프리온 유발 염증을 줄이기 위해 원발성 혼합 신경교세포와 공동 배양된 지방 유래 중간엽 기질 세포

요약

지방 유래 중간엽 기질 세포(AdMSC)는 염증과 관련된 질병을 치료하는 데 유용한 강력한 면역 조절 특성을 가지고 있습니다. 쥐 AdMSC와 원발성 혼합 신경교세포를 분리 및 배양하고, AdMSC를 자극하여 항염증 유전자 및 성장 인자를 상향 조절하고, AdMSC의 이동을 평가하고, 원발성 혼합 프리온 감염 신경교세포와 AdMSC를 공동 배양하는 방법을 보여줍니다.

초록

중간엽 기질 세포(MSC)는 항염증성 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자의 생성을 통해 염증을 강력하게 조절합니다. 이 세포는 프리온 질환 및 기타 단백질 접힘 장애와 같은 신경 퇴행성 질환의 맥락에서 신경 염증을 조절하는 능력을 보여줍니다. 프리온 질환은 산발적이거나, 후천적이거나, 유전적일 수 있습니다. 이는 뇌에서 프리온 단백질의 잘못된 접힘과 응집으로 인해 발생할 수 있습니다. 이러한 질병은 항상 치명적이며 사용할 수 있는 치료법이 없습니다.

질병의 초기 징후 중 하나는 성상교세포와 미세아교세포의 활성화 및 관련 염증으로, 이는 감지 가능한 프리온 응집과 신경 세포 손실 이전에 발생합니다. 따라서 MSC의 항염증 및 조절 특성을 수확하여 프리온 질환에서 성상교증을 치료할 수 있습니다. 최근에는 BV2 세포 또는 원발성 혼합 신경교세포와 함께 배양한 지방 유래 MSC(AdMSCs)가 파라크린 신호전달을 통해 프리온 유발 염증을 감소시킨다는 것을 보여주었습니다. 이 논문은 프리온 유발 염증을 줄이기 위해 자극된 AdMSC를 사용하는 신뢰할 수 있는 치료법에 대해 설명합니다.

AdMSC의 이형접합 집단은 쥐 지방 조직에서 쉽게 분리하고 배양에서 확장할 수 있습니다. 염증성 사이토카인으로 이러한 세포를 자극하면 프리온에 감염된 뇌 균질화로 이동하고 이에 대한 반응으로 항염증 조절제를 생성하는 능력이 향상됩니다. 이러한 기법은 프리온 감염에 대한 MSC의 치료 가능성을 조사하는 데 사용할 수 있으며 다른 단백질 접힘 및 신경 염증성 질환에도 적용할 수 있습니다.

서문

신경교세포 염증은 파킨슨병, 알츠하이머병, 프리온 질환 등 다양한 신경퇴행성 질환에서 중요한 역할을 합니다. 비정상적인 단백질 응집은 질병 발병 기전과 신경 퇴행의 많은 원인에 기인하지만, 신경교세포(glial cell)도 이 ^1,2,3을 악화시키는 역할을 합니다. 따라서 신경교세포 유발 염증을 표적으로 하는 것은 유망한 치료법입니다. 프리온 질환에서 세포 프리온 단백질(PrP^C)은 질병 관련 프리온 단백질(PrP^Sc)로 잘못 접혀 올리고머를 형성하고 응집하여 뇌의 항상성을 방해합니다 ^4,5,6.

프리온 질환의 초기 징후 중 하나는 성상교세포(astrocyte)와 미세아교세포(microglia)의 염증 반응입니다. 미세아교세포(microglia)를 제거하거나 성상세포(astrocyte)를 변형시켜 이러한 반응을 억제하는 연구는 일반적으로 동물 모델에서 질병 발병기전을 개선하지 않거나 악화시키는 것으로 나타났습니다 ^7,8,9. 신경교 염증을 제거하지 않고 조절하는 것은 치료법으로서 흥미로운 대안입니다.

중간엽 기질 세포(MSCs)는 파라크린 방식으로 염증을 조절하는 능력으로 인해 다양한 염증성 질환의 치료법으로 자리 잡았습니다 ^10,11. 그들은 항염증 분자, 성장 인자, microRNA 등을 분비함으로써 염증 부위로 이동하고 이러한 환경에서 신호 분자에 반응하는 능력을 보여주었습니다 10,12,13. 우리는 이전에 지방 조직에서 유래한 MSC(AdMSC로 표시)가 프리온에 감염된 뇌 균질액으로 이동하고 항염증성 사이토카인 및 성장 인자에 대한 유전자 발현을 상향 조절함으로써 이 뇌 균질액에 반응할 수 있음을 입증했습니다.

또한, AdMSC는 BV2 미세아교세포와 원발성 혼합교세포(primary mixed glia ¹⁴) 모두에서 3(NLRP3) 인플라마좀 신호전달 및 신경교세포 활성화를 포함하는 Nod-Like Receptor family pyrin domain인 Nuclear Factor-kappa B(NF-κB)와 관련된 유전자의 발현을 감소시킬 수 있습니다. 여기에서는 마우스에서 AdMSC와 원발성 혼합 신경교세포를 모두 분리하고, AdMSC를 자극하여 조절 유전자를 상향 조절하고, AdMSC 이동을 평가하고, AdMSC를 프리온 감염 신경교세포와 함께 배양하는 방법에 대한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 이러한 절차가 신경 퇴행성 및 기타 질병에서 신경교 유발 염증을 조절하는 데 있어 MSC의 역할에 대한 추가 연구를 위한 기초를 제공할 수 있기를 바랍니다.

프로토콜

마우스는 콜로라도 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)가 승인한 프로토콜 #1138에 따라 국제 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회(Association for Assessment and Accreditation of Lab Animal Care International)의 인증을 받은 콜로라도 주립 대학의 실험실 동물 자원(Lab Animal Resources)에서 사육 및 유지되었습니다.

1. 프리온으로 원발성 피질 혼합 아교세포를 분리하고 감염시키는 것

1. 성상교세포(astrocyte)와 미세아교세포(microglia)를 모두 포함하는 원발성 혼합교세포(primary mixed glia)를 분리하기 위해, 0일에서 2일 된 생쥐 새끼 C57Bl/6을 획득합니다.
   참고: 이 프로토콜은 이전 프로토콜 ^15,16에서 조정되었습니다.
2. 참수로 한 번에 한 마리씩 새끼를 안락사시키고 뇌를 추출하여 소뇌와 뇌간을 분리하고 폐기합니다.
   1. 2x 페니실린/스트렙토마이신/네오마이신(PSN)이 포함된 차가운 MEM/EBSS가 들어 있는 3cm 페트리 접시에 뇌를 놓습니다. 해부 범위에서 뇌 반구를 분리하고 중뇌를 제거하고 버립니다. 피질에서 해마와 수막을 제거하고 버립니다.
   2. 5mL의 MEM/EBSS + 2x PSN이 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브에 두 피질 반구를 놓고 얼음 위에 놓습니다.
3. 조직 배양 후드에서 피펫으로 부드럽게 흡인하여 50mL 원뿔형 튜브에서 배지를 제거하고 피질 조직 조각은 튜브 바닥에 남겨 둡니다. 코팅된 유리 피펫을 사용하여 10mL의 예열된 해리 배지를 추가하고 유리 피펫으로 조직을 10-20배 삼각화합니다.
4. 현탁액을 작은 교반 막대가 들어 있는 50mL 비커로 옮기고 가장 낮은 설정인 약 30rpm에서 10분 동안 교반 플레이트에 놓습니다. 교반 플레이트에서 비커를 제거하고 30분 동안 3° 각도로 설정하여 조직이 바닥에 가라앉을 수 있도록 합니다. 세포 현탁액(상층액)을 제거하고 얼음 위에 있는 새 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
5. DNase-I(4,000U/mL)를 10mL의 해리 배지에 넣고 조직을 재현탁시키고 추가로 10분 동안 저어줍니다. 새로운 해리 매체(DNase-I 제외)를 2-4회 추가하고(사용된 새끼 쥐 2마리당 1회) 세포 현탁액을 얼음 위의 50mL 원뿔형 튜브로 옮기는 방식으로 반복합니다.
6. 4°C에서 1,000× g 의 원추형 튜브에서 셀 현탁액을 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 신경교 성장 배지로 교체합니다. 혈구계로 세포를 계수하고 10^{6 in} 10 cm 세포 배양 처리 접시의 밀도로 세포를 플레이트합니다. 37 ° C의 인큐베이터에 5 % CO₂ 와 함께 넣습니다.
7. 24시간 후 미디어를 제거하고 새로운 신경교 미디어로 교체합니다. 세포가 2주 이내에 100% 합류점에 도달하도록 하십시오. 그런 다음 실험을 위해 분리하고 접시에 담습니다.
8. 시험관 내 프리온 감염의 경우 6-웰 플레이트에서 웰당 100,000개의 세포로 신경교세포를 플레이트하고 80%-100% 합류에 도달할 수 있도록 합니다. PBS에서 20%로 희석된 프리온 및 정상 뇌 균질액을 세포 배양에 추가하기 전에 30분 동안 UV 광선에 노출시킵니다. 감염될 신경교세포에서 액액을 흡인하고 각 웰에 0.1% 정상 또는 프리온 뇌 균질액의 최종 부피를 포함하는 1.5-2mL의 신경교세포 성장 배지를 추가합니다.
9. 72시간 후 배지를 흡인하고 PBS로 세포를 세척하여 잔류 뇌 균질액을 제거합니다. 신선한 신경교세포 성장 배지(뇌 균질액 없음)로 교체하십시오.
10. AdMSCs 세포를 분리하려면 혈청학적 피펫을 사용하여 ~1mL의 HBSS/Trypsin 용액과 함께 지방 조직을 부드럽게 흡인합니다. 200 U/mL DNase-I 및 400 U/mL 콜라겐분해효소/Dispase 혼합물과 함께 2 mL의 DMEM/F12 배지가 들어 있는 4cm 페트리 접시에 옮깁니다. 작은 가위로 지방 조직 덩어리를 작은 조각(크기 5mm 미만)으로 자르고 37°C에서 1.5시간 동안 배양합니다.
11. 페트리 접시의 내용물을 혈청학적 피펫이 있는 50mL 원뿔형 튜브로 옮기고 혼합물을 피펫으로 ~10배 triturate합니다. 조직이 쉽게 분리되고 상대적으로 균질한 혼합물을 형성하는지 확인하십시오. 혼합물을 4°C에서 1,000× g 에서 5분 동안 원심분리하여 빨간색으로 나타나는 기질 혈관 분획을 펠릿화합니다.
12. 상층액을 조심스럽게 흡입하고 5mL의 예열된 멸균 PBS로 펠릿을 세척하고 4°C에서 1,000× g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 펠릿을 1mL의 AdMSC 배지(L-글루타민을 함유하고 15% 열불활성화 소 태아 혈청(hiFBS), 1% 아미노산, 1% 비필수 아미노산 및 1% PSN이 보충된 저포도당 DMEM)에 재현탁시킵니다.
13. 새로운 멸균 50mL 코니컬 튜브 위에 40μm 세포 여과기를 놓고 여과기를 통해 세포 현탁액을 피펫하여 해리되지 않은 조직을 제거합니다. 10cm 세포 배양 처리된 접시에 9mL의 AdMSC 배지를 추가하고 변형된 세포 현탁액을 접시에 피펫합니다. 37 ° C의 인큐베이터에 5 % CO₂ 와 함께 넣습니다.
14. 다음 날 제거하고 새 AdMSC 미디어로 교체합니다. 세포가 80-90% 합류할 때까지 기다렸다가 72시간에서 96시간 사이를 통과할 준비가 될 때까지 기다립니다.
15. 위에서 설명한 대로 AdMSC를 분리하고 두 번 통과시켜 일관된 균질한 집단을 얻습니다 ¹⁴. 멸균 PBS로 세포를 두 번 세척하고 각 플레이트에 미리 데워진 트립신 2mL(0.25%)를 피펫합니다. 37°C에서 5분 동안 또는 플레이트에서 완전히 떨어질 때까지 세포를 배양합니다. 각 플레이트에 8mL의 사전 예열된 AdMSC 배지를 추가하고, 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 혼합하고, 원추형 튜브로 옮기고, 4°C에서 1,000 ×g 으로 원심분리하여 펠릿으로 만듭니다.
16. 3-10mL의 배지에 AdMSC를 재현탁시키고(사용된 플레이트 수에 따라 다름) 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. AdMSC 매체가 포함된 6웰 플레이트에서 100,000개 세포/웰을 플레이트합니다. 37 ° C의 인큐베이터에 5 % CO₂ 와 함께 밤새 넣습니다.
17. 다음 날, 사이토카인(cytokine) 또는 뇌 균질화(brain homogenate)로 세포를 자극합니다.
    1. 사이토카인 자극 세포의 경우 10ng/mL TNFα 또는 200ng/mL IFNγ를 포함하는 AdMSC 배지를 만듭니다. 제어 웰을 위해 새 매체를 사용하십시오.
    2. 프리온에 감염된 뇌 균질화 치료의 경우, 말기에 감염된 프리온 마우스(22L 또는 RML 균주)에서 20%의 뇌 균질액(PBS)을 얻습니다. 대조군을 위해 0.1% 프리온 감염 또는 정상 뇌 균질화의 최종 농도로 AdMSC 배지를 만듭니다.
    3. 웰에서 배지를 흡입하고 1.5mL의 사이토카인 또는 뇌 균질액 함유 배지를 해당 웰에 피펫합니다. 세 번에 걸쳐 수행합니다. 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다.
18. 배지를 제거하고, 예열된 PBS로 세포를 2배 세척하고, 1% βME를 포함하는 용해 완충액 350mL를 각 웰에 첨가하여 RNA를 분리하고, 세포 리프터를 사용하여 세포 용해물을 제거합니다. DNase 분해 단계를 포함하여 mini kit 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA 분리를 수행합니다. RT-qPCR의 경우 샘플당 25ng의 RNA를 역전사하고 10mM에서 각 유전자에 대해 SYBR Green 및 primer로 cDNA를 증폭합니다. ^2-ΔΔCT 방법을 사용하여 mRNA 발현을 분석하고 참조 유전자 β-actin ¹⁷의 발현으로 정규화합니다.
    참고: 모든 RT-PCR은 MIQE 지침에 따라 수행되었습니다.
19. 웰당 50,000개의 세포로 BV2 미세아교세포를 플레이트링하거나 6웰 플레이트에서 웰당 100,000개의 세포로 1차 혼합 신경교세포를 플레이트합니다. 다음 날 BV2 세포를 0.1% 프리온 감염 또는 정상 뇌 균질액이 포함된 배지로 처리합니다. 혼합성 신경교세포의 경우 세포가 80-90% 합쳐져 뇌 균질액으로 감염될 때까지 기다립니다.
20. 뇌를 함유한 배지에서 세포를 배양하고 72시간 동안 균질화합니다. PBS로 세포를 2배 세척하여 남아 있는 뇌 균질화를 제거하고 새로운 배지를 추가한 후 인큐베이터로 돌아갑니다.
21. 공동 문화를 위해 통로 3의 AdMSC를 사용합니다. AdMSC를 자극하는 경우 10ng/mL TNFα가 포함된 배지를 사용하고 BV2 또는 혼합 신경교세포와 병용 배양하기 전에 24시간 동안 치료합니다. 자극된 AdMSC를 PBS로 3배 세척하여 남아 있는 TNFα를 제거했습니다.
22. 1.15단계에 설명된 대로 AdMSC를 트립시화하고 AdMSC 배지에 재현탁합니다.
23. AdMSC 현탁액을 4°C에서 1,000× g 에서 5분 동안 회전시킵니다. 이 시간 동안 BV2 세포 또는 혼합 신경교세포의 배지를 AdMSC 배지 웰당 2mL로 교체하고 공극 크기가 0.4마이크로미터인 6웰 플레이트용 인서트를 웰의 절반에 넣습니다. 각 인서트에 2mL의 AdMSC 배지를 추가하고 인서트를 받지 않는 웰에 2mL의 배지를 추가로 추가합니다.
24. AdMSC의 펠릿화가 완료되면 AdMSC 매체에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 혈구계로 AdMSC를 계수하고 각 삽입물에 50,000-100,000개의 세포를 추가합니다.
25. BV2 세포의 경우 24시간 동안 공동 배양합니다. 혼합성 신경교세포의 경우, 짧게는 24시간, 길게는 7일 동안 배양합니다.
26. 원하는 시간 동안 AdMSC로 배양한 후 인서트를 제거하고 폐기하거나 새 6웰 플레이트에 넣고 PBS로 인서트를 2회 세척하고 RNA 분리 키트에서 제공하는 완충액을 혼합 신경교세포 또는 BV2 세포에 추가하고 인서트를 긁어 AdMSC RNA를 분석합니다.
27. 통로 2의 AdMSC를 10ng/mL TNFα가 포함된 배지로 처리합니다. 다음 날, 예열된 멸균 PBS 3x로 세포를 세척하고 혈청이 없는 AdMSC 배지에서 4시간 동안 배양합니다.
28. 이동 세포 분석을 수행하려면 인서트당 25,000개의 AdMSC를 추가하고 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양합니다. 이 시간 동안 이동 세포는 삽입체의 상단 챔버에서 이동하여 삽입체의 아래쪽에 부착됩니다. 웰과 인서트의 내용물을 조심스럽게 흡입하고 PBS로 2회 세척하고 각 웰에 1mL의 PBS를 남겨 인서트의 양쪽이 축축한 상태로 유지되도록 합니다.
29. 집게를 사용하여 한 번에 하나씩 삽입물을 제거하고 면봉으로 상단 챔버를 부드럽지만 철저하게 닦아 이동하지 않은 세포를 제거합니다. 나머지 PBS를 흡입하고 500μL의 결정 보라색 용액을 인서트의 웰과 상단 챔버 모두에 피펫하여 인서트 멤브레인이 완전히 잠기도록 합니다.
30. 인서트를 실온의 크리스탈 바이올렛 용액에서 1시간 동안 배양합니다. 컬러를 가장 잘 유지하려면 한 번에 하나의 인서트만 사용하여 다음 단계를 빠르게 수행하십시오.
    1. 인서트의 웰과 상단 챔버에서 크리스탈 바이올렛 용액을 흡입하고 PBS로 3번 세척합니다. 면봉으로 상단 챔버를 다시 닦습니다.
    2. 인서트를 1mL의 PBS가 들어 있는 새 24웰 플레이트의 웰에 넣습니다. 카메라가 부착된 도립 현미경 위에 플레이트를 놓습니다. 10x 대물렌즈를 사용하여 인서트의 아래쪽에만 초점을 맞춰 인서트 중앙을 향해 4개의 무작위 영역의 이미지를 촬영합니다.
31. 각 웰에 대해 이 작업을 수행한 후 선택한 이미지 처리 소프트웨어에 이미지를 업로드하고 배경을 조정하여 보라색으로 염색된 셀과의 대비를 향상시킵니다. 셀 카운터를 사용하여 수동으로 셀을 계산합니다.

결과

TNFα 또는 인터페론 감마(IFNγ)로 AdMSC를 24시간 동안 자극하면 항염증 분자 및 성장 인자의 발현 변화를 유도합니다. AdMSC를 TNFα 또는 인터페론 감마(IFNγ)로 처리하면 TNF 자극 유전자 6(TSG-6) mRNA가 증가하는 반면, TNFα는 IFNγ가 아닌 형질전환성장인자베타-1(TGFβ-1) mRNA가 증가합니다. TNFα 또는 IFNγ로 자극하면 혈관 내피 성장 인자(VEGF) mRNA의 증가를 유도하지만 섬유아세포 성장 인자(FGF) m...

토론

여기에서는 신경교세포 모델에서 프리온 유발 염증을 감소시키는 지방 유래 중간엽 기질 세포(AdMSCs)의 효과를 평가하기 위한 신뢰할 수 있고 상대적으로 저렴한 프로토콜을 보여줍니다. AdMSC는 배양에서 쉽게 분리하고 증식하여 1주일 이내에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 면역형광 및 유세포 분석에 의해 중간엽 기질 세포의 마커와 일치하는 마커를 발현하는 이종 세포 집단을 일관되게 생?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	Cytiva	SH30042.01
5 mL serological pipets	Celltreat	229005B
6-well tissue culture plates	Celltreat	229106
10 cm cell culture dishes	Peak Serum	PS-4002
10 ml serological pipets	Celltreat	229210
15 mL conical tubes	Celltreat	667015B
50 mL conical tubes	Celltreat	667050B
BV2 microglia cell line	AcceGen Biotech	ABC-TC212S
Cell lifter	Biologix Research Company	70-2180
Crystal violet	Electron Microscopy Sciences	12785
Dispase	Thermo Scientific	17105041
DMEM/F12	Caisson Labs	DFL14-500ML
DNase-I	Sigma Aldrich	11284932001
Essential amino acids	Thermo Scientific	11130051
Ethanol (100%)	EMD Millipore	EX0276-1
Fetal bovine serum (heat inactivated)	Peak Serum	PS-FB4	Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory
Formaldehyde	EMD Millipore	1.04003.1000
Glass 10 mL serological pipet	Corning	7077-10N
Hank’s Balances Salt Solution	Sigma Aldrich	H8264-500ML
Hemocytometer/Neubauer Chamber	Daigger	HU-3100
High Glucose DMEM	Cytiva	SH30022.01
low glucose DMEM containing L-glutamine	Cytiva	SH30021.01
MEM/EBSS	Cytiva	SH30024.FS
non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145-100M
Paraformaldehyde (16%)	MP Biomedicals	219998320
Penicillin/streptomycin/neomycin	Sigma-Aldrich	P4083-100ML
Phosphate buffered saline	Cytiva	SH30256.01
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein	R&D Systems	485-MI
Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF	R&D Systems	410-MT
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later.
Stemxyme	Worthington Biochemical Corporation	LS004106	Collagenase/Dispase mixture
Sterile, individually wrapped cotton swab	Puritan Medical	25-8061WC
Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm	Greiner Bio-One	662638
Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm	Greiner Bio-One	657641