sie den Inhalt der Petrischale mit einer serologischen Pipette in ein konisches 50-ml-Röhrchen und zerkleinern Sie die Mischung ~10x mit der Pipette. Achten Sie darauf, dass das Gewebe leicht auseinanderbricht und eine relativ homogene Mischung bildet. Zentrifugieren Sie das Gemisch bei 4 °C für 5 min bei 1.000 × g , um die stromale Gefäßfraktion zu pelletieren, die rot erscheint.
12. Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Pellet mit 5 mL vorgewärmtem sterilem PBS waschen und bei 4 °C bei 1.000 × g 3 min zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml AdMSC-Medium (DMEM mit niedrigem Glukosegehalt, der L-Glutamin enthält und mit 15 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (hiFBS), 1 % Aminosäuren, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 % PSN ergänzt wird).
13. Legen Sie ein 40-μm-Zellsieb auf ein frisches, steriles konisches 50-ml-Röhrchen und pipettieren Sie die Zellsuspension durch das Sieb, um nicht dissoziiertes Gewebe zu entfernen. Geben Sie 9 ml AdMSC-Medium in eine mit 10 cm Zellkultur behandelte Schale und pipetieren Sie die abgeseihte Zellsuspension in die Schale. In einen Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂ stellen.
14. Entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie es am nächsten Tag durch ein neues AdMSC-Medium. Warten Sie, bis die Zellen zu 80-90 % konfluent sind, wenn sie zwischen 72 h und 96 h bereit sind, durchgelassen zu werden.
15. Isolieren Sie AdMSCs wie oben beschrieben und durchlaufen Sie sie zweimal, um eine konsistente homogene Population ^{zu erhalten 14}. Waschen Sie die Zellen zweimal mit sterilem PBS und pipettieren Sie 2 ml vorgewärmtes Trypsin (0,25%) auf jede Platte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 5 Minuten oder bis sie sich vollständig von der Platte gelöst haben. Geben Sie 8 ml vorgewärmtes AdMSC-Medium auf jede Platte, pipettieren Sie, um die Zellsuspension zu mischen, geben Sie es in das konische Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei 1.000 × g bei 4 °C, um es zu pelletieren.
16. Resuspendieren Sie AdMSCs in 3-10 ml Medien (abhängig von der Anzahl der verwendeten Platten) und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Platte 100.000 Zellen/Well in 6-Well-Platten mit AdMSC-Medien. Über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO₂ in einen Inkubator stellen.
17. Stimulieren Sie die Zellen am nächsten Tag entweder mit Zytokinen oder Gehirnhomogenat.
    1. Für Zytokin-stimulierte Zellen stellen Sie AdMSC-Medien her, die entweder 10 ng/ml TNFα oder 200 ng/ml IFNγ enthalten. Verwenden Sie frische Medien für Kontrollwells.
    2. Für Behandlungen mit Prionen-infizierten Gehirnhomogenaten erhalten Sie 20 % Gehirnhomogenat (in PBS) von unheilbar infizierten Prionenmäusen (22L- oder RML-Stämme). Herstellung von AdMSC-Medien mit einer Endkonzentration von 0,1 % Prionen-infiziertem oder normalem Gehirnhomogenat für Kontrollen.
    3. Aspirieren Sie das Medium aus den Wells und pipetieren Sie 1,5 ml Zytokin- oder Gehirnhomogenat-haltiges Medium in die entsprechenden Wells. In dreifacher Ausfertigung ausführen. Bringen Sie die Platten wieder in den Inkubator zurück.
18. Entfernen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen 2x mit vorgewärmtem PBS, isolieren Sie die RNA, indem Sie 350 ml Lysepuffer mit 1 % βME in jede Vertiefung geben, und verwenden Sie einen Zelllifter, um die Zelllysate zu entfernen. Führen Sie die RNA-Isolierung gemäß dem Protokoll des Herstellers des Mini-Kits durch, einschließlich eines DNase-Verdauungsschritts. Für die RT-qPCR werden 25 ng RNA pro Probe rückwärts transkribiert und cDNA mit SYBR Green und Primern für jedes Gen bei 10 mM amplifiziert. Analysieren Sie die mRNA-Expression mit der ^{2-ΔΔCT-Methode} und normalisieren Sie sie auf die Expression des Referenzgens β-Aktin ¹⁷.
    HINWEIS: Die gesamte RT-PCR wurde gemäß den MIQE-Richtlinien durchgeführt.
19. Platte BV2-Mikroglia mit 50.000 Zellen pro Well oder primäre gemischte Gliazellen mit 100.000 Zellen pro Well in einer 6-Well-Platte. Behandeln Sie BV2-Zellen am nächsten Tag mit Medien, die 0,1 % Prionen-infiziertes oder normales Gehirnhomogenat enthalten. Bei gemischten Gliazellen warten Sie, bis die Zellen zu 80-90 % konfluent sind, um sich mit dem Gehirnhomogenat zu infizieren.
20. Inkubieren Sie die Zellen in Medien, die Gehirnhomogenat enthalten, für 72 Stunden. Waschen Sie die Zellen 2x mit PBS, um das verbleibende Gehirnhomogenat zu entfernen, fügen Sie frisches Medium hinzu und kehren Sie zum Inkubator zurück.
21. Verwenden Sie AdMSCs an Passage 3 für die Co-Kultur. Bei Stimulierung von AdMSCs ist ein Medium mit einem Gehalt von 10 ng/ml TNFα zu verwenden und vor der Co-Kultivierung mit BV2 oder gemischten Gliazellen 24 h lang zu behandeln. Waschen Sie stimulierte AdMSCs 3x mit PBS, um restliches TNFα zu entfernen.
22. Trypsinisieren Sie AdMSCs wie in Schritt 1.15 beschrieben und resuspendieren Sie sie in AdMSC-Medien.
23. AdMSC-Suspension bei 1.000 × g bei 4 °C für 5 min schleudern. Ersetzen Sie während dieser Zeit das Medium auf BV2-Zellen oder gemischten Gliazellen durch 2 mL AdMSC-Medium pro Vertiefung und setzen Sie Einsätze für 6-Well-Platten mit einer Porengröße von 0,4 Mikrometern in die Hälfte der Vertiefungen ein. Fügen Sie 2 mL AdMSC-Medium zu jedem Einsatz hinzu und weitere 2 mL Medium zu Wells, die keine Einsätze erhalten.
24. Wenn Sie mit dem Pelletieren von AdMSCs fertig sind, suspendieren Sie das Pellet wieder in AdMSC-Medien. Zählen Sie AdMSCs mit einem Hämozytometer und fügen Sie jedem Einsatz 50.000-100.000 Zellen hinzu.
25. Für BV2-Zellen Inkubieren Sie Co-Kulturen für 24 Stunden. Bei gemischten Gliazellen nur 24 Stunden und bis zu 7 Tage inkubieren.
26. Entfernen Sie nach der Inkubation mit AdMSCs für die gewünschte Zeit die Einsätze und verwerfen Sie sie oder legen Sie sie in eine neue 6-Well-Platte, waschen Sie die Einsätze 2x mit PBS, fügen Sie den gemischten Glia- oder BV2-Zellen Puffer hinzu, der vom RNA-Isolationskit bereitgestellt wird, und kratzen Sie die Einsätze ab, um AdMSC-RNA zu analysieren.
27. AdMSCs an Passage 2 werden mit Medien behandelt, die 10 ng/ml TNFα enthalten. Am nächsten Tag die Zellen mit vorgewärmtem sterilem PBS 3x waschen und 4 h in serumfreiem AdMSC-Medium inkubieren.
28. Um einen Migrationszellassay durchzuführen, fügen Sie 25.000 AdMSCs pro Insert hinzu und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 °C. Während dieser Zeit bewegen sich die wandernden Zellen aus der oberen Kammer des Einsatzes und haften an der Unterseite des Einsatzes. Saugen Sie den Inhalt sowohl der Vertiefung als auch der Einsätze vorsichtig ab und waschen Sie sie 2x mit PBS, wobei Sie 1 ml PBS in jeder Vertiefung belassen, um sicherzustellen, dass die Einsätze auf jeder Seite feucht bleiben.
29. Entfernen Sie nacheinander mit einer Pinzette die Einsätze und wischen Sie die obere Kammer vorsichtig, aber gründlich mit einem Wattestäbchen ab, um alle Zellen zu entfernen, die nicht gewandert sind. Aspirieren Sie das restliche PBS und pipettieren Sie 500 μl kristallviolette Lösung sowohl in die Vertiefung als auch in die obere Kammer des Einsatzes, wobei Sie sicherstellen, dass die Einsatzmembran vollständig eingetaucht ist.
30. Die Einsätze 1 h lang in kristallvioletter Lösung bei Raumtemperatur inkubieren. Um die Farbe optimal zu erhalten, führen Sie die nächsten Schritte schnell und mit jeweils nur einer Einlage aus.
    1. Kristallviolette Lösung aus der Vertiefung und der oberen Kammer des Einsatzes aspirieren und 3x mit PBS waschen. Wischen Sie die obere Kammer erneut mit einem Wattestäbchen ab.
    2. Legen Sie den Einsatz in eine Vertiefung in einer neuen 24-Well-Platte, die 1 ml PBS enthält. Platzieren Sie die Platte über einem inversen Mikroskop, an dem eine Kamera angebracht ist. Nehmen Sie mit dem 10-fach-Objektiv Bilder von vier zufälligen Bereichen in der Mitte des Einsatzes auf und konzentrieren Sie sich nur auf die Unterseite des Einsatzes.
31. Nachdem Sie dies mit jeder Vertiefung durchgeführt haben, laden Sie Bilder in die Bildverarbeitungssoftware Ihrer Wahl hoch und passen Sie den Hintergrund an, um den Kontrast zu den violett gefärbten Zellen zu verstärken. Zählen Sie die Zellen manuell mit einem Zellzähler.

Ergebnisse

Die Stimulation von AdMSCs mit TNFα oder Interferon-gamma (IFNγ) für 24 Stunden führt zu Veränderungen in der Expression von entzündungshemmenden Molekülen und Wachstumsfaktoren. Die Behandlung von AdMSCs mit TNFα oder Interferon-gamma (IFNγ) erhöht die mRNA des TNF-stimulierten Gens 6 (TSG-6), während TNFα, aber nicht IFNγ, einen Anstieg der mRNA des transformierenden Wachstumsfaktors beta-1 (TGFβ-1) verursacht. Die Stimulation mit TNFα oder IFNγ induziert einen Anstieg der mRNA des vas...

Diskussion

In dieser Arbeit demonstrieren wir ein zuverlässiges und relativ kostengünstiges Protokoll zur Bewertung der Auswirkungen von aus Fett gewonnenen mesenchymalen Stromazellen (AdMSCs) auf die Verringerung der Prionen-induzierten Entzündung in einem Gliazellmodell. AdMSCs können leicht isoliert und in Kultur für den Einsatz in nur 1 Woche erweitert werden. Dieses Protokoll erzeugt konsistent eine heterologe Population von Zellen, die durch Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie Marker exprimieren, die mit denen von ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	Cytiva	SH30042.01
5 mL serological pipets	Celltreat	229005B
6-well tissue culture plates	Celltreat	229106
10 cm cell culture dishes	Peak Serum	PS-4002
10 ml serological pipets	Celltreat	229210
15 mL conical tubes	Celltreat	667015B
50 mL conical tubes	Celltreat	667050B
BV2 microglia cell line	AcceGen Biotech	ABC-TC212S
Cell lifter	Biologix Research Company	70-2180
Crystal violet	Electron Microscopy Sciences	12785
Dispase	Thermo Scientific	17105041
DMEM/F12	Caisson Labs	DFL14-500ML
DNase-I	Sigma Aldrich	11284932001
Essential amino acids	Thermo Scientific	11130051
Ethanol (100%)	EMD Millipore	EX0276-1
Fetal bovine serum (heat inactivated)	Peak Serum	PS-FB4	Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory
Formaldehyde	EMD Millipore	1.04003.1000
Glass 10 mL serological pipet	Corning	7077-10N
Hank’s Balances Salt Solution	Sigma Aldrich	H8264-500ML
Hemocytometer/Neubauer Chamber	Daigger	HU-3100
High Glucose DMEM	Cytiva	SH30022.01
low glucose DMEM containing L-glutamine	Cytiva	SH30021.01
MEM/EBSS	Cytiva	SH30024.FS
non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145-100M
Paraformaldehyde (16%)	MP Biomedicals	219998320
Penicillin/streptomycin/neomycin	Sigma-Aldrich	P4083-100ML
Phosphate buffered saline	Cytiva	SH30256.01
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein	R&D Systems	485-MI
Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF	R&D Systems	410-MT
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later.
Stemxyme	Worthington Biochemical Corporation	LS004106	Collagenase/Dispase mixture
Sterile, individually wrapped cotton swab	Puritan Medical	25-8061WC
Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm	Greiner Bio-One	662638
Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm	Greiner Bio-One	657641