Rattenmodell für leichte traumatische Verletzungen mit geschlossenem Kopf und seine Validierung

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein Rattenmodell mit geschlossenem Schädel-Hirn-Trauma (mTBI) und dessen Validierung vor, das eine bemerkenswerte Ähnlichkeit mit dem menschlichen mSHT in Bezug auf Verhaltensmanifestationen während der akuten und subakuten Stadien aufweist.

Zusammenfassung

Tiermodelle sind von entscheidender Bedeutung, um unser Verständnis von leichten Schädel-Hirn-Traumata (mSHT) zu verbessern und die klinische Forschung zu leiten. Um aussagekräftige Erkenntnisse zu gewinnen, ist die Entwicklung eines stabilen und reproduzierbaren Tiermodells unerlässlich. In dieser Studie berichten wir über eine detaillierte Beschreibung eines Closed-Head-mTBI-Modells und eine repräsentative Validierungsmethode mit Sprague-Dawley-Ratten, um den Modellierungseffekt zu verifizieren. Bei dem Modell wird ein 550 g schweres Massengewicht aus einer Höhe von 100 cm direkt auf den Kopf einer Ratte auf einer zerstörbaren Oberfläche fallen gelassen und anschließend um 180 Grad gedreht. Um die Verletzung zu beurteilen, unterzogen sich die Ratten 10 Minuten nach der Verletzung einer Reihe von neurologischen Verhaltensuntersuchungen, einschließlich des Zeitpunkts des Bewusstseinsverlusts, der Zeit für das erste Suchverhalten, der Fluchtfähigkeit und des Tests der Balkenbalancefähigkeit. Während der akuten und subakuten Phasen nach der Verletzung wurden Verhaltenstests durchgeführt, um die motorische Koordinationsfähigkeit (Beam-Aufgabe), die Angst (Open-Field-Test) sowie die Lern- und Gedächtnisfähigkeiten (Morris-Water-Maze-Test) zu bewerten. Das Closed-Head-mTBI-Modell erzeugte eine konsistente Verletzungsreaktion mit minimaler Mortalität und replizierte reale Situationen. Die Validierungsmethode verifizierte effektiv die Modellentwicklung und stellte die Stabilität und Konsistenz des Modells sicher.

Einleitung

Ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma (mTBI) oder eine Gehirnerschütterung ist die häufigste Art von Verletzung und kann zu verschiedenen kurzzeitigen und chronischen Symptomen führen¹. Zu diesen Symptomen können unter anderem Schwindel, Kopfschmerzen, Depressionen und Anhedonie gehören, die bei Personen, die von mSHT betroffen sind, zu erheblichem Leiden führen². Da die meisten mSHTs durch stumpfe Gewalteinwirkung verursacht werden³, ist es unerlässlich, Tiermodelle zu entwickeln, die solche Verletzungen genau nachahmen. Diese Modelle sind unerlässlich, um ein besseres Verständnis der Verletzung und der zugrunde liegenden Mechanismen zu erlangen, und bieten eine kontrollierte Umgebung mit reduzierter Variabilität und Heterogenität im Vergleich zu Studien am Menschen.

Für Schädel-Hirn-Traumata (SHT) wurden zahlreiche etablierte Nagetiermodelle entwickelt, darunter Fluid Percussion Injury (FPI)⁴, Controlled Cortical Impact (CCI)⁵, Weight Drop^{Injury 6}, Blast-Traumatic Brain Injury⁷ und andere. Diese Modelle konzentrieren sich jedoch in erster Linie auf die Replikation von mittelschweren bis schweren SHT-Szenarien. Im Gegensatz dazu haben die experimentellen Modelle, die speziell für die Simulation von mTBI entwickelt wurden, relativ wenig Aufmerksamkeit erhalten und sind noch wenig erforscht⁸. Daher ist es dringend erforderlich, ein stabiles und reproduzierbares Tiermodell zu etablieren, das das mSHT genau abbildet. Ein solches Modell würde unser Verständnis der neurobiologischen und verhaltensbezogenen Folgen von mSHT erheblich verbessern.

Man kann die funktionellen Defizite bei mTBI-Ratten im Vergleich zu normalen Ratten nicht durch zufällige Beobachtung unterscheiden, nachdem die Wirkung der Anästhesie abgeklungen ist. Daher ist es notwendig, spezifische Tests durchzuführen. Beim Menschen wird ein breites Spektrum klinischer Beurteilungen verwendet, um Patienten zu beurteilen ^9,10,11. In ähnlicher Weise erfordert die Etablierung eines erfolgreichen Modells im Rattenmodell auch den Einsatz von Schnellbewertungsinstrumenten, um seine Gültigkeit zu bestimmen.

In dieser Studie stellen wir ein geschlossenes mTBI-Rattenmodell vor, das die Untersuchung von mTBI in einer Weise ermöglicht, die dem menschlichen Zustand sehr ähnlich ist. Die detaillierte Beschreibung des Modells und seines Validierungsverfahrens vermittelt ein umfassendes Verständnis des experimentellen Ansatzes, der bei der Untersuchung von mTBI verwendet wird.

Protokoll

Die Tierversuche wurden vom Central South University Animal Care and Use Committee genehmigt. Alle Studien wurden im Einklang mit dem Wohlergehen und den ethischen Grundsätzen von Versuchstieren durchgeführt.

1. Fütterung und Betäubung der Tiere

1. Halten Sie 280-320 g männliche Sprague-Dawley-Ratten in einer Gruppe und halten Sie sie in einem 12 h/12 h Hell/Dunkel-Zyklus mit Zugang zu Futter und Wasser ad libitum. Führen Sie die Studie durch, nachdem sich die Ratten 6 Tage lang akklimatisiert haben.
2. Betäuben Sie die Ratte mit 3% Isofluran bei 0,6 l/min Luftstrom in einer Induktionsbox, bis sie nicht mehr auf Pfoten- oder Schwanzkneifen reagiert. Halten Sie die Durchflussrate für 30 Sekunden.
   ANMERKUNG: Schmerzmittel wurden nicht verwendet, da sie die Reaktion der Ratte bei den neurologischen Verhaltensbeurteilungen beeinträchtigen würden.

2. Präoperativer Aufbau

1. Positionieren Sie einen Schwamm mit einem Härtewert von 35D (Gewicht von 35 kg/m3 Schwamm) mit identischer Länge und Breite, aber einer Dicke von 12 cm, in einer Acrylbox (15 cm x 22 cm x 43 cm) ohne obere Abdeckung.
2. Schneiden Sie eine Zinnfolie (20 μm dick) zu und befestigen Sie sie mit Klebeband auf der Acrylbox, um eine zerstörbare Oberfläche zu bilden, die das Gewicht einer Ratte tragen kann. Markieren Sie zusätzlich eine ca. 10 cm lange Schnittlinie, die als Position für die Positionierung des Rattenkopfes vorgesehen ist.
3. Mit Hilfe eines Bügeleisenständers fixieren Sie das PVC-Rohr fest. Bereiten Sie ein perforiertes Gewicht von 550 Gramm mit einem Durchmesser von 18 Millimetern vor. Befestigen Sie das Gewicht an einer Angelschnur in einer Höhe von 1 Meter in einem Polyvinylchlorid- oder PVC-Schlauch. und stellen Sie die Position des Führungsrohrs 3 Zentimeter über der Zinnfolie ein.
4. Bereiten Sie einen Helm und ein Kissen vor. Fertigen Sie einen Helm aus einer Edelstahlscheibe mit einem Durchmesser von 10 mm und einer Dicke von 3 mm. Bereite ein keilförmiges Schwammkissen vor, das du unter den Kopf der Ratte legst, und achte darauf, dass es senkrecht zur Schwerkraft steht.
   ANMERKUNG: Ein schematisches Diagramm des Schlaggeräts ist in Abbildung 1 dargestellt. Der Helm dient dazu, den Aufprallort zu identifizieren und die Verteilung der äußeren Kräfte zu verbessern. Das Kissen wird verwendet, um eine gleichmäßige und stabile Beschädigung zu gewährleisten.

3. mTBI-Induktion

1. Legen Sie die betäubte Ratte schnell auf die Brust auf die Alufolie.
   HINWEIS: Für die mTBI-Induktion sind zwei Bediener erforderlich: einer für die Vorbereitung und der andere für die Überprüfung.
2. Vorbereitung: Legen Sie das Kissen unter die Ratte und achten Sie darauf, dass der Kopf parallel zum Folienpapier ist. Richten Sie den Helm an den Ohren der Ratte aus und befestigen Sie ihn.
3. Überprüfung: Vergewissern Sie sich, dass das PVC-Rohr direkt über dem Helm positioniert ist. Sobald beide Bediener die korrekte Einrichtung bestätigt haben, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
4. Induktion der Kopfdrehung: Lassen Sie das Gewicht los, so dass es fallen und auf den Kopf der Ratte treffen kann, was einen Sturz auf den Schwamm und eine 180°-Drehung auslöst.
5. Setze die Ratte auf den Rücken in einen sauberen Käfig.

4. Schein-Induktion

1. Behandeln Sie die Ratte auf die gleiche Weise wie in der vorherigen Beschreibung der mTBI-Induktion, aber setzen Sie sie nicht dem Kopfaufprall aus.

5. Validierungsverfahren: Akute neurobehaviorale Beurteilungen

HINWEIS: Die folgenden Bewertungen wurden auf der Grundlage des Neurological Severity Scores⁹ und des Protokolls von Flierl et ^al.10 modifiziert. Alle diese Untersuchungen wurden 10 Minuten nach der Wiedererlangung des Aufrichtungsreflexes durchgeführt.

1. Zeitpunkt des Bewusstseinsverlusts: Notieren Sie die Dauer von der Betäubung der Ratte bis zur Wiedererlangung des Aufrichtungsreflexes.
   HINWEIS: Der Aufrichtungsreflex ist der Vorgang, bei dem sich die Ratte umdreht, wenn sie auf den Rücken gelegt wird. Der Verlust des Aufrichtungsreflexes ist als humaner Endpunkt zu betrachten, und das Tier muss gemäß den institutionellen Richtlinien eingeschläfert werden.
2. Zeit des ersten Suchverhaltens: Notieren Sie die Dauer von der Betäubung der Ratte bis zu dem Zeitpunkt, an dem sie das Suchverhalten zum ersten Mal zeigt.
   ANMERKUNG: Das Suchen nach Verhalten ist ein Zeichen des Interesses an der Umwelt, eine physiologische Reaktion.
3. Fähigkeit zur Flucht
   1. Platzieren Sie die Ratte in der Mitte eines kreisförmigen Apparates (0,5 m Durchmesser und 0,3 m Höhe) mit einem Ausgang (12,5 cm lang und 9 cm breit).
   2. Notieren Sie die Zeit, die die Ratte braucht, um den Kreis zu verlassen.
      HINWEIS: Wenn die Ratte den Kreis nicht innerhalb von 180 s verlässt, notieren Sie die Zeit mit 180 s.
4. Balken-Gleichgewichts-Fähigkeitstest
   1. Legen Sie die Ratte entsprechend für 1 Minute auf einen 3 cm, 2 cm und 1,5 cm breiten Strahl.
   2. Wenn die Ratte das Gleichgewicht mit einer gleichmäßigen Haltung auf dem Balken beibehält, bewerten Sie sie mit 0.
   3. Wenn die Ratte die Seite des Balkens greift, geben Sie eine Punktzahl von 1. Wenn die Ratte den Balken umarmt und ein Glied von ihm abfällt, wird es mit 2 bewertet.
   4. Wenn die Ratte den Balken umarmt und die beiden Gliedmaßen von ihm herunterfallen oder sich auf ihm drehen (>60 s), wird sie mit 3 bewertet.
   5. Wenn die Ratte versucht, auf dem Balken zu balancieren, aber herunterfällt (> 40 s), wird sie mit 4 bewertet.
   6. Wenn die Ratte versucht, auf dem Balken zu balancieren, aber herunterfällt (>20 s), wird sie mit 5 bewertet.
   7. Wenn die Ratte nicht versucht, auf dem Balken zu balancieren oder zu hängen und innerhalb von 20 Sekunden herunterfällt, wird sie mit 6 bewertet.
      HINWEIS: Für den Balkenauswuchttest ist kein Vorversuch erforderlich.

6. Validierungsverfahren: Bewertung des Neuroverhaltens

HINWEIS: Vor den Verhaltensexperimenten wurden die Ratten an 3 aufeinanderfolgenden Tagen täglich 2 Minuten lang behandelt, um Stress und Störungen der Neuheit zu minimieren. Alle Verhaltensexperimente wurden durchgeführt, indem die Tiere vor Beginn des Experiments für 60 Minuten in die Testumgebung gebracht wurden.

1. Motorische Koordinationsfähigkeit (Beam-Aufgabe)
   1. Versuchsaufbau
      1. Setzen Sie die Ratten auf ein Ende des Schwebebalkens (1,5 m lang und 75 cm über dem Boden). Platzieren Sie eine Rettungsbox (einen schrägen Einstreukäfig) am anderen Ende.
      2. Positionieren Sie eine Schaumstoffpolsterung unter dem Balken, um das potenzielle Verletzungsrisiko für Ratten im Falle von Stürzen während des Tests zu verringern.
      3. Schalten Sie die Videokamera ein.
      4. Planen Sie Testtage zu bestimmten Zeitpunkten nach der Verletzung oder nach der Scheinbehandlung (z. B. Tag 1, Tag 3 und Tag 7).
   2. Einarbeitungsphase (2 Tage)
      1. Trainieren Sie die Ratten, den 4 cm breiten Balken 3 Mal hintereinander zu überqueren, gefolgt von zwei Versuchen auf dem 2 cm breiten Strahl.
      2. Führen Sie die Ratten während des Trainings vorsichtig über den Balken, bis sie ihn leicht und ohne Störung überqueren können.
   3. Schwebebalken-Experiment
      1. Setzen Sie die Ratten für 5 aufeinanderfolgende Versuche auf den 2 cm breiten Strahl.
      2. Notieren Sie den Beginn und das Ende jedes Versuchs, wenn die Nase der Ratte die Start- bzw. Ziellinie kreuzt.
      3. Bringen Sie die Ratten am Ende des Experiments in ihre Käfige zurück.
   4. Baseline-Tests
      1. Führen Sie das Schwebebalken-Experiment vor der Verletzung oder Behandlung durch.
      2. Berechnen Sie die Durchschnittswerte aus diesen 5 aufeinanderfolgenden Versuchen, um den Ausgangswert für jede Ratte festzulegen.
   5. Datenanalyse
      1. Analysieren Sie die Zeit, um den Strahl zu überqueren, und die Gesamtzahl der Ausrutscher des Rückfußes mithilfe von Videoanalysen von Forschern, die für die Versuchsbedingungen blind sind.
2. Angst (Offener Feldtest)
   1. Versuchsaufbau
      1. Bereiten Sie die Freifeldarena vor und stellen Sie sicher, dass sie sauber und frei von früheren Geruchsreizen ist. Unterteilen Sie die Arena in drei Zonen: eine mittlere Innenzone (33 cm x 33 cm), eine mittlere Zone (66 cm x 66 cm) und eine äußere Zone.
   2. Testphase
      1. Platziere eine Ratte in der Mitte der offenen Feldarena und starte den Timer. Erlaube der Ratte, die Arena 5 Minuten lang frei zu erkunden. Nach 5 Minuten bringen Sie die Ratte vorsichtig und vorsichtig in ihren Heimatkäfig zurück.
   3. Datensammlung
      1. Messen Sie die Gesamtstrecke, die die Ratte während der 5-minütigen Erkundungsphase zurückgelegt hat. Bestimme die Zeit, die die Ratte in der zentralen, inneren, mittleren und äußeren Zone verbringt.
   4. Datenanalyse
      1. Verwenden Sie die zurückgelegte Gesamtstrecke als Maß für das allgemeine Erkundungsverhalten und die Bewegungsfähigkeit. Berechnen Sie die Zeit, die Sie in der zentralen inneren Zone verbringen, als Indikator für angstähnliche Reaktionen.
3. Lern- und Gedächtnisfähigkeiten (Morris-Wasserlabyrinth-Test)
   1. Stellen Sie sicher, dass sich das Wasserlabyrinth-Gerät in einem ordnungsgemäßen Zustand befindet. Färben Sie das Wasser schwarz und platzieren Sie die Queues in den vier Himmelsrichtungen. Positionieren Sie die Plattform 2,5 cm unter der Wasseroberfläche.
   2. Richten Sie ein Überwachungssystem ein, um das Verhalten der Ratten aufzuzeichnen und zu beobachten.
   3. Trail-Tag
      1. Setze die Ratte schnell in das Wasserlabyrinth. Wenn die Ratte die Plattform nicht innerhalb von 2 Minuten erreicht, führen Sie sie vorsichtig mit dem Holzstab.
      2. Lassen Sie die Ratte sich mit der Umgebung des Labyrinths vertraut machen, während sie 20 Sekunden lang auf der Plattform steht, und entfernen Sie sie dann. Sobald sich die Ratte auf der Plattform befindet, lassen Sie sie 20 Sekunden lang stehen und entfernen Sie sie dann.
   4. Tägliche Wiederholung
      1. Wiederholen Sie die Prozedur des Trainingstages und setzen Sie die Ratte aus verschiedenen Quadranten ins Wasser. Wiederholen Sie Schritt 6.3.3. Setzen Sie das Training an 5 aufeinanderfolgenden Tagen fort.
   5. Sondentesttag: Entfernen Sie am 6^. Tag die Plattform und legen Sie die Ratte für 2 Minuten in denselben Quadranten.
   6. Beobachtung und Aufzeichnung: Nutzen Sie das Überwachungssystem, um das Verhalten der Ratte an Versuchs- und Sondentesttagen zu überwachen.
   7. Reinigung: Nachdem Sie die Ratte aus dem Wasserlabyrinth entfernt haben, trocknen Sie sie mit einem Handtuch gründlich ab.

Ergebnisse

Die in dieser Arbeit verwendete Apparatur war eine modifizierte Version des Kane-Modells und des pädiatrischen Modells^11,12 von Richelle Mychasiuk. In dieser Studie wurden SD-Ratten Schein- und mTBI-Gruppen zugeordnet. Um die Reproduzierbarkeit dieses Modells zu demonstrieren, führten wir drei unabhängige Replikate dieses Modells zusammen mit der Bewertung des akuten neurologischen Verhaltens durch, wobei jedes Experiment 8-12 ...

Diskussion

Dieses Modell simuliert erfolgreich ein mTBI mit geschlossenem Kopf, ohne dass ein Kopfhautschnitt oder eine Schädelöffnung erforderlich ist, und bietet eine genauere Darstellung des Aufprallszenarios, das beim Menschen beobachtet wird. Die Vermeidung von Kopfhautschnitten hilft, Entzündungsreaktionen zu verhindern, die möglicherweise nicht mit der tatsächlichen Situation übereinstimmen. Im Vergleich zum pädiatrischen Modell¹² von Richelle Mychasiuk ist das in dieser Studie verwendete Model...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic box	In-house	N/A	15 cm x 22 cm x 43 cm
Anesthesia Machine	RWD Life Science Co.	R540 Mice & Rat Animal Anesthesia Machine
Helmet	In-house	N/A	Stainless-steel disk measuring 10 mm in diameter and 3 mm in thickness
Morris water maze	RWD Life Science Co.		Diameter 150 cm, height 50 cm,platform diameter 35 cm
Open field	RWD Life Science Co.	63007	Width100 cm, height 40 cm
Panlab SMART V3.0	RWD Life Science Co.	SMART v3.0
Perforated weight	In-house	N/A	Weight of 550 g and diameter of 18 mm
Pillow	In-house	N/A	Wedge-shaped sponge to place beneath the rat's head