תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם בשומן מתורבתים יחד עם גליה מעורבת ראשונית כדי להפחית דלקת הנגרמת על ידי פריונים

Summary

לתאי סטרומה מזנכימליים שמקורם בשומן (AdMSCs) יש תכונות אימונומודולטוריות חזקות השימושיות לטיפול במחלות הקשורות לדלקת. אנו מדגימים כיצד לבודד ולגדל בתרבית של AdMSCs ותאי גליה מעורבים ראשוניים, לעורר AdMSCs כדי לווסת גנים אנטי דלקתיים וגורמי גדילה, להעריך הגירה של AdMSCs, ותרבית משותפת של AdMSCs עם גליה מעורבת ראשונית נגועה בפריון.

Abstract

תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs) הם רגולטורים רבי עוצמה של דלקת באמצעות ייצור ציטוקינים אנטי דלקתיים, כימוקינים וגורמי גדילה. תאים אלה מראים יכולת לווסת דלקת עצבית בהקשר של מחלות נוירודגנרטיביות כגון מחלת פריון והפרעות אחרות בקיפול שגוי של חלבונים. מחלות פריון יכולות להיות ספורדיות, נרכשות או גנטיות; הם יכולים לנבוע מקיפול שגוי וצבירה של חלבון פריון במוח. מחלות אלה הן תמיד קטלניות, ללא טיפולים זמינים.

אחד הסימנים המוקדמים ביותר למחלה הוא הפעלת אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה ודלקת קשורה, המתרחשת לפני צבירת פריונים הניתנים לגילוי ואובדן עצבי; לכן, תכונות אנטי דלקתיות רגולטוריות של MSCs ניתן לקצור לטיפול astrogliosis במחלת פריון. לאחרונה הראינו כי MSCs שמקורם בשומן (AdMSCs) בתרבית משותפת עם תאי BV2 או גליה מעורבת ראשונית מפחיתים דלקת הנגרמת על ידי פריונים באמצעות איתות פרקריני. מאמר זה מתאר טיפול אמין באמצעות AdMSCs מגורה כדי להפחית דלקת הנגרמת על ידי פריונים.

אוכלוסייה הטרוזיגוטית של AdMSCs יכולה בקלות להיות מבודדת מרקמת שומן מורין ולהרחיב בתרבית. גירוי תאים אלה עם ציטוקינים דלקתיים משפר את יכולתם גם לנדוד לכיוון הומוגנט מוחי נגוע פריונים וגם לייצר מודולטורים אנטי דלקתיים בתגובה. יחד, טכניקות אלה יכולות לשמש לחקר הפוטנציאל הטיפולי של MSCs על זיהום פריונים וניתן להתאים אותן לקיפול שגוי של חלבונים אחרים ולמחלות נוירו-דלקתיות.

Introduction

דלקת גליה ממלאת תפקיד מפתח במגוון מחלות נוירודגנרטיביות, כולל פרקינסון, אלצהיימר ומחלות פריונים. למרות שצבירה חריגה של חלבונים מיוחסת לחלק גדול מפתוגנזה של מחלות וניוון עצבי, תאי גליה גם ממלאים תפקיד בהחמרת ^1,2,3 זה. לכן, התמקדות בדלקת הנגרמת על ידי גליה היא גישה טיפולית מבטיחה. במחלת פריונים, חלבון הפריון התאי (PrP^C) מתקפל בטעות לחלבון פריון הקשור למחלה (PrP^Sc), היוצר אוליגומרים וצברים ומשבש את ההומאוסטזיס במוח ^4,5,6.

אחד הסימנים המוקדמים ביותר למחלת פריונים הוא תגובה דלקתית של אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה. מחקרים המדכאים תגובה זו, בין אם על ידי הסרת מיקרוגליה או שינוי של אסטרוציטים, בדרך כלל לא הראו שיפור או החמרה בפתוגנזה של מחלות במודלים ^של בעלי חיים ^7,8,9. ויסות דלקת גליה מבלי לחסל אותה היא חלופה מסקרנת כטיפול.

תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs) עלו על הבמה כטיפול במגוון מחלות דלקתיות, בשל יכולתם לווסת דלקת באופן פרקריני ^10,11. הם הראו יכולת לנדוד לאתרי דלקת ולהגיב למולקולות איתות בסביבות אלה על ידי הפרשת מולקולות אנטי דלקתיות, גורמי גדילה, מיקרו-רנ"א ועוד 10,12,13. הראינו בעבר כי MSCs שמקורם ברקמת השומן (מסומנים ב-AdMSCs) מסוגלים לנדוד לעבר הומוגנט מוחי נגוע בפריונים ולהגיב להומוגנט במוח זה על-ידי ויסות ביטוי גנים עבור ציטוקינים אנטי-דלקתיים וגורמי גדילה.

יתר על כן, AdMSCs יכולים להפחית את הביטוי של גנים הקשורים לגורם גרעיני-קאפה B (NF-κB), תחום הקולטן דמוי הנוד פירין המכיל 3 (NLRP3) איתות דלקתי, והפעלת גלייה, הן במיקרוגליה BV2 והן בגליה מעורבת ראשונית ¹⁴. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים כיצד לבודד הן AdMSCs והן גליה מעורבת ראשונית מעכברים, לעורר AdMSCs כדי לווסת גנים מודולטוריים, להעריך נדידת AdMSC, ותרבית משותפת AdMSCs עם גליה נגועה פריונים. אנו מקווים כי נהלים אלה יכולים לספק בסיס לחקירה נוספת של התפקיד של MSCs בוויסות דלקת הנגרמת על ידי גליה במחלות נוירודגנרטיביות ואחרות.

Protocol

עכברים גודלו והוחזקו ב- Lab Animal Resources של מדינת קולורדו, שהוסמך על ידי האגודה להערכה והסמכה של Lab Animal Care International, בהתאם לפרוטוקול #1138, שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קולורדו.

1. בידוד והדבקת גליה מעורבת קליפת המוח הראשונית עם פריונים

1. כדי לבודד תאי גליה מעורבים ראשוניים המכילים אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה, יש להשיג גורי עכברים C57Bl/6 בני אפס עד יומיים.
   הערה: פרוטוקול זה מותאם לפרוטוקולים קודמים ^15,16.
2. הרדימו גורים בזה אחר זה על ידי עריפת ראשים וחלצו את מוחם, תוך הפרדה והשלכת המוח הקטן וגזע המוח.
   1. הניחו את המוח בצלחת פטרי בקוטר 3 ס"מ המכילה MEM/EBSS קר עם 2x פניצילין/סטרפטומיצין/נאומיצין (PSN). תחת טווח ניתוח, להפריד את ההמיספרות במוח ולהסיר ולהשליך את המוח האמצעי. הסר והשלך את ההיפוקמפוס ואת קרומי המוח מקליפת המוח.
   2. מניחים את שתי ההמיספרות בקליפת המוח בצינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל 5 מ"ל MEM/EBSS + 2x PSN ומניחים על קרח.
3. במכסה מנוע של תרבית רקמה, הסר את המדיה מהצינור החרוטי של 50 מ"ל על ידי שאיפה עדינה עם פיפט, והשאיר את חתיכות רקמת קליפת המוח בתחתית הצינור. עם פיפט זכוכית מצופה, להוסיף 10 מ"ל של מדיה דיסוציאציה שחוממה מראש ו triturate את הרקמה עם צינור זכוכית 10-20x.
4. מעבירים את המתלים לכוס בנפח 50 מ"ל המכילה מוט ערבוב קטן ומניחים על צלחת ערבוב במצב הנמוך ביותר, כ-30 סל"ד, למשך 10 דקות. מוציאים את הכד מצלחת הערבוב ומניחים אותו בזווית של 30 מעלות למשך 3 דקות כדי לאפשר לרקמה לשקוע בתחתית. הסר את מתלה התא (supernatant) ולהעביר צינור חרוטי חדש 50 מ"ל על קרח.
5. הוסף DNase-I (4,000 U/mL) ל- 10 מ"ל של מדיית דיסוציאציה והשהה מחדש את הרקמה וערבב במשך 10 דקות נוספות. חזור על הפעולה על ידי הוספת מדיית דיסוציאציה טרייה (ללא DNase-I) 2-4 פעמים נוספות (פעם אחת עבור כל שני גורי עכברים בשימוש), והעברת תרחיף התא לצינור החרוטי 50 מ"ל על קרח, עד שנשארת רק רקמה סיבית בתחתית הכד.
6. צנטריפוגה את תרחיף התא בצינור החרוטי למשך 10 דקות ב 1,000 × גרם ב 4 ° C. שאפו את הסופרנאטנט והחליפו במדיום גדילת גלייה. לספור את התאים עם hemocytometer צלחת את התאים בצפיפות של 10⁶ ב 10 ס"מ תאים תרבית צלחת מטופלת. מניחים באינקובטור ב 37 °C (75 °F) עם 5% CO₂.
7. לאחר 24 שעות, הסר את המדיה והחלף אותה במדיית גליה טרייה. תן לתאים להגיע 100% מפגש בתוך 2 שבועות; לאחר מכן, לפצל וצלחת אותם לניסויים.
8. עבור זיהום פריון במבחנה , גליית צלחת ב 100,000 תאים לכל באר ב 6 צלחות באר ולאפשר להגיע 80%-100% מפגש. חשוף הומוגנאטים במוח, הן פריונים והן נורמליים, מדוללים עד 20% ב- PBS לאור UV במשך 30 דקות לפני הוספה לתרבית תאים. יש לשאוף שמדיה מחוץ לגליה להיות נגועה, ולכל באר, להוסיף 1.5-2 מ"ל של חומר גדילה גליה המכיל נפח סופי של 0.1% נורמלי או הומוגנט מוח פריון.
9. לאחר 72 שעות, שאפו מהמדיה ושטפו את התאים עם PBS כדי להסיר כל שאריות הומוגניות במוח. יש להחליף במצע גדילת גליה טרי (שאינו מכיל הומוגנאטים במוח).
10. כדי לבודד תאי AdMSCs, השתמש בפיפטה סרולוגית ושאפו בעדינות את רקמת השומן יחד עם ~1 מ"ל של תמיסת HBSS/טריפסין. מעבירים לצלחת פטרי בקוטר 4 ס"מ המכילה 2 מ"ל חומרי DMEM/F12 עם תערובת 200 U/mL DNase-I ו-400 U/mL collagenase/Dispase. בעזרת מספריים קטנים, חותכים את גושי רקמת השומן לחתיכות קטנות (פחות מ -5 מ"מ גודל) ודגרים ב 37 ° C במשך 1.5 שעות.
11. מעבירים את תכולת צלחת הפטרי לצינור חרוטי של 50 מ"ל עם צינור סרולוגי ומטריטורטים את התערובת ~ 10x עם הפיפט. יש לוודא שהרקמה מתפרקת בקלות ויוצרת תערובת הומוגנית יחסית. צנטריפוגה את התערובת ב 4 ° C במשך 5 דקות ב 1,000 × גרם כדי pellet את החלק כלי הדם סטרומה, אשר ייראה אדום.
12. יש לשאוף את הסופרנאטנט בזהירות ולשטוף את הגלולה עם 5 מ"ל PBS סטרילי שחומם מראש וצנטריפוגה ב 4 ° C ב 1,000 × גרם במשך 3 דקות. יש לשאוף את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיה AdMSC (DMEM דל גלוקוז המכיל L-גלוטמין ובתוספת 15% סרום בקר עוברי מומת חום (hiFBS), 1% חומצות אמינו, 1% חומצות אמינו לא חיוניות ו-1% PSN).
13. הניחו מסננת תאים בגודל 40 מיקרומטר על גבי צינור חרוטי סטרילי טרי בנפח 50 מ"ל והעבירו את תרחיף התא דרך המסננת כדי להסיר כל רקמה שאינה מנותקת. הוסיפו 9 מ"ל של חומרי אחסון AdMSC לצלחת שטופלה בתרבית תאים בקוטר 10 ס"מ והכניסו את תרחיף התאים המתוח לצלחת. מניחים באינקובטור ב 37 °C (75 °F) עם 5% CO₂.
14. הסר והחלף במדיה חדשה של AdMSC למחרת. המתן עד שהתאים יהפכו ל-80-90% נפגשים כאשר הם יהיו מוכנים למעבר בין 72 שעות ל-96 שעות.
15. בודד AdMSCs כמתואר לעיל ועבר פעמיים כדי להשיג אוכלוסייה הומוגנית עקבית ¹⁴. יש לשטוף תאים פעמיים עם PBS סטרילי ופיפטה 2 מ"ל של טריפסין שחומם מראש (0.25%) על כל צלחת. יש לדגור על תאים בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות או עד שהם נעקרים לחלוטין מהצלחת. הוסף 8 מ"ל של מדיה AdMSC שחוממה מראש לכל צלחת, צינור כדי לערבב את מתלה התא, להעביר לצינור החרוטי, וצנטריפוגה ב 1,000 × גרם ב 4 ° C לכדור.
16. Resuspend AdMSCs ב 3-10 מ"ל של מדיה (בהתאם למספר לוחות בשימוש) ולספור תאים באמצעות hemocytometer. צלחת 100,000 תאים/באר בצלחות 6 בארות המכילות מדיה AdMSC. מניחים באינקובטור ב 37 °C (75 °F) עם 5% CO₂ למשך הלילה.
17. למחרת, לעורר תאים עם ציטוקינים או הומוגנט המוח.
    1. עבור תאים מעוררי ציטוקינים, יש ליצור מדיית AdMSC המכילה TNFα של 10 ננוגרם/מ"ל או 200 ננוגרם/מ"ל IFNγ. השתמש במדיה טרייה עבור בארות בקרה.
    2. עבור טיפולים הומוגניים במוח נגועים בפריונים, להשיג 20% הומוגנט במוח (ב- PBS) מעכברי פריון נגועים סופניים (זני 22L או RML). הפוך את AdMSC למדיהעם ריכוז סופי של 0.1% נגוע פריון או מוח נורמלי הומוגנט עבור קבוצת ביקורת.
    3. שאפו מדיה מהבארות וצינור 1.5 מ"ל של מדיה המכילה ציטוקינים או מוח הומוגניים לבארות המתאימות. בצע בשלשה. החזרת צלחות לאינקובטור.
18. הסר את המדיה, שטוף תאים 2x עם PBS שחומם מראש, לבודד RNA על ידי הוספת 350 מ"ל של חיץ ליזה המכיל 1% βME לכל באר, ולהשתמש מרים תאים כדי להסיר lysates התא. בצע בידוד RNA בהתאם לפרוטוקול של יצרן ערכת ה- mini, כולל שלב עיכול DNase. עבור RT-qPCR, תעתיק לאחור 25 ng של RNA לכל דגימה והגבר cDNA עם SYBR Green ופריימרים עבור כל גן ב 10 mM. לנתח ביטוי mRNA בשיטת ^2-ΔΔCT ולנרמל לביטוי של גן הייחוס β-actin ¹⁷.
    הערה: כל RT-PCR נעשה בהתאם להנחיות MIQE.
19. מיקרוגליה צלחת BV2 ב 50,000 תאים לבאר, או גליה מעורבת ראשונית ב 100,000 תאים לבאר בצלחת 6 בארות. טפל בתאי BV2 למחרת עם מדיה המכילה 0.1% הומוגנט מוחי נגוע בפריונים או נורמלי. עבור גליה מעורבת, יש להמתין עד שהתאים יהיו 80-90% נפגשים כדי להדביק הומוגנט במוח.
20. לדגור על תאים במדיה המכילה הומוגנט במוח במשך 72 שעות. יש לשטוף תאים 2x עם PBS כדי להסיר את שאריות ההומוגניות במוח ולהוסיף מדיה טרייה ולחזור לאינקובטור.
21. השתמש AdMSCs במעבר 3 עבור תרבות משותפת. במקרה של גירוי AdMSCs, יש להשתמש במדיה המכילה 10 ננוגרם/מ"ל TNFα ולטפל במשך 24 שעות לפני תרבית משותפת עם BV2 או גליה מעורבת. Wash עורר AdMSCs 3x עם PBS כדי להסיר את כל TNFα שנותרו.
22. טריפסיניזציה של AdMSCs כמתואר בשלב 1.15 והשעיה מחדש במדיית AdMSC.
23. סחרור AdMSC מתלה ב-1,000 × גרם ב-4°C למשך 5 דקות. במהלך תקופה זו, החלף מדיה על תאי BV2 או גליה מעורבת עם 2 מ"ל לכל באר של מדיה AdMSC ומקם תוספות עבור לוחות 6 בארות עם גודל נקבוביות של 0.4 מיקרומטר לתוך מחצית הבארות. הוסף 2 מ"ל של מדיה AdMSC לכל תוספת ועוד 2 מ"ל של מדיה לבארות שאינן מקבלות תוספות.
24. בסיום השימוש בגלולות AdMSC, השהה מחדש את הגלולה במדיה של AdMSC. ספרו AdMSCs עם המוציטומטר והוסיפו 50,000-100,000 תאים לכל תוספת.
25. עבור תאי BV2, לדגור על תרביות משותפות במשך 24 שעות. עבור גליה מעורבת, לדגור רק 24 שעות ועד 7 ימים.
26. לאחר הדגירה עם AdMSCs למשך הזמן הרצוי, יש להסיר את התוספות ולהשליך, או להניח אותן בצלחת חדשה בעלת 6 בארות, לשטוף את התוספות 2x עם PBS, להוסיף חיץ המסופק על ידי ערכת בידוד RNA לתאי גליה מעורבים או BV2, ולגרד תוספות לניתוח RNA AdMSC.
27. יש לטפל ב-AdMSCs במעבר 2 עם מדיה המכילה 10 ננוגרם/מ"ל TNFα. למחרת, שטפו תאים עם PBS סטרילי שחומם מראש 3x ודגרו במדיה AdMSC נטולת סרום למשך 4 שעות.
28. כדי לבצע בדיקת תאים נודדים, הוסף 25,000 AdMSCs לכל הוספה ודגור על תאים במשך 24 שעות ב- 37 ° C. במהלך תקופה זו, תאים נודדים ינועו מהתא העליון של העלון וידבקו לחלק התחתון של העלון. שאפו בזהירות את תכולת הבאר והתוספות ושטפו 2x עם PBS, תוך השארת 1 מ"ל PBS בכל באר כדי להבטיח שהתוספות יישארו לחות מכל צד.
29. אחד בכל פעם, באמצעות מלקחיים, להסיר את תוספות בעדינות אבל ביסודיות לנגב את החדר העליון עם צמר גפן כדי להסיר את כל התאים שלא נדדו. שאפו את ה-PBS הנותרים ואת הצינור 500 μL של תמיסה סגולה גבישית הן לבאר והן לחדר העליון של העלון, וודאו שקרום ההחדרה שקוע במלואו.
30. תוספות הדגירה במשך שעה בתמיסה סגולה קריסטלית בטמפרטורת החדר. כדי לשמור על הצבע בצורה הטובה ביותר, בצע את השלבים הבאים במהירות, עם הוספה אחת בלבד בכל פעם.
    1. שאפו תמיסת קריסטל סגולה מהבאר ומהחדר העליון של האינסרט ושטפו 3x עם PBS. נגבו שוב את החדר העליון עם צמר גפן.
    2. מניחים את האינסרט בבאר בצלחת חדשה בת 24 בארות המכילה 1 מ"ל PBS. הניחו את הצלחת מעל מיקרוסקופ הפוך עם מצלמה מחוברת. בעזרת המטרה 10x, צלמו תמונות של ארבעה אזורים אקראיים לכיוון מרכז העלון, תוך התמקדות רק בצד התחתון של העלון.
31. לאחר ביצוע פעולה זו עם כל באר, העלה תמונות לתוכנת עיבוד התמונה הנבחרת, והתאם את הרקע כדי לשפר את הניגודיות עם התאים המוכתמים בסגול. ספור את התאים באופן ידני באמצעות מונה תאים.

תוצאות

גירוי AdMSCs עם TNFα או אינטרפרון-גמא (IFNγ) במשך 24 שעות גורם לשינויים בביטוי של מולקולות אנטי דלקתיות וגורמי גדילה. טיפול ב- AdMSCs עם TNFα או אינטרפרון-גמא (IFNγ) מגביר את הגן המגורה TNF 6 (TSG-6) mRNA, ואילו TNFα, אך לא IFNγ, גורם לעלייה בשינוי גורם גדילה בטא-1 (TGFβ-1) mRNA. גירוי עם TNFα או IFNγ גורם לעלייה בגורם ...

Discussion

כאן אנו מדגימים פרוטוקול אמין וזול יחסית להערכת ההשפעות של תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם בשומן (AdMSC) בהפחתת דלקת הנגרמת על ידי פריונים במודל תאי גלייה. ניתן בקלות לבודד ולהרחיב את AdMSCs בתרבית לשימוש תוך שבוע אחד בלבד. פרוטוקול זה מייצר באופן עקבי אוכלוסייה הטרולוגית של תאים המבטאים סמנים הת?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	Cytiva	SH30042.01
5 mL serological pipets	Celltreat	229005B
6-well tissue culture plates	Celltreat	229106
10 cm cell culture dishes	Peak Serum	PS-4002
10 ml serological pipets	Celltreat	229210
15 mL conical tubes	Celltreat	667015B
50 mL conical tubes	Celltreat	667050B
BV2 microglia cell line	AcceGen Biotech	ABC-TC212S
Cell lifter	Biologix Research Company	70-2180
Crystal violet	Electron Microscopy Sciences	12785
Dispase	Thermo Scientific	17105041
DMEM/F12	Caisson Labs	DFL14-500ML
DNase-I	Sigma Aldrich	11284932001
Essential amino acids	Thermo Scientific	11130051
Ethanol (100%)	EMD Millipore	EX0276-1
Fetal bovine serum (heat inactivated)	Peak Serum	PS-FB4	Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory
Formaldehyde	EMD Millipore	1.04003.1000
Glass 10 mL serological pipet	Corning	7077-10N
Hank’s Balances Salt Solution	Sigma Aldrich	H8264-500ML
Hemocytometer/Neubauer Chamber	Daigger	HU-3100
High Glucose DMEM	Cytiva	SH30022.01
low glucose DMEM containing L-glutamine	Cytiva	SH30021.01
MEM/EBSS	Cytiva	SH30024.FS
non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145-100M
Paraformaldehyde (16%)	MP Biomedicals	219998320
Penicillin/streptomycin/neomycin	Sigma-Aldrich	P4083-100ML
Phosphate buffered saline	Cytiva	SH30256.01
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein	R&D Systems	485-MI
Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF	R&D Systems	410-MT
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later.
Stemxyme	Worthington Biochemical Corporation	LS004106	Collagenase/Dispase mixture
Sterile, individually wrapped cotton swab	Puritan Medical	25-8061WC
Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm	Greiner Bio-One	662638
Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm	Greiner Bio-One	657641