Cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux co-cultivées avec des cellules gliales mixtes primaires pour réduire l’inflammation induite par les prions

Résumé

Les cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (AdMSC) ont de puissantes propriétés immunomodulatrices utiles pour traiter les maladies associées à l’inflammation. Nous montrons comment isoler et cultiver des AdMSC murins et des cellules gliales mixtes primaires, stimuler les AdMSCs pour réguler à la hausse les gènes anti-inflammatoires et les facteurs de croissance, évaluer la migration des AdMSCs et co-cultiver des AdMSCs avec des cellules gliales mixtes primaires infectées par des prions.

Résumé

Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont de puissants régulateurs de l’inflammation grâce à la production de cytokines anti-inflammatoires, de chimiokines et de facteurs de croissance. Ces cellules montrent une capacité à réguler la neuroinflammation dans le contexte de maladies neurodégénératives telles que la maladie à prions et d’autres troubles du mauvais repliement des protéines. Les maladies à prions peuvent être sporadiques, acquises ou génétiques ; Ils peuvent résulter du mauvais repliement et de l’agrégation de la protéine prion dans le cerveau. Ces maladies sont invariablement mortelles, sans traitement disponible.

L’un des premiers signes de la maladie est l’activation des astrocytes et de la microglie et l’inflammation associée, qui se produit avant l’agrégation détectable des prions et la perte neuronale ; ainsi, les propriétés anti-inflammatoires et régulatrices des CSM peuvent être récoltées pour traiter l’astrogliose dans la maladie à prions. Récemment, nous avons montré que les CSM dérivées du tissu adipeux (AdMSC) co-cultivées avec des cellules BV2 ou des cellules gliales mixtes primaires réduisent l’inflammation induite par les prions par la signalisation paracrine. Cet article décrit un traitement fiable utilisant des AdMSC stimulées pour réduire l’inflammation induite par les prions.

Une population hétérozygote d’AdMSC peut facilement être isolée du tissu adipeux murin et développée en culture. La stimulation de ces cellules avec des cytokines inflammatoires améliore leur capacité à migrer vers l’homogénat cérébral infecté par les prions et à produire des modulateurs anti-inflammatoires en réponse. Ensemble, ces techniques peuvent être utilisées pour étudier le potentiel thérapeutique des CSM sur l’infection à prions et peuvent être adaptées à d’autres maladies neuro-inflammatoires et de mauvais repliement des protéines.

Introduction

L’inflammation gliale joue un rôle clé dans diverses maladies neurodégénératives, notamment la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer et les maladies à prions. Bien que l’agrégation anormale des protéines soit attribuée à une grande partie de la pathogenèse de la maladie et de la neurodégénérescence, les cellules gliales jouent également un rôle dans l’exacerbation de ce ^1,2,3. Par conséquent, cibler l’inflammation induite par les glies est une approche thérapeutique prometteuse. Dans la maladie à prions, la protéine prion cellulaire (PrP^C) se replie à tort en protéine prion associée à la maladie (PrP^Sc), qui forme des oligomères et s’agrège et perturbe l’homéostasie dans le cerveau ^4,5,6.

L’un des premiers signes de maladie à prions est une réponse inflammatoire des astrocytes et de la microglie. Les études supprimant cette réponse, soit par l’ablation de la microglie, soit par la modification des astrocytes, n’ont généralement montré aucune amélioration ou une aggravation de la pathogenèse de la maladie dans des modèles animaux ^7,8,9. Moduler l’inflammation gliale sans l’éliminer est une alternative thérapeutique intrigante.

Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) ont pris le devant de la scène en tant que traitement de diverses maladies inflammatoires, en raison de leur capacité à moduler l’inflammation de manière paracrine ^10,11. Ils ont montré la capacité de migrer vers des sites d’inflammation et de répondre aux molécules de signalisation dans ces environnements en sécrétant des molécules anti-inflammatoires, des facteurs de croissance, des microARN, etc. 10,12,13. Nous avons précédemment démontré que les CSM dérivées du tissu adipeux (appelées AdMSC) sont capables de migrer vers l’homogénat cérébral infecté par des prions et de répondre à cet homogénat cérébral en régulant à la hausse l’expression des gènes des cytokines anti-inflammatoires et des facteurs de croissance.

De plus, les AdMSCs peuvent diminuer l’expression des gènes associés au facteur nucléaire-kappa B (NF-κB), à la signalisation de l’inflammasome de la famille des récepteurs de type Nod (NLRP3) et à l’activation gliale, à la fois dans la microglie BV2 et la glie mixte primaire ¹⁴. Ici, nous fournissons des protocoles sur la façon d’isoler à la fois les AdMSCs et les cellules gliales mixtes primaires de souris, de stimuler les AdMSCs pour réguler à la hausse les gènes modulateurs, d’évaluer la migration des AdMSC et de co-cultiver des AdMSCs avec des cellules gliales infectées par des prions. Nous espérons que ces procédures pourront fournir une base pour des recherches plus approfondies sur le rôle des CSM dans la régulation de l’inflammation induite par la glie dans les maladies neurodégénératives et autres.

Protocole

Les souris ont été élevées et entretenues au Lab Animal Resources de l’État du Colorado, accrédité par l’Association for Assessment and Accreditation of Lab Animal Care International, conformément au protocole #1138, approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université d’État du Colorado.

1. Isoler et infecter la glie mixte corticale primitive avec des prions

1. Pour isoler une glie mixte primaire contenant à la fois des astrocytes et des microglies, obtenir des petits souris C57Bl/6 âgés de zéro à deux jours.
   REMARQUE : Ce protocole est adapté des protocoles précédents ^15,16.
2. Euthanasiez les chiots un par un par décapitation et extrayez leur cerveau, en séparant et en jetant le cervelet et le tronc cérébral.
   1. Placez le cerveau dans une boîte de Pétri de 3 cm contenant du MEM/EBSS froid avec 2x Pénicilline/streptomycine/néomycine (PSN). Sous une lunette de dissection, séparez les hémisphères cérébraux et retirez et jetez le mésencéphale. Retirez et jetez l’hippocampe et les méninges du cortex.
   2. Placez les deux hémisphères corticaux dans un tube conique de 50 ml contenant 5 ml de MEM/EBSS + 2x PSN et placez-le sur de la glace.
3. Dans une hotte de culture tissulaire, retirer le milieu du tube conique de 50 mL en aspirant doucement à l’aide d’une pipette, en laissant les morceaux de tissu cortical au fond du tube. À l’aide d’une pipette en verre revêtu, ajouter 10 mL de milieu de dissociation préchauffé et triturer le tissu avec la pipette en verre 10-20x.
4. Transférez la suspension dans un bécher de 50 mL contenant une petite barre d’agitation et placez-la sur une plaque d’agitation au réglage le plus bas, environ 30 tr/min, pendant 10 min. Retirez le bécher de la plaque d’agitation et placez-le à un angle de 30° pendant 3 min pour permettre au tissu de se déposer au fond. Retirer la suspension cellulaire (surnageant) et transférer dans un nouveau tube conique de 50 mL sur de la glace.
5. Ajouter la DNase-I (4 000 U/mL) à 10 mL de milieu de dissociation, remettre le tissu en suspension et remuer pendant 10 minutes supplémentaires. Répétez l’opération en ajoutant un milieu de dissociation frais (sans DNase-I) 2 à 4 fois supplémentaires (une fois pour deux bébés souris utilisés) et en transférant la suspension cellulaire dans le tube conique de 50 ml sur de la glace, jusqu’à ce qu’il ne reste que du tissu fibreux au fond du bécher.
6. Centrifuger la suspension cellulaire dans le tube conique pendant 10 min à 1 000 × g à 4 °C. Aspirer le surnageant et le remplacer par un milieu de croissance glial. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et plaquez les cellules à une densité de 10^{6 dans des} boîtes de 10 cm traitées en culture cellulaire. Placer dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂.
7. Après 24 h, retirez le média et remplacez-le par un média glial frais. Laissez les cellules atteindre 100% de confluence en 2 semaines ; Ensuite, divisez-les et dressez-les pour l’expérimentation.
8. Pour l’infection à prions in vitro , la glie en plaques est de 100 000 cellules par puits en plaques à 6 puits et permet d’atteindre une confluence de 80 % à 100 %. Exposer les homogénats cérébraux, à prions et normaux, dilués à 20 % dans du PBS à la lumière UV pendant 30 minutes avant de les ajouter à la culture cellulaire. Aspirez le milieu de la glie à infecter et, dans chaque puits, ajoutez 1,5 à 2 ml de milieu de croissance gliale contenant un volume final de 0,1 % d’homogénat de cerveau normal ou à prions.
9. Après 72 h, aspirez le milieu et lavez les cellules avec du PBS pour éliminer tout homogénat cérébral résiduel. Remplacer par un milieu de croissance glial frais (ne contenant pas d’homogénats cérébraux).
10. Pour isoler les cellules AdMSC, utilisez une pipette sérologique et aspirez doucement le tissu adipeux avec ~1 mL de solution HBSS/Trypsine. Transférer dans une boîte de Pétri de 4 cm contenant 2 mL de média DMEM/F12 avec 200 U/mL de DNase-I et 400 U/mL de mélange de collagénase/dispase. À l’aide de petits ciseaux, coupez les morceaux de tissu adipeux en petits morceaux (moins de 5 mm) et incubez à 37 °C pendant 1,5 h.
11. Transférez le contenu de la boîte de Pétri dans un tube conique de 50 mL à l’aide d’une pipette sérologique et triturez le mélange ~10x avec la pipette. Assurez-vous que le tissu se décompose facilement et forme un mélange relativement homogène. Centrifuger le mélange à 4 °C pendant 5 min à 1 000 × g pour granuler la fraction vasculaire stromale, qui apparaîtra rouge.
12. Aspirer soigneusement le surnageant et laver la pastille avec 5 mL de PBS stérile préchauffé et la centrifuger à 4 °C à 1 000 × g pendant 3 min. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu AdMSC (DMEM à faible teneur en glucose contenant de la L-glutamine et complété par 15 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (hiFBS), 1 % d’acides aminés, 1 % d’acides aminés non essentiels et 1 % de PSN).
13. Placez une passoire cellulaire de 40 μm sur un tube conique stérile frais de 50 ml et faites passer la suspension cellulaire à travers la crépine pour éliminer tout tissu non dissocié. Ajouter 9 mL de milieu AdMSC dans une boîte de 10 cm traitée pour culture cellulaire et pipeter la suspension cellulaire filtrée dans la boîte. Placer dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂.
14. Retirez et remplacez-le par un support AdMSC frais le lendemain. Attendez que les cellules deviennent confluentes à 80-90% lorsqu’elles seront prêtes à être passées entre 72 h et 96 h.
15. Isoler les AdMSC comme décrit ci-dessus et passer deux fois pour obtenir une population homogène et cohérente ¹⁴. Laver les cellules deux fois avec du PBS stérile et déposer 2 mL de trypsine préchauffée (0,25 %) sur chaque plaque. Incuber les cellules à 37 °C pendant 5 minutes ou jusqu’à ce qu’elles soient complètement délogées de la plaque. Ajouter 8 mL de milieu AdMSC préchauffé dans chaque plaque, pipeter pour mélanger la suspension cellulaire, transférer dans le tube conique et centrifuger à 1 000 × g à 4 °C jusqu’à la granulation.
16. Remettre en suspension les CSMads dans 3 à 10 mL de milieu (selon le nombre de plaques utilisées) et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Plaque 100 000 cellules/puits dans des plaques à 6 puits contenant des milieux AdMSC. Placer dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant la nuit.
17. Le lendemain, stimulez les cellules avec des cytokines ou un homogénat cérébral.
    1. Pour les cellules stimulées par les cytokines, préparez des milieux AdMSC contenant soit 10 ng/mL de TNFα, soit 200 ng/mL d’IFNγ. Utilisez des milieux frais pour les puits témoins.
    2. Pour les traitements d’homogénat cérébral infecté par des prions, obtenir 20 % d’homogénat cérébral (en PBS) à partir de souris prions infectées en phase terminale (souches 22L ou RML). Réaliser des milieux AdMSC avec une concentration finale de 0,1 % d’infectés par des prions ou un homogénat cérébral normal pour les témoins.
    3. Aspirez le milieu hors des puits et pipetez 1,5 mL de milieu contenant des cytokines ou de l’homogénat cérébral vers les puits correspondants. Effectuez en trois exemplaires. Remettez les plaques dans l’incubateur.
18. Retirez le milieu, lavez les cellules 2 fois avec du PBS préchauffé, isolez l’ARN en ajoutant 350 ml de tampon de lyse contenant 1 % de βME dans chaque puits et utilisez un élévateur de cellules pour éliminer les lysats cellulaires. Effectuez l’isolement de l’ARN en suivant le protocole du fabricant du mini kit, y compris une étape de digestion de la DNase. Pour la RT-qPCR, transcrivez 25 ng d’ARN par échantillon et amplifiez l’ADNc avec SYBR Green et des amorces pour chaque gène à 10 mM. Analyser l’expression de l’ARNm à l’aide de la méthode ^2-ΔΔCT et normaliser l’expression du gène de référence β-actine ¹⁷.
    REMARQUE : Tous les tests RT-PCR ont été effectués conformément aux directives MIQE.
19. Plaque microglie BV2 à 50 000 cellules par puits, ou glie mixte primaire à 100 000 cellules par puits dans une plaque à 6 puits. Traitez les cellules BV2 le lendemain avec un milieu contenant 0,1 % d’homogénat cérébral infecté par des prions ou normal. Pour les cellules gliales mixtes, attendez que les cellules soient confluentes à 80-90% pour infecter avec l’homogénat cérébral.
20. Incuber des cellules dans des milieux contenant de l’homogénat cérébral pendant 72 h. Lavez les cellules 2 fois avec du PBS pour éliminer l’homogénat de cerveau restant, ajoutez un milieu frais et retournez dans l’incubateur.
21. Utiliser les AdMSCs au passage 3 pour la co-culture. Si vous stimulez les CSMad, utilisez un milieu contenant 10 ng/mL de TNFα et traitez pendant 24 h avant de co-cultiver avec une BV2 ou une glie mixte. Laver les CSMadm stimulées 3 fois avec du PBS pour éliminer tout TNFα restant.
22. Essayez les AdMSC comme décrit à l’étape 1.15 et suspendez-les à nouveau dans les médias AdMSC.
23. Spin AdMSC suspension à 1 000 × g à 4 °C pendant 5 min. Pendant ce temps, remplacez le milieu sur les cellules BV2 ou les cellules gliales mixtes par 2 mL par puits de milieu AdMSC et placez des inserts pour les plaques à 6 puits avec une taille de pores de 0,4 micromètre dans la moitié des puits. Ajouter 2 ml de média AdMSC dans chaque insert et 2 mL supplémentaires de média dans les puits qui ne reçoivent pas d’inserts.
24. Une fois la granulation des AdMSC terminée, remettez la pastille en suspension dans le milieu AdMSC. Comptez les AdMSC à l’aide d’un hémocytomètre et ajoutez 50 000 à 100 000 cellules à chaque insert.
25. Pour les cellules BV2, incuber des co-cultures pendant 24 h. Pour les cellules gliales mixtes, incuber pendant aussi peu que 24 h et jusqu’à 7 jours.
26. Après l’incubation avec des AdMSC pendant la durée souhaitée, retirez les inserts et jetez-les, ou placez-les dans une nouvelle plaque à 6 puits, lavez les inserts 2 fois avec du PBS, ajoutez le tampon fourni par le kit d’isolement de l’ARN aux cellules gliales ou BV2 mixtes, et grattez les inserts pour analyser l’ARN AdMSC.
27. Traiter les CSMadAd au passage 2 avec des milieux contenant 10 ng/mL de TNFα. Le lendemain, laver les cellules avec du PBS stérile préchauffé 3x et incuber dans un milieu AdMSC sans sérum pendant 4 h.
28. Pour effectuer un essai sur cellules migratrices, ajoutez 25 000 AdMSC par insert et incubez les cellules pendant 24 h à 37 °C. Pendant ce temps, les cellules migratrices se déplaceront de la chambre supérieure de l’insert et adhéreront à la face inférieure de l’insert. Aspirez soigneusement le contenu du puits et des inserts et lavez-les 2 fois avec du PBS, en laissant 1 ml de PBS dans chaque puits pour vous assurer que les inserts restent humides de chaque côté.
29. Un à la fois, à l’aide d’une pince, retirez les inserts et essuyez doucement mais soigneusement la chambre supérieure avec un coton-tige pour éliminer toutes les cellules qui n’ont pas migré. Aspirez le PBS restant et pipetez 500 μL de solution de violet cristallin dans le puits et la chambre supérieure de l’insert, en vous assurant que la membrane de l’insert est complètement immergée.
30. Incuber les inserts pendant 1 h dans une solution de violet cristallin à température ambiante. Pour conserver au mieux la couleur, effectuez les étapes suivantes rapidement, avec un seul insert à la fois.
    1. Aspirez la solution de cristal violet du puits et de la chambre supérieure de l’insert et lavez 3 fois avec du PBS. Essuyez à nouveau la chambre supérieure avec un coton-tige.
    2. Placez l’insert dans un puits dans une nouvelle plaque de 24 puits contenant 1 mL de PBS. Placez la plaque au-dessus d’un microscope inversé avec une caméra attachée. À l’aide de l’objectif 10x, prenez des images de quatre zones aléatoires vers le centre de l’insert, en vous concentrant uniquement sur la partie inférieure de l’insert.
31. Après avoir effectué cette opération avec chaque puits, téléchargez les images sur le logiciel de traitement d’image de votre choix et ajustez l’arrière-plan pour améliorer le contraste avec les cellules colorées en violet. Comptez les cellules manuellement à l’aide d’un compteur de cellules.

Résultats

La stimulation des CSMads avec du TNFα ou de l’interféron-gamma (IFNγ) pendant 24 h induit des modifications de l’expression des molécules anti-inflammatoires et des facteurs de croissance. Le traitement des CSMadAd avec du TNFα ou de l’interféron-gamma (IFNγ) augmente l’ARNm du gène 6 stimulé par le TNF (TSG-6), tandis que le TNFα, mais pas l’IFNγ, provoque une augmentation de l’ARNm du facteur de croissance transformant bêta-1 (TGFβ-1). La stimulation avec du TNFα ou de l’I...

Discussion

Ici, nous démontrons un protocole fiable et relativement peu coûteux pour évaluer les effets des cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (AdMSC) dans la diminution de l’inflammation induite par les prions dans un modèle de cellules gliales. Les AdMSCs peuvent facilement être isolées et développées en culture pour une utilisation en aussi peu qu’une semaine. Ce protocole produit systématiquement une population hétérologue de cellules qui expriment des marqueurs compatibles avec ceux...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	Cytiva	SH30042.01
5 mL serological pipets	Celltreat	229005B
6-well tissue culture plates	Celltreat	229106
10 cm cell culture dishes	Peak Serum	PS-4002
10 ml serological pipets	Celltreat	229210
15 mL conical tubes	Celltreat	667015B
50 mL conical tubes	Celltreat	667050B
BV2 microglia cell line	AcceGen Biotech	ABC-TC212S
Cell lifter	Biologix Research Company	70-2180
Crystal violet	Electron Microscopy Sciences	12785
Dispase	Thermo Scientific	17105041
DMEM/F12	Caisson Labs	DFL14-500ML
DNase-I	Sigma Aldrich	11284932001
Essential amino acids	Thermo Scientific	11130051
Ethanol (100%)	EMD Millipore	EX0276-1
Fetal bovine serum (heat inactivated)	Peak Serum	PS-FB4	Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory
Formaldehyde	EMD Millipore	1.04003.1000
Glass 10 mL serological pipet	Corning	7077-10N
Hank’s Balances Salt Solution	Sigma Aldrich	H8264-500ML
Hemocytometer/Neubauer Chamber	Daigger	HU-3100
High Glucose DMEM	Cytiva	SH30022.01
low glucose DMEM containing L-glutamine	Cytiva	SH30021.01
MEM/EBSS	Cytiva	SH30024.FS
non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145-100M
Paraformaldehyde (16%)	MP Biomedicals	219998320
Penicillin/streptomycin/neomycin	Sigma-Aldrich	P4083-100ML
Phosphate buffered saline	Cytiva	SH30256.01
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein	R&D Systems	485-MI
Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF	R&D Systems	410-MT
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later.
Stemxyme	Worthington Biochemical Corporation	LS004106	Collagenase/Dispase mixture
Sterile, individually wrapped cotton swab	Puritan Medical	25-8061WC
Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm	Greiner Bio-One	662638
Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm	Greiner Bio-One	657641