Modelo de Rata de Lesión Traumática Leve de Cabeza Cerrada y su Validación

Resumen

Aquí, presentamos un modelo de lesión cerebral traumática leve (mTBI) de cabeza cerrada y su validación que muestra una notable similitud con la mTBI humana en lo que respecta a las manifestaciones conductuales durante las etapas aguda y subaguda.

Resumen

Los modelos animales son cruciales para avanzar en nuestra comprensión de la lesión cerebral traumática leve (mTBI, por sus siglas en inglés) y guiar la investigación clínica. Para lograr conocimientos significativos, es esencial desarrollar un modelo animal estable y reproducible. En este estudio, reportamos una descripción detallada de un modelo de mTBI de cabeza cerrada y un método de validación representativo utilizando ratas Sprague-Dawley para verificar el efecto del modelado. El modelo consiste en dejar caer un peso de masa de 550 g desde una altura de 100 cm directamente sobre la cabeza de una rata sobre una superficie destructible, seguido de un giro de 180 grados. Para evaluar la lesión, las ratas se sometieron a una serie de evaluaciones neuroconductuales 10 minutos después de la lesión, incluido el tiempo de pérdida de conciencia, el tiempo de primer comportamiento de búsqueda, la capacidad de escape y la prueba de capacidad de equilibrio del haz. Durante las etapas aguda y subaguda después de la lesión, se realizaron pruebas conductuales para evaluar la capacidad de coordinación motora (tarea Beam), la ansiedad (prueba Open Field) y las habilidades de aprendizaje y memoria (prueba Morris Water Maze). El modelo de LCTM de cabeza cerrada produjo una respuesta consistente a la lesión con una mortalidad mínima y reprodujo situaciones de la vida real. El método de validación verificó eficazmente el desarrollo del modelo y garantizó la estabilidad y coherencia del modelo.

Introducción

La lesión cerebral traumática leve (mTBI, por sus siglas en inglés), o conmoción cerebral, es el tipo de lesión más frecuente y puede provocar^{varios síntomas} crónicos y a corto plazo. Estos síntomas pueden incluir mareos, dolores de cabeza, depresión y anhedonia, entre otros, lo que lleva a un sufrimiento significativo para las personas afectadas por mTBI². Dado que la mayoría de las lesiones cerebrales traumáticas leves son causadas por un traumatismo por fuerza contundente³, se vuelve imperativo desarrollar modelos animales que imiten con precisión dichas lesiones. Estos modelos son esenciales para obtener una mejor comprensión de la lesión y sus mecanismos subyacentes, ofreciendo un entorno controlado con una variabilidad y heterogeneidad reducidas en comparación con los estudios en humanos.

Se han desarrollado numerosos modelos de roedores bien establecidos para la lesión cerebral traumática (TBI), incluida la lesión por percusión de fluidos (FPI)⁴, el impacto cortical controlado (CCI)⁵, la lesión por pérdida de peso⁶, la lesión cerebral traumática por explosión⁷ y otras. Sin embargo, estos modelos se centran principalmente en replicar escenarios de LCT de moderadas a graves. Por el contrario, los modelos experimentales diseñados específicamente para simular el TCE leve han recibido relativamente menos atención y siguen siendo poco explorados⁸. Por lo tanto, existe una necesidad crítica de establecer un modelo animal estable y reproducible que represente con precisión el TCEm. Un modelo de este tipo mejoraría significativamente nuestra comprensión de las consecuencias neurobiológicas y conductuales asociadas con la LCTM.

No se pueden distinguir los déficits funcionales en las ratas mTBI en comparación con las ratas normales a través de la observación casual después de que los efectos de la anestesia hayan desaparecido. Por lo tanto, es necesario administrar pruebas específicas. En humanos, se utiliza una amplia gama de evaluaciones clínicas para evaluar a los pacientes ^9,10,11. Del mismo modo, el establecimiento de un modelo exitoso en el modelo de ratas también requiere el uso de herramientas de evaluación rápida para determinar su validez.

En este estudio, presentamos un modelo de rata mTBI de cabeza cerrada, que permite la investigación de mTBI de una manera que se asemeja mucho a la condición humana. La descripción detallada del modelo y su procedimiento de validación proporciona una comprensión completa del enfoque experimental utilizado en el estudio de la LCTm.

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Protocolo

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Central del Sur. Todos los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con los principios éticos y de bienestar de los animales de laboratorio.

1. Alimentación animal y procedimiento de anestesia

1. Aloje en grupo ratas macho Sprague-Dawley de 280-320 g y manténgalas en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h con acceso a comida y agua ad libitum. Realizar el estudio después de que las ratas se aclimaten durante 6 días.
2. Anestesiar a la rata con isoflurano al 3% a un flujo de aire de 0,6 L/min en una caja de inducción hasta que no responda al pellizco de la pata o la cola. Mantenga el caudal durante 30 s.
   NOTA: No se utilizaron analgésicos ya que interferirían con la respuesta de la rata en las evaluaciones neuroconductuales.

2. Configuración preoperatoria

1. Coloque una esponja con un valor de dureza de 35D (peso de 35 kg/m3 de esponja), con idéntico largo y ancho pero un grosor de 12 cm, dentro de una caja acrílica (15 cm x 22 cm x 43 cm) sin tapa superior.
2. Recorta una lámina de estaño (de 20 μm de grosor) y pégala a la caja acrílica con cinta adhesiva para formar una superficie destructible capaz de soportar el peso de una rata. Además, marque una línea de corte de aproximadamente 10 cm para que sea el lugar designado para colocar la cabeza de la rata.
3. Con la ayuda de un soporte de hierro, asegure firmemente el tubo de PVC en su lugar. Prepara un peso perforado, de 550 gramos de peso y 18 milímetros de diámetro. Sujete el peso a un hilo de pescar a una altura de 1 metro dentro de un tubo de cloruro de polivinilo o PVC. y ajuste la posición del tubo guía 3 centímetros por encima del papel de aluminio.
4. Prepara un casco y una almohada. Fabrica un casco con un disco de acero inoxidable de 10 mm de diámetro y 3 mm de grosor. Prepara una almohada de esponja en forma de cuña para colocarla debajo de la cabeza de la rata, asegurándote de que esté perpendicular a la dirección de la gravedad.
   NOTA: En la Figura 1 se presenta un diagrama esquemático del aparato de impacto. El casco sirve para identificar el lugar del impacto y mejorar la distribución de la fuerza externa. La almohada se utiliza para garantizar un daño uniforme y estable.

3. Inducción de mTBI

1. Coloque rápidamente la rata anestesiada sobre su pecho sobre el papel de aluminio.
   NOTA: Se requieren dos operadores para la inducción de mTBI, uno para la preparación y el otro para la verificación.
2. Preparación: Coloque la almohada debajo de la rata, asegurándose de que su cabeza esté paralela al papel de aluminio. Alinea el casco con las orejas de la rata y asegúralo en su lugar.
3. Verificación: Verifique que el tubo de PVC esté colocado directamente sobre el casco. Una vez que ambos operadores confirmen la configuración correcta, continúe con el siguiente paso.
4. Inducción de la rotación de la cabeza: Suelta el peso, dejándolo caer y golpear la cabeza de la rata, induciendo una caída sobre la esponja y una rotación de 180°.
5. Coloca a la rata boca arriba en una jaula limpia.

4. Inducción simulada

1. Trate a la rata de la misma manera que en la descripción anterior de la inducción de la lesión cerebral traumática leve, pero no la someta al impacto en la cabeza.

5. Procedimiento de validación: Evaluaciones neuroconductuales agudas

NOTA: Las siguientes evaluaciones fueron modificadas con base en las Puntuaciones de Severidad Neurológica⁹ y el protocolo de Flierl et ^al.10. Todas estas evaluaciones se realizaron 10 minutos después de que la rata recuperara el reflejo de enderezamiento.

1. Tiempo de pérdida de conciencia: Registre el tiempo que transcurre desde que la rata es anestesiada hasta que recupera el reflejo de enderezamiento.
   NOTA: El reflejo de enderezamiento es el proceso en el que la rata se da la vuelta cuando se coloca boca arriba. La pérdida del reflejo de enderezamiento debe considerarse como un criterio de valoración humanitario, y el animal debe ser sacrificado según las pautas institucionales.
2. Tiempo de la primera conducta de búsqueda: Registre la duración desde que la rata es anestesiada hasta que muestra la conducta de búsqueda por primera vez.
   NOTA: La conducta de búsqueda es un signo de interés en el entorno, una respuesta fisiológica.
3. Capacidad de escape
   1. Coloque la rata en el centro de un aparato circular (0,5 m de diámetro y 0,3 m de altura) con salida (12,5 cm de largo y 9 cm de ancho).
   2. Registra el tiempo que tarda la rata en salir del círculo.
      NOTA: Si la rata no sale del círculo dentro de los 180 s, registre el tiempo como 180 s.
4. Prueba de capacidad de equilibrio del haz
   1. Coloque la rata en una viga de 3 cm, 2 cm y 1,5 cm de ancho durante 1 minuto.
   2. Si la rata mantiene el equilibrio con una postura estable en la viga, puntúalo como 0.
   3. Si la rata agarra el costado de la viga, dale una puntuación de 1. Si la rata abraza la viga y una extremidad se cae de ella, puntúala como 2.
   4. Si la rata abraza la viga y las dos extremidades se caen de ella o giran sobre ella (>60 s), puntúala como 3.
   5. Si la rata intenta mantener el equilibrio en la viga pero se cae (> 40 s), puntúalo como 4.
   6. Si la rata intenta mantener el equilibrio en la viga pero se cae (>20 s), puntúalo como 5.
   7. Si la rata no intenta mantener el equilibrio o colgarse de la viga y se cae dentro de los 20 segundos, puntúalo como 6.
      NOTA: La prueba de equilibrio de viga no requiere una prueba previa.

6. Procedimiento de validación: Evaluación neuroconductual

NOTA: Antes de los experimentos conductuales, las ratas fueron manipuladas durante 2 minutos diarios durante 3 días consecutivos para minimizar el estrés y la interrupción de la novedad. Todos los experimentos conductuales se realizaron colocando a los animales en el entorno de prueba durante 60 minutos antes del inicio del experimento.

1. Capacidad de coordinación motora (tarea de haz)
   1. Configuración experimental
      1. Coloque las ratas en un extremo de la barra de equilibrio (1,5 m de largo y 75 cm por encima del suelo). Coloque una caja de escape (una jaula de cama inclinada) en el otro extremo.
      2. Coloque un acolchado de espuma debajo de la viga para mitigar el riesgo potencial de lesiones a las ratas en caso de caídas durante la prueba.
      3. Encienda la cámara de video.
      4. Programe los días de prueba en momentos específicos después de la lesión o después del tratamiento simulado (p. ej., el día 1, el día 3 y el día 7).
   2. Fase de formación (2 días)
      1. Entrene a las ratas para que crucen la viga de 4 cm de ancho 3 veces consecutivas, seguidas de dos intentos en la viga de 2 cm de ancho.
      2. Durante el entrenamiento, guíe suavemente a las ratas a través de la viga hasta que puedan cruzarla fácilmente sin interferencias.
   3. Experimento de la barra de equilibrio
      1. Coloque las ratas en la viga de 2 cm de ancho durante 5 intentos consecutivos.
      2. Registre el inicio y el final de cada prueba cuando la nariz de la rata cruza las líneas de salida y meta, respectivamente.
      3. Regresa a las ratas a sus jaulas al final del experimento.
   4. Pruebas de línea de base
      1. Realice el experimento de la barra de equilibrio antes de la lesión o el tratamiento.
      2. Calcule los valores promedio de estos 5 ensayos consecutivos para establecer la línea de base para cada rata.
   5. Análisis de datos
      1. Analice el tiempo para cruzar la viga y el número total de resbalones del retropié utilizando el análisis de video realizado por investigadores ciegos a las condiciones experimentales.
2. Ansiedad (prueba de campo abierto)
   1. Configuración experimental
      1. Prepare la arena de campo abierto, asegurándose de que esté limpia y libre de señales de olor previas. Divide la arena en tres zonas: una zona interior central (33 cm x 33 cm), una zona media (66 cm x 66 cm) y una zona exterior.
   2. Fase de prueba
      1. Coloque una rata en el centro de la arena de campo abierto y encienda el temporizador. Deja que la rata explore la arena durante 5 minutos libremente. Después de 5 minutos, regrese a la rata con cuidado y cuidado a su jaula de origen.
   3. Recogida de datos
      1. Mide la distancia total recorrida por la rata durante el período de exploración de 5 minutos. Determina el tiempo que la rata pasa en las zonas centrales internas, medias y externas.
   4. Análisis de datos
      1. Utilice la distancia total recorrida como una medida del comportamiento exploratorio general y la capacidad locomotora. Calcule el tiempo que se pasa en la zona interna central como indicador de respuestas similares a la ansiedad.
3. Habilidades de aprendizaje y memoria (prueba del laberinto acuático de Morris)
   1. Asegúrese de que el aparato del laberinto de agua esté en buenas condiciones. Tiñe el agua de negro y coloca tacos en los cuatro puntos cardinales. Coloque la plataforma a 2,5 cm por debajo de la superficie del agua.
   2. Establezca un sistema de monitoreo para registrar y observar el comportamiento de las ratas.
   3. Día de trail
      1. Coloca rápidamente a la rata en el laberinto de agua. Si la rata no llega a la plataforma en 2 minutos, guíala suavemente con el palo de madera.
      2. Deja que la rata se familiarice con el entorno del laberinto mientras está de pie en la plataforma durante 20 s, luego retírala. Una vez que la rata esté en la plataforma, déjala reposar durante 20 s y luego retírala.
   4. Repetición diaria
      1. Repita el procedimiento del día de entrenamiento, colocando a la rata en el agua desde diferentes cuadrantes. Repita el paso 6.3.3. Continúa el entrenamiento durante 5 días consecutivos.
   5. Día de la prueba de la sonda: En el^6º día, retire la plataforma y coloque la rata en el mismo cuadrante durante 2 min.
   6. Observación y registro: Utilice el sistema de monitoreo para monitorear el comportamiento de la rata en los días de prueba y prueba.
   7. Limpieza: Después de sacar a la rata del laberinto de agua, use una toalla para secarla bien.

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Resultados

El aparato utilizado en este trabajo fue una versión modificada del modelo de Kane y del modelo pediátrico de Richelle Mychasiuk^11,12. En este estudio, las ratas SD fueron asignadas a grupos simulados y de mTBI. Para demostrar la reproducibilidad de este modelo, realizamos tres réplicas independientes de este modelo junto con la evaluación neuroconductual aguda, y cada experimento involucró a 8-12 ratas. En este estudio, util...

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Discusión

Este modelo simula con éxito un traumatismo craneoencefálico leve de cabeza cerrada sin necesidad de incisión en el cuero cabelludo o apertura del cráneo, lo que proporciona una representación más precisa del escenario de impacto observado en casos humanos. Evitar la incisión en el cuero cabelludo ayuda a prevenir respuestas inflamatorias que pueden no alinearse con la situación real. En comparación con el modelo pediátrico¹² de Richelle Mychasiuk, el modelo utilizado en este estudio est...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic box	In-house	N/A	15 cm x 22 cm x 43 cm
Anesthesia Machine	RWD Life Science Co.	R540 Mice & Rat Animal Anesthesia Machine
Helmet	In-house	N/A	Stainless-steel disk measuring 10 mm in diameter and 3 mm in thickness
Morris water maze	RWD Life Science Co.		Diameter 150 cm, height 50 cm,platform diameter 35 cm
Open field	RWD Life Science Co.	63007	Width100 cm, height 40 cm
Panlab SMART V3.0	RWD Life Science Co.	SMART v3.0
Perforated weight	In-house	N/A	Weight of 550 g and diameter of 18 mm
Pillow	In-house	N/A	Wedge-shaped sponge to place beneath the rat's head