Modello di ratto di lesione traumatica lieve a testa chiusa e sua convalida

Riepilogo

Qui, presentiamo un modello di ratto con lesione cerebrale traumatica lieve (mTBI) a testa chiusa e la sua convalida che mostra una notevole somiglianza con l'mTBI umano per quanto riguarda le manifestazioni comportamentali durante le fasi acute e subacute.

Abstract

I modelli animali sono fondamentali per far progredire la nostra comprensione delle lesioni cerebrali traumatiche lievi (mTBI) e guidare la ricerca clinica. Per ottenere informazioni significative, è essenziale sviluppare un modello animale stabile e riproducibile. In questo studio, riportiamo una descrizione dettagliata di un modello di mTBI a testa chiusa e un metodo di validazione rappresentativo che utilizza ratti Sprague-Dawley per verificare l'effetto di modellazione. Il modello prevede la caduta di un peso di 550 g da un'altezza di 100 cm direttamente sulla testa di un ratto su una superficie distruttibile, seguita da una rotazione di 180 gradi. Per valutare la lesione, i ratti sono stati sottoposti a una serie di valutazioni neurocomportamentali 10 minuti dopo l'infortunio, tra cui il tempo di perdita di coscienza, il tempo di primo comportamento di ricerca, la capacità di fuga e il test di capacità di equilibrio del raggio. Durante le fasi acute e subacute successive all'infortunio, sono stati condotti test comportamentali per valutare la capacità di coordinazione motoria (Beam task), l'ansia (Open Field test) e le capacità di apprendimento e memoria (Morris Water Maze test). Il modello mTBI a testa chiusa ha prodotto una risposta coerente alle lesioni con una mortalità minima e ha replicato situazioni di vita reale. Il metodo di convalida ha verificato efficacemente lo sviluppo del modello e ha garantito la stabilità e la coerenza del modello.

Introduzione

La lesione cerebrale traumatica lieve (mTBI), o commozione cerebrale, è il tipo più diffuso di lesione e può portare a vari sintomi a breve termine e cronici¹. Questi sintomi possono includere vertigini, mal di testa, depressione e anedonia, tra gli altri, portando a una sofferenza significativa per le persone affette da mTBI². Poiché la maggior parte degli mTBI sono causati da traumi da corpo contundente³, diventa imperativo sviluppare modelli animali che imitino accuratamente tali lesioni. Questi modelli sono essenziali per ottenere una migliore comprensione della lesione e dei suoi meccanismi sottostanti, offrendo un ambiente controllato con variabilità ed eterogeneità ridotte rispetto agli studi sull'uomo.

Sono stati sviluppati numerosi modelli di roditori ben consolidati per le lesioni cerebrali traumatiche (TBI), tra cui la lesione da percussione fluida (FPI)⁴, l'impatto corticale controllato (CCI)⁵, la lesione da caduta di peso⁶, la lesione cerebrale traumatica da esplosione⁷ e altre. Tuttavia, questi modelli si concentrano principalmente sulla replica di scenari di trauma cranico da moderato a grave. Al contrario, i modelli sperimentali specificamente progettati per simulare l'mTBI hanno ricevuto relativamente meno attenzione e rimangono poco esplorati⁸. Pertanto, c'è un bisogno critico di stabilire un modello animale stabile e riproducibile che rappresenti accuratamente l'mTBI. Un tale modello migliorerebbe significativamente la nostra comprensione delle conseguenze neurobiologiche e comportamentali associate all'mTBI.

Non è possibile distinguere i deficit funzionali nei ratti con mTBI rispetto ai ratti normali attraverso l'osservazione casuale dopo che gli effetti dell'anestesia sono svaniti. Pertanto, è necessario somministrare test specifici. Nell'uomo, un'ampia gamma di valutazioni cliniche viene utilizzata per valutare i pazienti ^9,10,11. Allo stesso modo, la creazione di un modello di successo nel modello di ratto richiede anche l'utilizzo di strumenti di valutazione rapida per determinarne la validità.

In questo studio, presentiamo un modello di ratto mTBI a testa chiusa, che consente di studiare l'mTBI in un modo che assomiglia molto alla condizione umana. La descrizione dettagliata del modello e della sua procedura di validazione fornisce una comprensione completa dell'approccio sperimentale utilizzato nello studio dell'mTBI.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della Central South University. Tutti gli studi sono stati condotti in linea con il benessere e i principi etici degli animali da laboratorio.

1. Alimentazione degli animali e procedura di anestesia

1. Il gruppo ospita ratti maschi di Sprague-Dawley da 280-320 g e li mantiene in un ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore con accesso a cibo e acqua ad libitum. Eseguire lo studio dopo che i ratti si sono acclimatati per 6 giorni.
2. Anestetizzare il ratto con isoflurano al 3% a 0,6 L/min di flusso d'aria in una scatola a induzione fino a quando non risponde al pizzicamento della zampa o della coda. Mantenere la portata per 30 s.
   NOTA: I farmaci antidolorifici non sono stati utilizzati in quanto avrebbero interferito con la risposta del ratto nelle valutazioni neurocomportamentali.

2. Configurazione preoperatoria

1. Posizionare una spugna con un valore di durezza di 35D (peso di 35 kg/m3 di spugna), di lunghezza e larghezza identiche ma con uno spessore di 12 cm, all'interno di una scatola acrilica (15 cm x 22 cm x 43 cm) priva di coperchio superiore.
2. Taglia un foglio di stagnola (uno spessore di 20 μm) e fissalo sulla scatola acrilica usando del nastro adesivo per formare una superficie distruttibile in grado di sostenere il peso di un ratto. Inoltre, segna una linea di taglio di circa 10 cm come posizione designata per posizionare la testa del ratto.
3. Con l'aiuto di un supporto di ferro, fissare saldamente il tubo in PVC in posizione. Preparare un peso perforato, del peso di 550 grammi con un diametro di 18 millimetri. Fissare il peso a una lenza da pesca ad un'altezza di 1 metro all'interno di un tubo in cloruro di polivinile o PVC. e regolare la posizione del tubo guida 3 centimetri sopra la carta stagnola.
4. Prepara un casco e un cuscino. Realizza un casco utilizzando un disco in acciaio inossidabile di 10 mm di diametro e 3 mm di spessore. Prepara un cuscino di spugna a forma di cuneo da posizionare sotto la testa del ratto, assicurandoti che sia perpendicolare alla direzione di gravità.
   NOTA: Un diagramma schematico dell'apparato d'urto è presentato nella Figura 1. Il casco ha lo scopo di identificare il punto di impatto e migliorare la distribuzione della forza esterna. Il cuscino viene utilizzato per garantire danni uniformi e stabili.

3. Induzione mTBI

1. Posiziona rapidamente il ratto anestetizzato sul petto sulla carta stagnola.
   NOTA: Per l'induzione di mTBI sono necessari due operatori, uno per la preparazione e l'altro per la verifica.
2. Preparazione: Posiziona il cuscino sotto il ratto, assicurandoti che la sua testa sia parallela alla carta stagnola. Allineare il casco con le orecchie del topo e fissarlo in posizione.
3. Verifica: Verificare che il tubo in PVC sia posizionato direttamente sopra il casco. Una volta che entrambi gli operatori hanno confermato la corretta configurazione, procedere al passaggio successivo.
4. Induzione della rotazione della testa: Rilasciare il peso, lasciandolo cadere e colpire la testa del ratto, inducendo una caduta sulla spugna e una rotazione di 180°.
5. Metti il topo sulla schiena in una gabbia pulita.

4. Induzione fittizia

1. Trattare il ratto allo stesso modo della precedente descrizione dell'induzione mTBI, ma non sottoporlo all'impatto con la testa.

5. Procedura di validazione: valutazioni neurocomportamentali acute

NOTA: Le seguenti valutazioni sono state modificate in base ai punteggi di gravità neurologica⁹ e al protocollo di Flierl et ^al.10. Tutte queste valutazioni sono state eseguite 10 minuti dopo che il ratto aveva recuperato il riflesso di raddrizzamento.

1. Tempo di perdita di coscienza: Registrare la durata da quando il ratto viene anestetizzato a quando recupera il riflesso di raddrizzamento.
   NOTA: Il riflesso di raddrizzamento è il processo in cui il ratto si gira quando viene posizionato sulla schiena. La perdita del riflesso di raddrizzamento deve essere considerata come un punto finale umano e l'animale deve essere soppresso secondo le linee guida istituzionali.
2. Tempo del primo comportamento di ricerca: Registrare il tempo che intercorre tra il momento in cui il ratto viene anestetizzato e il momento in cui mostra il comportamento di ricerca per la prima volta.
   NOTA: Il comportamento di ricerca è un segno di interesse per l'ambiente, una risposta fisiologica.
3. Capacità di fuga
   1. Posizionare il ratto al centro di un apparecchio circolare (0,5 m di diametro e 0,3 m di altezza) con un'uscita (12,5 cm di lunghezza e 9 cm di larghezza).
   2. Registra il tempo che il topo impiega per uscire dal cerchio.
      NOTA: Se il ratto non esce dal cerchio entro 180 s, registrare il tempo come 180 s.
4. Test di capacità di bilanciamento del fascio
   1. Posiziona il ratto su una trave larga 3 cm, 2 cm e 1.5 cm per 1 minuto.
   2. Se il ratto mantiene un equilibrio con una postura stabile sulla trave, assegna un punteggio pari a 0.
   3. Se il topo afferra il lato della trave, assegna un punteggio di 1. Se il topo abbraccia la trave e un arto cade da essa, segnalo come 2.
   4. Se il topo abbraccia la trave e i due arti cadono da essa o ruotano su di essa (>60 s), segnalo come 3.
   5. Se il topo tenta di stare in equilibrio sulla trave ma cade (> 40 s), segnalo come 4.
   6. Se il topo tenta di stare in equilibrio sulla trave ma cade (>20 s), segnalo come 5.
   7. Se il ratto non tenta di stare in equilibrio o di aggrapparsi alla trave e cade entro 20 s, segnalo come 6.
      NOTA: Il test di bilanciamento del fascio non richiede una pre-prova.

6. Procedura di validazione: valutazione del neurocomportamento

NOTA: Prima degli esperimenti comportamentali, i ratti sono stati manipolati per 2 minuti al giorno per 3 giorni consecutivi per ridurre al minimo lo stress e l'interruzione della novità. Tutti gli esperimenti comportamentali sono stati eseguiti ponendo gli animali nell'ambiente di prova per 60 minuti prima dell'inizio dell'esperimento.

1. Capacità di coordinazione motoria (compito della trave)
   1. Configurazione sperimentale
      1. Posiziona i ratti su un'estremità della trave di equilibrio (lunga 1,5 m e a 75 cm dal pavimento). Posiziona una scatola di fuga (una gabbia obliqua per la casa della lettiera) sull'altra estremità.
      2. Posizionare un'imbottitura in schiuma sotto la trave per mitigare il potenziale rischio di lesioni ai ratti in caso di cadute durante la prova.
      3. Accendere la videocamera.
      4. Pianifica i giorni di test in momenti specifici dopo l'infortunio o dopo il trattamento fittizio (ad esempio, giorno 1, giorno 3 e giorno 7).
   2. Fase di formazione (2 giorni)
      1. Addestra i ratti ad attraversare il raggio largo 4 cm 3 volte consecutive, seguito da due prove sul raggio largo 2 cm.
      2. Durante l'addestramento, guida delicatamente i ratti attraverso la trave fino a quando non riescono ad attraversarli facilmente senza interferenze.
   3. Esperimento del fascio di equilibrio
      1. Posiziona i ratti sulla trave larga 2 cm per 5 prove consecutive.
      2. Registra l'inizio e la fine di ogni prova quando il naso del topo attraversa rispettivamente la linea di partenza e di arrivo.
      3. Riportare i ratti nelle loro gabbie alla fine dell'esperimento.
   4. Test di base
      1. Condurre l'esperimento della trave di equilibrio prima della lesione o del trattamento.
      2. Calcolare i valori medi di questi 5 studi consecutivi per stabilire il basale per ciascun ratto.
   5. Analisi dei dati
      1. Analizza il tempo necessario per attraversare la trave e il numero totale di scivolamenti del retropiede utilizzando l'analisi video di ricercatori ciechi alle condizioni sperimentali.
2. Ansia (test in campo aperto)
   1. Configurazione sperimentale
      1. Prepara l'arena in campo aperto, assicurandoti che sia pulita e priva di eventuali segnali odorosi precedenti. Dividi l'arena in tre zone: una zona interna centrale (33 cm x 33 cm), una zona centrale (66 cm x 66 cm) e una zona esterna.
   2. Fase di collaudo
      1. Posiziona un topo al centro dell'arena in campo aperto e avvia il timer. Consenti al topo di esplorare l'arena per 5 minuti liberamente. Dopo 5 minuti, rimetti con cura e delicatezza il ratto nella sua gabbia di casa.
   3. Raccolta dei dati
      1. Misurare la distanza totale percorsa dal ratto durante il periodo di esplorazione di 5 minuti. Determina il tempo che il ratto trascorre nelle zone centrali interne, centrali ed esterne.
   4. Analisi dei dati
      1. Utilizzare la distanza totale percorsa come misura del comportamento esplorativo complessivo e dell'abilità locomotoria. Calcola il tempo trascorso nella zona interna centrale come indicatore di risposte ansiose.
3. Capacità di apprendimento e memoria (test del labirinto d'acqua di Morris)
   1. Assicurarsi che l'apparato del labirinto d'acqua sia in condizioni adeguate. Tingi l'acqua di nero e posiziona le stecche nelle quattro direzioni cardinali. Posizionare la piattaforma 2.5 cm sotto la superficie dell'acqua.
   2. Impostare un sistema di monitoraggio per registrare e osservare il comportamento dei ratti.
   3. Giornata di trail
      1. Posiziona rapidamente il topo nel labirinto d'acqua. Se il topo non riesce a raggiungere la piattaforma entro 2 minuti, guidalo delicatamente usando il bastone di legno.
      2. Lascia che il topo familiarizzi con l'ambiente del labirinto mentre si trova sulla piattaforma per 20 secondi, quindi rimuovilo. Una volta che il topo è sulla piattaforma, lascialo riposare per 20 secondi, quindi rimuovilo.
   4. Ripetizione quotidiana
      1. Ripeti la procedura del giorno di addestramento, posizionando il ratto nell'acqua da diversi quadranti. Ripetere il passaggio 6.3.3. Continuare l'allenamento per 5 giorni consecutivi.
   5. Giorno del test della sonda: Il 6^° giorno, rimuovere la piattaforma e posizionare il ratto nello stesso quadrante per 2 minuti.
   6. Osservazione e registrazione: utilizzare il sistema di monitoraggio per monitorare il comportamento del ratto nei giorni di prova e di test della sonda.
   7. Pulizia: Dopo aver rimosso il ratto dal labirinto d'acqua, usa un asciugamano per asciugarlo accuratamente.

Risultati

L'apparecchio utilizzato in questo lavoro era una versione modificata del modello Kane e del modello pediatrico^11,12 di Richelle Mychasiuk. In questo studio, i ratti SD sono stati assegnati a gruppi sham e mTBI. Per dimostrare la riproducibilità di questo modello, abbiamo condotto tre repliche indipendenti di questo modello insieme alla valutazione neurocomportamentale acuta, con ogni esperimento che ha coinvolto 8-12 ratti. In q...

Discussione

Questo modello simula con successo un mTBI a testa chiusa senza la necessità di un'incisione del cuoio capelluto o dell'apertura del cranio, fornendo una rappresentazione più accurata dello scenario di impatto osservato nei casi umani. Evitare l'incisione del cuoio capelluto aiuta a prevenire risposte infiammatorie che potrebbero non essere in linea con la situazione reale. Rispetto al modello pediatrico¹² di Richelle Mychasiuk, il modello utilizzato in questo studio è specificamente adattato p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic box	In-house	N/A	15 cm x 22 cm x 43 cm
Anesthesia Machine	RWD Life Science Co.	R540 Mice & Rat Animal Anesthesia Machine
Helmet	In-house	N/A	Stainless-steel disk measuring 10 mm in diameter and 3 mm in thickness
Morris water maze	RWD Life Science Co.		Diameter 150 cm, height 50 cm,platform diameter 35 cm
Open field	RWD Life Science Co.	63007	Width100 cm, height 40 cm
Panlab SMART V3.0	RWD Life Science Co.	SMART v3.0
Perforated weight	In-house	N/A	Weight of 550 g and diameter of 18 mm
Pillow	In-house	N/A	Wedge-shaped sponge to place beneath the rat's head