نموذج الفئران لإصابة رضحية خفيفة مغلقة الرأس والتحقق من صحتها

Summary

هنا ، نقدم نموذجا لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة (mTBI) مغلقة الرأس ويظهر التحقق من صحتها تشابها ملحوظا مع mTBI البشري فيما يتعلق بالمظاهر السلوكية خلال المراحل الحادة وتحت الحادة.

Abstract

تعد النماذج الحيوانية ضرورية لتعزيز فهمنا لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة (mTBI) وتوجيه البحوث السريرية. لتحقيق رؤى ذات مغزى ، يعد تطوير نموذج حيواني مستقر وقابل للتكرار أمرا ضروريا. في هذه الدراسة ، أبلغنا عن وصف تفصيلي لنموذج mTBI مغلق الرأس وطريقة التحقق التمثيلية باستخدام فئران Sprague-Dawley للتحقق من تأثير النمذجة. يتضمن النموذج إسقاط وزن كتلة 550 جم من ارتفاع 100 سم مباشرة على رأس فأر على سطح قابل للتدمير ، يليه دوران 180 درجة. لتقييم الإصابة ، خضعت الفئران لسلسلة من التقييمات السلوكية العصبية بعد 10 دقائق من الإصابة ، بما في ذلك وقت فقدان الوعي ، ووقت البحث الأول عن السلوك ، والقدرة على الهروب ، واختبار قدرة توازن الحزمة. خلال المراحل الحادة وتحت الحادة بعد الإصابة ، تم إجراء اختبارات سلوكية لتقييم قدرة التنسيق الحركي (مهمة الحزمة) ، والقلق (اختبار المجال المفتوح) ، وقدرات التعلم والذاكرة (اختبار متاهة موريس المائية). أنتج نموذج mTBI مغلق الرأس استجابة متسقة للإصابة مع الحد الأدنى من الوفيات وتكرار مواقف الحياة الواقعية. تحققت طريقة التحقق بشكل فعال من تطوير النموذج وضمنت استقرار النموذج واتساقه.

Introduction

إصابات الدماغ الرضحية الخفيفة (mTBI) ، أو الارتجاج ، هي أكثر أنواع الإصابات انتشارا ويمكن أن تؤدي إلى أعراض مختلفة قصيرة الأجل ومزمنة¹. قد تشمل هذه الأعراض الدوخة والصداع والاكتئاب وانعدام التلذذ ، من بين أمور أخرى ، مما يؤدي إلى معاناة كبيرة للأفراد المصابين ب mTBI². نظرا لأن معظم إصابات الدماغ الرضية المتنقلة ناتجة عن صدمة القوة الحادة³ ، يصبح من الضروري تطوير نماذج حيوانية تحاكي بدقة مثل هذه الإصابات. هذه النماذج ضرورية لاكتساب فهم أفضل للإصابة وآلياتها الأساسية ، مما يوفر بيئة خاضعة للرقابة مع تقليل التباين وعدم التجانس مقارنة بالدراسات البشرية.

تم تطوير العديد من نماذج القوارض الراسخة لإصابات الدماغ الرضحية (TBI) ، بما في ذلك إصابة قرع السوائل (FPI) ⁴ ، والتأثير القشري المتحكم فيه (CCI) ⁵ ، وإصابة انخفاض الوزن⁶ ، وإصابات الدماغ الرضحية⁷ ، وغيرها. ومع ذلك ، تركز هذه النماذج بشكل أساسي على تكرار سيناريوهات إصابات الدماغ الرضية المتوسطة إلى الشديدة. في المقابل ، حظيت النماذج التجريبية المصممة خصيصا لمحاكاة mTBI باهتمام أقل نسبيا ولا تزال غير مستكشفة⁸. لذلك ، هناك حاجة ماسة لإنشاء نموذج حيواني مستقر وقابل للتكرار يمثل بدقة mTBI. مثل هذا النموذج من شأنه أن يعزز بشكل كبير فهمنا للعواقب العصبية البيولوجية والسلوكية المرتبطة ب mTBI.

لا يمكن للمرء أن يميز العجز الوظيفي في الفئران mTBI مقارنة بالفئران العادية عن طريق الملاحظة العرضية بعد زوال آثار التخدير. لذلك ، من الضروري إجراء اختبارات محددة. في البشر ، يتم استخدام مجموعة واسعة من التقييمات السريرية لتقييم المرضى^9،10،11. وبالمثل ، فإن إنشاء نموذج ناجح في نموذج الفئران يتطلب أيضا استخدام أدوات التقييم السريع لتحديد صلاحيته.

في هذه الدراسة ، نقدم نموذجا مغلقا للفئران mTBI ، مما يتيح التحقيق في mTBI بطريقة تشبه إلى حد كبير الحالة البشرية. يوفر الوصف التفصيلي للنموذج وإجراءات التحقق من صحته فهما شاملا للنهج التجريبي المستخدم في دراسة mTBI.

Protocol

تمت الموافقة على التجارب على من قبل لجنة رعاية واستخدام بجامعة سنترال ساوث. أجريت جميع الدراسات بما يتماشى مع المبادئ الأخلاقية والرفاهية لحيوانات المختبر.

1. تغذية وإجراء التخدير

1. منزل جماعي 280-320 جم من ذكور الفئران Sprague-Dawley والحفاظ عليها في دورة ضوء / ظلام لمدة 12 ساعة / 12 ساعة مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء حسب الحاجة. إجراء الدراسة بعد تأقلم الفئران لمدة 6 أيام.
2. تخدير الجرذ ب 3٪ إيزوفلوران عند تدفق هواء 0.6 لتر / دقيقة في صندوق الحث حتى لا يستجيب لقرصة المخلب أو الذيل. الحفاظ على معدل التدفق لمدة 30 ثانية.
   ملاحظة: لم يتم استخدام مسكنات الألم لأنها تتداخل مع استجابة الفئران في التقييمات السلوكية العصبية.

2. الإعداد قبل الجراحة

1. ضع إسفنجة ذات صلابة 35D (وزن 35 كجم / م 3 من الإسفنج) ، بطول وعرض متطابقين ولكن بسمك 12 سم ، داخل صندوق أكريليك (15 سم × 22 سم × 43 سم) يفتقر إلى الغطاء العلوي.
2. قم بقص رقائق القصدير (بسمك 20 ميكرومتر) وثبتها على صندوق الأكريليك باستخدام شريط لاصق لتشكيل سطح قابل للتدمير قادر على دعم وزن الفئران. بالإضافة إلى ذلك ، ضع علامة على خط مقطوع يبلغ قياسه حوالي 10 سم ليكون الموقع المخصص لوضع رأس الفأر.
3. بمساعدة حامل حديدي ، قم بتأمين أنبوب PVC بإحكام في مكانه. تحضير وزن مثقب ، يزن 550 غرام بقطر 18 ملم. نعلق الوزن على خط الصيد على ارتفاع 1 متر داخل كلوريد البولي فينيل أو أنبوب PVC. واضبط موضع أنبوب التوجيه 3 سم فوق ورق القصدير.
4. تحضير خوذة ووسادة. اصنع خوذة باستخدام قرص من الفولاذ المقاوم للصدأ يبلغ قطره 10 مم وسمكه 3 مم. قم بإعداد وسادة إسفنجية على شكل إسفين لوضعها تحت رأس الجرذ ، مع التأكد من أنها متعامدة مع اتجاه الجاذبية.
   ملاحظة: يتم عرض رسم تخطيطي لجهاز التأثير في الشكل 1. تخدم الخوذة غرض تحديد موقع الارتطام وتعزيز توزيع القوة الخارجية. يتم استخدام الوسادة لضمان ضرر موحد ومستقر.

3. تحريض mTBI

1. ضع بسرعة الفئران المخدرة على صدرها على رقائق القصدير.
   ملاحظة: هناك حاجة إلى عاملين لتحريض mTBI - أحدهما للتحضير والآخر للتحقق.
2. طريقة التحضير: ضع الوسادة أسفل الجرذ ، وتأكد من أن رأسه مواز لورق القصدير. محاذاة الخوذة مع آذان الفئران وتثبيتها في مكانها.
3. التحقق: تحقق من وضع أنبوب PVC مباشرة فوق الخوذة. بمجرد تأكيد كلا المشغلين للإعداد الصحيح ، انتقل إلى الخطوة التالية.
4. تحريض دوران الرأس: حرر الوزن ، مما يسمح له بالسقوط وضرب رأس الجرذ ، مما يؤدي إلى السقوط على الإسفنج ودوران 180 درجة.
5. ضع الفئران على ظهرها في قفص نظيف.

4. تحريض الشام

1. تعامل مع الفئران بنفس طريقة وصف تحريض mTBI السابق ، ولكن لا تعرضه لتأثير الرأس.

5. إجراء التحقق من الصحة: التقييمات السلوكية العصبية الحادة

ملاحظة: تم تعديل التقييمات التالية بناء على درجات الخطورة العصبية⁹ والبروتوكول بواسطة Flierl et ^al.10. تم إجراء جميع هذه التقييمات بعد 10 دقائق من استعادة الجرذ لرد الفعل الصحيح.

1. وقت فقدان الوعي: سجل المدة من وقت تخدير الجرذ إلى وقت تعافيه منعكس التصحيح.
   ملاحظة: رد الفعل الصحيح هو العملية التي ينقلب فيها الجرذ عند وضعه على ظهره. يجب اعتبار فقدان رد الفعل الصحيح نقطة نهاية إنسانية ، ويجب القتل الرحيم للحيوان وفقا للإرشادات المؤسسية.
2. وقت سلوك البحث الأول: سجل المدة من وقت تخدير الجرذ إلى الوقت الذي يظهر فيه سلوك البحث لأول مرة.
   ملاحظة: البحث عن السلوك هو علامة على الاهتمام بالبيئة ، استجابة فسيولوجية.
3. القدرة على الهروب
   1. ضع الجرذ في منتصف جهاز دائري (قطره 0.5 متر وارتفاعه 0.3 متر) مع مخرج (طوله 12.5 سم وعرضه 9 سم).
   2. سجل الوقت الذي يستغرقه الجرذ للخروج من الدائرة.
      ملاحظة: إذا لم يخرج الجرذ من الدائرة خلال 180 ثانية ، فقم بتسجيل الوقت على أنه 180 ثانية.
4. اختبار قدرة توازن الشعاع
   1. ضع الجرذ على شعاع بعرض 3 سم و 2 سم و 1.5 سم لمدة دقيقة واحدة وفقا لذلك.
   2. إذا حافظ الجرذ على توازن مع وضع ثابت على العارضة ، فقم بتسجيله على أنه 0.
   3. إذا أمسك الجرذ جانب الحزمة ، فامنح درجة 1. إذا عانق الجرذ الشعاع وسقط أحد أطرافه ، فقم بتسجيله على أنه 2.
   4. إذا عانق الجرذ الشعاع وسقط الطرفان عنه أو دوران عليه (>60 ثانية) ، فقم بتسجيله على أنه 3.
   5. إذا حاول الجرذ التوازن على العارضة ولكنه سقط (> 40 ثانية) ، فقم بتسجيله على أنه 4.
   6. إذا حاول الجرذ التوازن على العارضة ولكنه سقط (>20 ثانية) ، فقم بتسجيله على أنه 5.
   7. إذا لم يحاول الجرذ التوازن أو التعليق على العارضة وسقط في غضون 20 ثانية ، فقم بتسجيله على أنه 6.
      ملاحظة: لا يتطلب اختبار توازن الحزمة تجربة مسبقة.

6. إجراء التحقق من الصحة: تقييم السلوك العصبي

ملاحظة: قبل التجارب السلوكية ، تم التعامل مع الفئران لمدة 2 دقيقة يوميا لمدة 3 أيام متتالية لتقليل التوتر واضطراب الجدة. تم إجراء جميع التجارب السلوكية عن طريق وضع في بيئة الاختبار لمدة 60 دقيقة قبل بدء التجربة.

1. قدرة التنسيق الحركي (مهمة الشعاع)
   1. الإعداد التجريبي
      1. ضع الفئران على أحد طرفي عارضة التوازن (طولها 1.5 متر و 75 سم فوق الأرض). ضع صندوق هروب (قفص منزلي مائل للفراش) على الطرف الآخر.
      2. ضع حشوة رغوية أسفل العارضة للتخفيف من المخاطر المحتملة لإصابة الفئران في حالة السقوط أثناء الاختبار.
      3. قم بتشغيل كاميرا الفيديو.
      4. حدد أيام الاختبار في نقاط زمنية محددة بعد الإصابة أو بعد العلاج الوهمي (على سبيل المثال ، اليوم 1 واليوم 3 واليوم 7).
   2. مرحلة التدريب (2 أيام)
      1. تدريب الفئران على عبور شعاع 4 سم واسعة 3 مرات متتالية ، تليها تجربتان على شعاع 2 سم.
      2. أثناء التدريب ، قم بتوجيه الفئران برفق عبر الحزمة حتى يتمكنوا من عبورها بسهولة دون تدخل.
   3. تجربة عارضة التوازن
      1. ضع الفئران على شعاع بعرض 2 سم لمدة 5 تجارب متتالية.
      2. سجل بداية ونهاية كل تجربة عندما يعبر أنف الجرذ خطي البداية والنهاية ، على التوالي.
      3. أعد الفئران إلى أقفاصها في نهاية التجربة.
   4. اختبار خط الأساس
      1. قم بإجراء تجربة عارضة التوازن قبل الإصابة أو العلاج.
      2. احسب متوسط القيم من هذه التجارب المتتالية ال 5 لتحديد خط الأساس لكل فأر.
   5. تحليل البيانات
      1. تحليل الوقت اللازم لعبور العارضة والعدد الإجمالي للانزلاقات الخلفية باستخدام تحليل الفيديو من قبل الباحثين الذين أعموا الظروف التجريبية.
2. القلق (اختبار المجال المفتوح)
   1. الإعداد التجريبي
      1. جهز ساحة الحقل المفتوح ، وتأكد من نظافتها وخلوها من أي إشارات رائحة سابقة. قسم الساحة إلى ثلاث مناطق: منطقة داخلية مركزية (33 سم × 33 سم) ، ومنطقة متوسطة (66 سم × 66 سم) ، ومنطقة خارجية.
   2. مرحلة الاختبار
      1. ضع فأرا في وسط ساحة الحقل المفتوح وابدأ المؤقت. اسمح للفأر باستكشاف الساحة لمدة 5 دقائق بحرية. بعد 5 دقائق ، أعد الفئران بعناية ورفق إلى قفص المنزل.
   3. جمع البيانات
      1. قم بقياس المسافة الإجمالية التي قطعها الجرذ خلال فترة الاستكشاف التي تبلغ 5 دقائق. حدد الوقت الذي يقضيه الجرذ في المناطق الداخلية والمتوسطة والخارجية المركزية.
   4. تحليل البيانات
      1. استخدم المسافة الإجمالية المقطوعة كمقياس للسلوك الاستكشافي العام والقدرة الحركية. احسب الوقت الذي يقضيه في المنطقة الداخلية المركزية كمؤشر على الاستجابات الشبيهة بالقلق.
3. قدرات التعلم والذاكرة (اختبار متاهة موريس المائية)
   1. تأكد من أن جهاز متاهة المياه في حالة جيدة. صبغ الماء باللون الأسود وضع الإشارات في الاتجاهات الأساسية الأربعة. ضع المنصة 2.5 سم تحت سطح الماء.
   2. قم بإعداد نظام مراقبة لتسجيل ومراقبة سلوك الفئران.
   3. يوم درب
      1. ضع الفئران بسرعة في متاهة الماء. إذا فشل الجرذ في الوصول إلى المنصة في غضون 2 دقيقة ، قم بتوجيهه برفق باستخدام العصا الخشبية.
      2. اسمح للفأر بالتعرف على بيئة المتاهة أثناء الوقوف على المنصة لمدة 20 ثانية ، ثم قم بإزالتها. بمجرد أن يكون الجرذ على المنصة ، اتركه يبقى لمدة 20 ثانية ، ثم قم بإزالته.
   4. التكرار اليومي
      1. كرر إجراء يوم التدريب ، ووضع الفئران في الماء من أرباع مختلفة. كرر الخطوة 6.3.3. استمر في التدريب لمدة 5 أيام متتالية.
   5. يوم اختبار التحقيق:^{في اليوم 6} ، قم بإزالة المنصة ووضع الجرذ في نفس الربع لمدة 2 دقيقة.
   6. المراقبة والتسجيل: استخدم نظام المراقبة لمراقبة سلوك الفئران في أيام اختبار التجربة والتحقيق.
   7. التنظيف: بعد إزالة الجرذ من متاهة الماء ، استخدم منشفة لتجفيفه جيدا.

النتائج

كان الجهاز المستخدم في هذا العمل نسخة معدلة من نموذج كين ونموذج الأطفال لريشيل ميشاسيوك^11,12. في هذه الدراسة ، تم تعيين الفئران SD لمجموعات وهمية و mTBI. لإثبات قابلية استنساخ هذا النموذج ، أجرينا ثلاث نسخ مكررة مستقلة لهذا النموذج جنبا إلى جنب ...

Discussion

يحاكي هذا النموذج بنجاح mTBI مغلق الرأس دون الحاجة إلى شق فروة الرأس أو فتح الجمجمة ، مما يوفر تمثيلا أكثر دقة لسيناريو التأثير الذي لوحظ في الحالات البشرية. يساعد تجنب شق فروة الرأس على منع الاستجابات الالتهابية التي قد لا تتوافق مع الوضع الفعلي. بالمقارنة مع نموذج Richelle Mychasiuk للأطفال

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic box	In-house	N/A	15 cm x 22 cm x 43 cm
Anesthesia Machine	RWD Life Science Co.	R540 Mice & Rat Animal Anesthesia Machine
Helmet	In-house	N/A	Stainless-steel disk measuring 10 mm in diameter and 3 mm in thickness
Morris water maze	RWD Life Science Co.		Diameter 150 cm, height 50 cm,platform diameter 35 cm
Open field	RWD Life Science Co.	63007	Width100 cm, height 40 cm
Panlab SMART V3.0	RWD Life Science Co.	SMART v3.0
Perforated weight	In-house	N/A	Weight of 550 g and diameter of 18 mm
Pillow	In-house	N/A	Wedge-shaped sponge to place beneath the rat's head