Modèle de rat de blessure traumatique légère à tête fermée et sa validation

Résumé

Ici, nous présentons un modèle de traumatisme crânien léger (TCC) à tête fermée et sa validation présentant une similitude remarquable avec le TCL humain en ce qui concerne les manifestations comportementales au cours des stades aigus et subaigus.

Résumé

Les modèles animaux sont essentiels pour faire progresser notre compréhension des traumatismes crâniens légers (TCC) et guider la recherche clinique. Pour obtenir des informations significatives, il est essentiel de développer un modèle animal stable et reproductible. Dans cette étude, nous rapportons une description détaillée d’un modèle de TCC à tête fermée et d’une méthode de validation représentative utilisant des rats Sprague-Dawley pour vérifier l’effet de la modélisation. Le modèle consiste à laisser tomber un poids de 550 g d’une hauteur de 100 cm directement sur la tête d’un rat sur une surface destructible, suivi d’un virage à 180 degrés. Pour évaluer la blessure, les rats ont subi une série d’évaluations neurocomportementales 10 minutes après la blessure, y compris le temps de perte de conscience, le temps du premier comportement de recherche, la capacité d’évasion et le test de capacité d’équilibre du faisceau. Au cours des phases aiguës et subaiguës suivant la blessure, des tests comportementaux ont été effectués pour évaluer la capacité de coordination motrice (tâche Beam), l’anxiété (test en champ ouvert) et les capacités d’apprentissage et de mémoire (test Morris Water Maze). Le modèle de TCL à tête fermée a produit une réponse cohérente aux blessures avec une mortalité minimale et a reproduit des situations réelles. La méthode de validation a permis de vérifier efficacement le développement du modèle et d’assurer la stabilité et la cohérence du modèle.

Introduction

Le traumatisme crânien léger (TCC), ou commotion cérébrale, est le type de blessure le plus répandu et peut entraîner divers symptômes chroniques et à court terme¹. Ces symptômes peuvent inclure des étourdissements, des maux de tête, une dépression et une anhédonie, entre autres, entraînant des souffrances importantes pour les personnes touchées par un TCC². Étant donné que la plupart des traumatismes crâniens sont causés par un traumatisme contondant³, il devient impératif de développer des modèles animaux qui imitent avec précision de telles blessures. Ces modèles sont essentiels pour mieux comprendre la blessure et ses mécanismes sous-jacents, offrant un environnement contrôlé avec une variabilité et une hétérogénéité réduites par rapport aux études humaines.

De nombreux modèles de rongeurs bien établis ont été développés pour les traumatismes crâniens (TCC), y compris les lésions par percussion liquide (FPI)⁴, les chocs corticaux contrôlés (CCI)⁵, les blessures par perte de poids⁶, les lésions cérébrales traumatiques par explosion⁷ et autres. Cependant, ces modèles se concentrent principalement sur la reproduction de scénarios de traumatismes crâniens modérés à graves. En revanche, les modèles expérimentaux spécifiquement conçus pour simuler les traumatismes crâniens ont reçu relativement moins d’attention et restent peu explorés⁸. Par conséquent, il est essentiel d’établir un modèle animal stable et reproductible qui représente avec précision les traumatismes crâniens. Un tel modèle améliorerait considérablement notre compréhension des conséquences neurobiologiques et comportementales associées aux TCL.

On ne peut pas distinguer les déficits fonctionnels chez les rats ayant subi un traumatisme crânien par rapport aux rats normaux par observation occasionnelle une fois que les effets de l’anesthésie se sont dissipés. Par conséquent, il est nécessaire d’administrer des tests spécifiques. Chez l’homme, un large éventail d’évaluations cliniques est utilisé pour évaluer les patients ^9,10,11. De même, l’établissement d’un modèle réussi dans le modèle du rat nécessite également l’utilisation d’outils d’évaluation rapide pour déterminer sa validité.

Dans cette étude, nous présentons un modèle de rat TCC à tête fermée, permettant d’étudier le TCC d’une manière qui ressemble beaucoup à la condition humaine. La description détaillée du modèle et de sa procédure de validation permet de mieux comprendre l’approche expérimentale utilisée dans l’étude des TCL.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

L’expérimentation animale a été approuvée par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Université du Centre-Sud. Toutes les études ont été menées dans le respect des principes de bien-être et d’éthique des animaux de laboratoire.

1. Procédure d’alimentation et d’anesthésie des animaux

1. Regroupez des rats mâles Sprague-Dawley de 280 à 320 g et maintenez-les sur un cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h avec accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Effectuez l’étude après que les rats se soient acclimatés pendant 6 jours.
2. Anesthésier le rat avec de l’isoflurane à 3 % à raison d’un débit d’air de 0,6 L/min dans une boîte à induction jusqu’à ce qu’il ne réponde plus au pincement de la patte ou de la queue. Maintenir le débit pendant 30 s.
   REMARQUE : Les analgésiques n’ont pas été utilisés car ils interféreraient avec la réponse du rat dans les évaluations neurocomportementales.

2. Configuration préopératoire

1. Placer une éponge d’une dureté de 35D (poids de 35 kg/m3 d’éponge), de longueur et de largeur identiques mais d’une épaisseur de 12 cm, à l’intérieur d’une boîte en acrylique (15 cm x 22 cm x 43 cm) dépourvue d’un couvercle supérieur.
2. Découpez une feuille d’étain (d’une épaisseur de 20 μm) et fixez-la sur la boîte en acrylique à l’aide de ruban adhésif pour former une surface destructible capable de supporter le poids d’un rat. De plus, marquez une ligne de coupe d’environ 10 cm pour être l’emplacement désigné pour positionner la tête du rat.
3. À l’aide d’un support en fer, fixez fermement le tube en PVC en place. Préparez un poids perforé, pesant 550 grammes avec un diamètre de 18 millimètres. Attachez le poids à une ligne de pêche à une hauteur de 1 mètre à l’intérieur d’un tube en polychlorure de vinyle ou en PVC. et ajustez la position du tube de guidage à 3 centimètres au-dessus du papier d’aluminium.
4. Préparez un casque et un oreiller. Fabriquez un casque à l’aide d’un disque en acier inoxydable de 10 mm de diamètre et 3 mm d’épaisseur. Préparez un oreiller en éponge cunéiforme à placer sous la tête du rat, en vous assurant qu’il est perpendiculaire à la direction de la gravité.
   NOTA : Un schéma de principe de l’appareil d’impact est présenté à la figure 1. Le casque sert à identifier l’emplacement de l’impact et à améliorer la répartition de la force externe. L’oreiller est utilisé pour garantir des dommages uniformes et stables.

3. Induction d’un traumatisme crânien cérébral

1. Placez rapidement le rat anesthésié sur sa poitrine sur le papier d’aluminium.
   REMARQUE : Deux opérateurs sont nécessaires pour l’induction du TCL : l’un pour la préparation et l’autre pour la vérification.
2. Préparation : Placez l’oreiller sous le rat, en vous assurant que sa tête est parallèle au papier d’aluminium. Alignez le casque avec les oreilles du rat et fixez-le en place.
3. Vérification : Vérifiez que le tuyau en PVC est positionné directement au-dessus du casque. Une fois que les deux opérateurs ont confirmé la configuration correcte, passez à l’étape suivante.
4. Induction de la rotation de la tête : Relâchez le poids, ce qui lui permet de tomber et de frapper la tête du rat, induisant une chute sur l’éponge et une rotation de 180°.
5. Placez le rat sur le dos dans une cage propre.

4. Induction de simulacre

1. Traitez le rat de la même manière que la description précédente de l’induction du TCL, mais ne le soumettez pas à l’impact à la tête.

5. Procédure de validation : Évaluations neurocomportementales aiguës

NOTE : Les évaluations suivantes ont été modifiées en fonction des scores de gravité neurologique⁹ et du protocole de Flierl et ^coll.10. Toutes ces évaluations ont été effectuées 10 min après que le rat ait récupéré le réflexe de redressement.

1. Moment de la perte de conscience : Notez la durée entre le moment où le rat est anesthésié et le moment où il récupère le réflexe de redressement.
   REMARQUE : Le réflexe de redressement est le processus dans lequel le rat se retourne lorsqu’il est placé sur le dos. La perte du réflexe de redressement doit être considérée comme un critère d’évaluation sans cruauté, et l’animal doit être euthanasié conformément aux directives de l’établissement.
2. Heure du premier comportement de recherche : Enregistrez la durée entre le moment où le rat est anesthésié et le moment où il montre le comportement de recherche pour la première fois.
   REMARQUE : Le comportement de recherche est un signe d’intérêt pour l’environnement, une réponse physiologique.
3. Capacité à s’échapper
   1. Placez le rat au milieu d’un appareil circulaire (0,5 m de diamètre et 0,3 m de hauteur) avec une sortie (12,5 cm de long et 9 cm de large).
   2. Notez le temps qu’il faut au rat pour sortir du cercle.
      REMARQUE : Si le rat ne sort pas du cercle dans les 180 s, notez le temps de 180 s.
4. Test d’aptitude à l’équilibre de la poutre
   1. Placez le rat sur une poutre de 3 cm, 2 cm et 1,5 cm de large pendant 1 min en conséquence.
   2. Si le rat maintient un équilibre avec une posture stable sur la poutre, notez-le à 0.
   3. Si le rat saisit le côté de la poutre, donnez un score de 1. Si le rat étreint la poutre et qu’une branche en tombe, notez-lui 2.
   4. Si le rat s’agrippe à la poutre et que les deux membres tombent ou tournent dessus (>60 s), notez-lui 3.
   5. Si le rat tente de se tenir en équilibre sur la poutre mais tombe (> 40 s), notez-lui 4.
   6. Si le rat tente de se tenir en équilibre sur la poutre mais tombe (>20 s), notez-lui 5.
   7. Si le rat n’essaie pas de se tenir en équilibre ou de s’accrocher à la poutre et tombe dans les 20 s, notez-lui 6.
      REMARQUE : L’essai d’équilibre de la poutre ne nécessite pas de préparation à l’essai.

6. Procédure de validation : Évaluation neurocomportementale

REMARQUE : Avant les expériences comportementales, les rats ont été manipulés pendant 2 minutes par jour pendant 3 jours consécutifs pour minimiser le stress et la perturbation de la nouveauté. Toutes les expériences comportementales ont été réalisées en plaçant les animaux dans l’environnement de test pendant 60 minutes avant le début de l’expérience.

1. Capacité de coordination motrice (tâche de faisceau)
   1. Dispositif expérimental
      1. Placez les rats à une extrémité de la poutre d’équilibre (1,5 m de long et 75 cm au-dessus du sol). Placez une boîte d’évacuation (une cage de litière inclinée) à l’autre extrémité.
      2. Placez un rembourrage en mousse sous la poutre pour atténuer le risque potentiel de blessure des rats en cas de chute pendant l’essai.
      3. Allumez la caméra vidéo.
      4. Planifiez les jours de dépistage à des moments précis après la blessure ou après le traitement simulé (p. ex., jour 1, jour 3 et jour 7).
   2. Phase de formation (2 jours)
      1. Entraînez les rats à traverser la poutre de 4 cm de large 3 fois consécutives, suivis de deux essais sur la poutre de 2 cm de large.
      2. Pendant l’entraînement, guidez doucement les rats à travers le faisceau jusqu’à ce qu’ils puissent les traverser facilement sans interférence.
   3. Expérience de la poutre d’équilibre
      1. Placez les rats sur la poutre de 2 cm de large pendant 5 essais consécutifs.
      2. Enregistrez le début et la fin de chaque épreuve lorsque le nez du rat franchit les lignes de départ et d’arrivée, respectivement.
      3. Remettez les rats dans leurs cages à la fin de l’expérience.
   4. Tests de référence
      1. Effectuez l’expérience de la poutre d’équilibre avant la blessure ou le traitement.
      2. Calculez les valeurs moyennes de ces 5 essais consécutifs afin d’établir la base de référence pour chaque rat.
   5. Analyse des données
      1. Analysez le temps nécessaire pour traverser le faisceau et le nombre total de glissements de l’arrière-pied à l’aide d’une analyse vidéo réalisée par des chercheurs aveugles aux conditions expérimentales.
2. Anxiété (test en champ ouvert)
   1. Dispositif expérimental
      1. Préparez l’arène en plein champ, en vous assurant qu’elle est propre et exempte de tout signal olfactif antérieur. Divisez l’arène en trois zones : une zone intérieure centrale (33 cm x 33 cm), une zone centrale (66 cm x 66 cm) et une zone extérieure.
   2. Phase de test
      1. Placez un rat au centre de l’arène en plein champ et lancez le chronomètre. Laissez le rat explorer l’arène pendant 5 minutes librement. Après 5 minutes, remettez délicatement et doucement le rat dans sa cage d’origine.
   3. Collecte de données
      1. Mesurez la distance totale parcourue par le rat pendant la période d’exploration de 5 minutes. Déterminez le temps que le rat passe dans les zones centrales, intérieures, moyennes et extérieures.
   4. Analyse des données
      1. Utilisez la distance totale parcourue comme mesure du comportement exploratoire global et de la capacité locomotrice. Calculez le temps passé dans la zone intérieure centrale comme indicateur de réactions anxieuses.
3. Capacités d’apprentissage et de mémoire (test du labyrinthe aquatique de Morris)
   1. Assurez-vous que l’appareil du labyrinthe aquatique est en bon état. Teignez l’eau en noir et placez les queues dans les quatre points cardinaux. Positionnez la plate-forme à 2,5 cm sous la surface de l’eau.
   2. Mettre en place un système de surveillance pour enregistrer et observer le comportement des rats.
   3. Journée de trail
      1. Placez rapidement le rat dans le labyrinthe d’eau. Si le rat ne parvient pas à atteindre la plate-forme dans les 2 minutes, guidez-le doucement à l’aide du bâton en bois.
      2. Laissez le rat se familiariser avec l’environnement du labyrinthe en se tenant debout sur la plate-forme pendant 20 s, puis retirez-le. Une fois que le rat est sur la plate-forme, laissez-le rester pendant 20 s, puis retirez-le.
   4. Répétition quotidienne
      1. Répétez la procédure du jour de formation, en plaçant le rat dans l’eau à partir de différents quadrants. Répétez l’étape 6.3.3. Continuez l’entraînement pendant 5 jours consécutifs.
   5. Le jour du test de la sonde : Le 6e^jour, retirez la plate-forme et placez le rat dans le même quadrant pendant 2 min.
   6. Observation et enregistrement : Utilisez le système de surveillance pour surveiller le comportement du rat les jours d’essai et de test de sonde.
   7. Nettoyage : Après avoir retiré le rat du labyrinthe d’eau, utilisez une serviette pour le sécher soigneusement.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

L’appareil utilisé dans ce travail était une version modifiée du modèle de Kane et du modèle pédiatrique de Richelle Mychasiuk^11,12. Dans cette étude, les rats SD ont été assignés à des groupes fictifs et mTCC. Pour démontrer la reproductibilité de ce modèle, nous avons effectué trois répétitions indépendantes de ce modèle ainsi que l’évaluation neurocomportementale aiguë, chaque expérience impliquant 8 ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Ce modèle simule avec succès un traumatisme crânien crânien à tête fermée sans qu’il soit nécessaire d’inciper le cuir chevelu ou d’ouvrir le crâne, ce qui permet d’obtenir une représentation plus précise du scénario d’impact observé dans les cas humains. L’évitement de l’incision du cuir chevelu aide à prévenir les réponses inflammatoires qui peuvent ne pas correspondre à la situation réelle. Comparé au modèle pédiatrique¹² de Richelle Mychasiuk, le modèle uti...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic box	In-house	N/A	15 cm x 22 cm x 43 cm
Anesthesia Machine	RWD Life Science Co.	R540 Mice & Rat Animal Anesthesia Machine
Helmet	In-house	N/A	Stainless-steel disk measuring 10 mm in diameter and 3 mm in thickness
Morris water maze	RWD Life Science Co.		Diameter 150 cm, height 50 cm,platform diameter 35 cm
Open field	RWD Life Science Co.	63007	Width100 cm, height 40 cm
Panlab SMART V3.0	RWD Life Science Co.	SMART v3.0
Perforated weight	In-house	N/A	Weight of 550 g and diameter of 18 mm
Pillow	In-house	N/A	Wedge-shaped sponge to place beneath the rat's head