JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا طريقة لدراسة سبات خنفساء البطاطس في كولورادو في ظل الظروف الطبيعية للمنطقة المعتدلة بالإضافة إلى تقنية لجمع الخنافس في الشتاء. تسمح هذه الطريقة بالحصول على العدد المطلوب من الأفراد الذين يقضون الشتاء لإجراء تحليلات مختلفة في أي مرحلة من مراحل السبات.

Abstract

واحدة من الآفات الرئيسية للبطاطس Solanum tuberosum L. في المنطقة المعتدلة هي حشرة خنفساء البطاطس كولورادو (CPB). تجرى معظم الدراسات حول مناعة وأمراض CPB خلال مراحل التغذية النشطة. ومع ذلك ، هناك عدد أقل من الدراسات حول مراحل الراحة ، على الرغم من أن هذه الخنافس تقضي معظم دورة حياتها في حالة توقف الشتاء (السبات). في هذا العمل ، تم تطوير واختبار طريقة للتحقيق في سبات CPB في ظل الظروف الطبيعية ، مما يتيح فرصة لجمع عدد كاف من الأفراد في فصل الشتاء. في هذه المقالة ، تم تقييم بقاء CPB ، وتم تحديد العوامل المعدية في مراحل مختلفة من السبات. وزاد معدل الوفيات الناجمة عن انخفاض معدل وفيات الشلل الانفجاري خلال فترة السبات، حيث بلغ الحد الأقصى في نيسان/أبريل وأيار/مايو. تم عزل الفطريات المسببة للأمراض الحشرية (Beauveria و Isaria و Lecanicillium) والبكتيريا Bacillus و Sphingobacterium و Peribacillus و Pseudomonas و Serratia من الحشرات الميتة. كان معدل بقاء الخنافس طوال فترة السبات 61٪. لم يتم العثور على خنافس مجمدة أو مجففة ، مما يشير إلى نجاح الطريقة المقدمة.

Introduction

تعتبر خنفساء البطاطس في كولورادو Leptinotarsa decemlineata Say (CPB) آفة مهمة لنباتات Solanaceae ، ومعظمها البطاطس Solanum tuberosum L. النطاق الجغرافي لهذا النوع هو أكثر من 16 مليون كم2 ويتوسع باستمرار1. يحتوي CPB على توقف شتوي اختياري ، والسبات إلزامي في المنطقة المعتدلة. يحدث الانقطاع المؤقت بسبب فترة ضوئية قصيرة اليوم ويتم تعديله بواسطة درجة الحرارة1. تقضي هذه الخنافس الشتاء في مرحلة البلوغ عن طريق الحفر في التربة. مع زيادة خطوط العرض ، تمتد مدة فترة السبات. في المنطقة المعتدلة ، خاصة في المناطق الشمالية من مداها ، يستمر فصل الشتاء لمدة تصل إلى 9 أشهر: من أغسطس إلى سبتمبر حتى مايو ويونيو (Noskov et al. ، ملاحظات شخصية). خلال هذه الفترة ، تتعرض CPB - تماما مثل أي حشرة أخرى في المنطقة المعتدلة - لظروف الشتاء غير المواتية ويجب أن تزيد من تحملها للبرد. في الوقت نفسه ، يزيد ملامسة الخنافس للتربة من خطر الإصابة بمختلف الكائنات الحية الدقيقة الانتهازية والمسببة للأمراض2. لذلك ، تحتاج هذه الخنافس إلى الحفاظ على مستوى معين من نشاط الجهاز المناعي أثناء السبات ، وهو أمر مكلف أيضا بالطاقة. ومع ذلك ، حتى لو نجت الحشرة من العدوى ، فقد يقلل المرض من صلابتها الباردة3. تجدر الإشارة إلى أن انخفاض درجة الحرارة ليس هو السبب الوحيد لوفيات الشتاء من CPB. يلعب نقص الأكسجين دورا مهما أيضا ، وفي ظل بعض الظروف ، يمكن أن يكون العامل الرئيسي لوفيات الشتاء 4,5.

من المعروف أن معدل الوفيات الشتوي الطبيعي ل CPB يمكن أن يكون مرتفعا جدا ، حيث يصل إلى 100٪ في التربة الطينيةالطينية 6. وبالتالي ، فإن فصل الشتاء هو واحد من أكثر الفترات أهمية في دورة حياة CPB. ومع ذلك ، لا تزال البيانات المتعلقة بعلم وظائف الأعضاء ، ونشاط الجهاز المناعي ، والبقاء على قيد الحياة ، وغيرها من المعلمات لسبات CPB في ظل الظروف الطبيعية محدودة. هناك دراسات حول التعبير الجيني التفاضلي والمعلمات الفسيولوجية المختلفة في البالغين CPB أثناء التوقف واستجابة للصدمة الباردة7،8،9،10،11،12 ؛ ومع ذلك ، فقد تم إجراء هذه التحليلات بشكل أساسي عن طريق تحريض الإجهاد المؤقت أو البارد في ظل ظروف المختبر دون تقلبات طبيعية في درجة الحرارة والرطوبة وحمل مسببات الأمراض المحلية. ومع ذلك ، فإن البحث في فسيولوجيا هذه الخنافس التي تم جمعها عن طريق التنقيب من التربة في ظل الظروف الطبيعية أمر مهم. تمت دراسة جوانب مختلفة من CPB overwintering في ظل الظروف الطبيعية بنشاط في سبعينيات القرن العشرين-ثمانينيات القرن العشرين13،14،15،16،17،18. من ناحية أخرى ، لم تتضمن هذه الدراسات حفر CPB من التربة في الشتاء. بالإضافة إلى ذلك ، لم يتم توفير تقنية للإسبات المتحكم فيه ل CPB ووصف الأقفاص بالتفصيل. وبالتالي ، هناك حاجة إلى التحقيق في فسيولوجيا CPBs التي تقضي الشتاء في البيئات الطبيعية19.

كان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير واختبار طريقة للسبات الخاضع للرقابة للبالغين CPB في ظل الظروف الطبيعية. تسمح الطريقة المقترحة بالحصول على العدد المطلوب من أفراد CPB للفحوصات الميكروبيولوجية والمناعية وغيرها أثناء السبات في ظل الظروف الميدانية للمناخ القاري. يمكن تكييف هذه الطريقة وتطبيقها على أنواع الحشرات الأخرى التي تقضي الشتاء في التربة تحت الثلج.

Protocol

1. وصف أقفاص السبات

ملاحظة: اعتمادا على أهداف التجربة ، يختلف عدد الأقفاص. استخدم ثلاثة أقفاص على الأقل لكل تاريخ أخذ العينات. لتقدير عدد الخنافس التي ستظهر ، قم بإعداد ثلاثة أقفاص إضافية على الأقل ، والتي لن يتم إخراجها من التربة حتى الربيع.

  1. استخدم أقفاصا مصنوعة من إطار خشبي صلب بحجم 25 × 25 × 40 سم (الطول × العرض × الارتفاع).
  2. لبناء إطار للقفص ، استخدم شرائح خشبية بسمك 2 سم على الأقل وعرض 4 سم.
  3. قم بتغطية الجزء الداخلي من القفص بشبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ بحجم فتحات لا يزيد حجمها عن 5 مم × 3 مم. استخدم دباسة خشبية لإصلاح الشبكة.
  4. ثبت شبكة الفولاذ المقاوم للصدأ إلى الخارج من الأسفل باستخدام الدباسة.
  5. قم بتبطين الجزء الداخلي من القفص بنسيج أرضي صناعي أسود بكثافة 60 جم / م2.
    ملاحظة: يعمل التكسية الأرضية كحاجز إضافي لمنع هروب الخنافس. لا تستخدمه في التجارب المتعلقة بتحريك مسببات الأمراض الحشرية والطفيليات بنشاط.
  6. نعلق بإحكام أنبوب من النسيج الصناعي الشفاف تنفس حوالي 60 سم إلى أعلى القفص.
  7. اعبر وثبت حبلين قويين في قاع القفص لسحبه من التربة عند الحاجة.

2. تركيب الأقفاص

  1. احفر حفرة بعمق 40 سم في التربة وضع القفص بالداخل.
  2. وضع العشب الجاف أو القش على الحفرة.
  3. ضع القفص بالداخل بحيث يكون القش أو العشب الجاف بين جدران القفص والتربة.
  4. املأ الأقفاص بالتربة من نفس حقل البطاطس حيث يتم جمع الحشرات.
  5. قم بتركيب أجهزة تسجيل بيانات درجة الحرارة والرطوبة المقاومة للماء في الأقفاص على الأعماق المطلوبة.
    ملاحظة: يمكن استخدام مسجلات البيانات من أي مصنع ويجب أن تكون قادرة على العمل في درجات حرارة منخفضة.
  6. ازرع شتلات البطاطس داخل كل قفص قبل 3-4 أسابيع من إدخال الخنافس وسقيها بشكل معتدل.
  7. ثبت أنبوبا من القماش الصناعي عموديا على عصا من أي مادة مثبتة على السطح الخارجي للقفص.

3. تربية الحشرات قبل فصل الشتاء

  1. اجمع الخنافس البالغة يدويا في حقول البطاطس الخالية من المبيدات الحشرية قرب نهاية نباتات البطاطس.
    ملاحظة: تختلف الخنافس البالغة اختلافا كبيرا عن اليرقات وتتميز بالإليترا المخططة ، في حين أن اليرقات حمراء.
  2. احتفظ بالخنافس المجمعة في دلاء بلاستيكية سعة 15-20 لترا (200 فرد كحد أقصى لكل دلو) تحتوي على قمم بطاطس لتغذية الحشرات قبل وضعها في الأقفاص.
  3. تغطية الدلاء بنسيج تنفس.
    ملاحظة: لا تحتفظ بالحشرات في دلاء لأكثر من 12 ساعة. استخدم قمم بطاطس كبيرة بما يكفي لمنع تراكم الخنافس في قاع الدلاء.
  4. ضع ما لا يزيد عن 200 فرد من CPB على نباتات البطاطس المغطاة بشبكة النسيج الاصطناعية.
  5. عندما تستهلك قمم البطاطس ، أضيفي أخرى طازجة موضوعة في وعاء بلاستيكي يحتوي على الماء وقم بتغيير قمم البطاطس يوميا بعد ذلك.
    ملاحظة: لإصلاح السيقان في جرة ، استخدم الصوف القطني والبارافيلم. تحقق بعناية من السيقان القديمة بحثا عن الخنافس عند إزالتها.
  6. بمجرد حفر جميع الخنافس في التربة لفصل الشتاء ، قم بفك أنبوب النسيج الصناعي من العصا ووضع القماش.

4. جمع الحشرات خلال فصل الشتاء

  1. إزالة الثلج فوق سطح القفص.
  2. قم بفك القفص على كل جانب بمجرفة قوية.
  3. اسحب القفص من التربة باستخدام الحبال.
  4. أحضر القفص إلى المختبر.
    ملاحظة: اعتمادا على أهداف التجربة ، قد تضطر الخنافس السبات إلى أن تكون غير نشطة قبل التحليل. في هذه الحالة ، يجب أن تكون درجة الحرارة في المختبر أثناء عزل الخنافس من التربة ~ 2-5 °C.
  5. قم بإزالة التربة من الصندوق في أجزاء صغيرة ، وقم بتفتيت قطع كبيرة من التربة بعناية ، وعزل الخنافس باستخدام الملقط.
  6. افصل الخنافس الحية عن الجثث. تخلق الخنافس الصحية الحية تربة مدمجة حولها ، وتشكل تجويف هواء (ما يسمى المهد) ، وبالتالي يمكن فصلها بسهولة عن التربة. الخنافس التي تقتلها الفطريات محنطة أو لها أفطورة مرئية على السطح. الحشرات المتحللة بكتريا مظلمة.
  7. نخل التربة من خلال غربال للتأكد من عزل جميع الخنافس وعدم تلفها.
  8. ضع الجثث التي تظهر عليها أعراض العدوى الفطرية أو التحلل البكتيري في أنبوب طرد مركزي معقم فردي سعة 15 مل للتعرف عليه في المستقبل.
  9. قم بتخزين الخنافس الحية في الثلاجة عند درجة حرارة 0-2 درجة مئوية حتى يتم تحليلها في حاوية مغلقة التهوية تحتوي على كرة قطنية مبللة.

5. تحضير عينات الأعضاء والأنسجة

  1. لجمع الدملمف ، قم بعمل ثقب في الجزء الجانبي من البطن تحت elytra باستخدام إبرة الأنسولين.
    ملاحظة: خلال فصل الشتاء ، يتم تقليل كمية الدملمف بشكل كبير ، مما يجعل من الصعب جمع هذا السائل.
  2. لعزل القناة الهضمية ، قم بقطع كبسولة الرأس ، واضغط على جميع المحتويات في طبق بتري مع عازلة للفوسفات ، وافصل القناة الهضمية ، ونظفها من الدهون والأوعية المالبيغية.
  3. افصل الجزء المرغوب فيه من القناة الهضمية ، مثل الأمعاء الأمامية أو الأمعاء الوسطى أو الأمعاء الخلفية.
  4. لعزل الجسم الدهني ، افصله عن الأنسجة الأخرى بعد عزل الأمعاء.
    ملاحظة: يمكن استخدام الأنسجة المعزولة لقياس نشاط الإنزيمات المضادة للأكسدة وإزالة السموم (مثال: الشكل التكميلي 1) ، أو تحليل تنظيم جينات مسار الإشارات المناعية (مثال: الشكل التكميلي 2) ، أو metabarcoding لمحتويات أمعاء الحشرات ، إلخ.

6. عزل الكائنات الحية الدقيقة من الجثث

  1. لعزل الفطريات المسببة للأمراض الحشرية من الجثث ، ضع الحشرات المحنطة في غرفة رطوبة معقمة.
  2. استخدم الكونيديا الهوائية (إن وجدت) أو التصلب من المحتويات الداخلية للخنافس للطلاء على أجار سكر العنب Sabouraud مع حمض اللبنيك 0.4٪.
    ملاحظة: استخدم الخنافس مع الفطريات والكونيديا للطلاء على الفور (دون وضعها في غرف الرطوبة).
  3. عزل البكتيريا من الجثث مع أعراض التحلل البكتيري.
  4. قطع رأس خنفساء ، والضغط على المحتويات الداخلية ، وجمعها في أنابيب للطلاء اللاحق على الوسائط للبكتيريا (لوريا بيرتاني أجار ، إندو أجار ، وأجار إسكولين الصفراوي).
    ملاحظة: استخدم الفحص المجهري والطرق الجزيئية لتحديد أجناس وأنواع مسببات الأمراض. إذا لزم الأمر ، يمكن إجراء تحليل لوجود طفيليات أخرى.

النتائج

تظهر النتائج أدناه حول CPBs الشتوية درجة حرارة التربة والبقاء على قيد الحياة والالتهابات.

ديناميات درجة حرارة التربة.
تم تسجيل درجات حرارة أقل من الصفر في الأقفاص على عمق 30 سم من نهاية نوفمبر إلى بداية أبريل (الشكل 1). كان متوسط درجة الحرارة خلال هذه ?...

Discussion

توضح هذه الدراسة أن الطريقة المقترحة لدراسة فصل الشتاء من CPBs تمكننا من الحصول على عدد كاف من الحشرات في فترات مختلفة من السبات. يعتمد نجاح التقنية المقدمة على عدة عوامل مستقلة ، أهمها الظروف الجوية. في فصل الشتاء البارد الخالي من الثلوج ، قد تتجمد التربة إلى عمق القفص بالكامل. في هذه الحالة...

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه لا توجد مصالح متنافسة.

Acknowledgements

نشكر زملائنا فلاديمير شيلو وفيرا موروزوف وأوليانا روتسكايا وأولغا بولينوغوفا وأوكسانا توميلوفا على مساعدتهم في تنظيم وتنفيذ الإجراءات الميدانية والمختبرية.

تم دعم البحث من قبل مؤسسة العلوم الروسية ، المشروع رقم 22-14-00309.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Agar-agar bacteriological purifieddiaGene1806.5000
Bile Esculin AgarHiMediaM972
Endo Agar HiMediaM029
Glucose monohydrate-DPanReac Applichem143140.1000Φ
Lactic acid PanReac Applichem141034.1211
Luria-Bertani liquid mediumHiMediaG009
15 ml conical centrifuge tubesAxygenSCT-15ML-25-S
PeptoneFBIS SRCAMBMfigure-materials-665030/O61
Phosphate buffered salineMedigenPBS500
Temperatutre and humidity datalogger Ecklerk-M-11RelsibWaterproof datalogger

References

  1. Alyokhin, A., Benkovskaya, G., Udalov, M. Colorado potato beetle. Insect Pests of Potato. , 29-43 (2022).
  2. Alyokhin, A., Kryukov, V. Ecology of a potato field. Insect Pests of Potato. , 451-462 (2022).
  3. Lee Jr, R. E., Costanzo, J. P., Kaufman, P. E., Lee, M. R., Wyman, J. A. Ice-nucleating active bacteria reduce the cold-hardiness of the freeze-intolerant Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 87 (2), 377-381 (1994).
  4. Ushatinskaja, R. S. Diapause of insects and its modifications. Journal of General Biology. 34, 194-215 (1973).
  5. Zheng, X. L., et al. Effect of soil moisture on overwintering pupae in Spodopteraexigua (Lepidoptera: Noctuidae). Applied Entomology and Zoology. 48, 365-371 (2013).
  6. Hiiesaar, K., Metspalu, L., Jõudu, J., Jõgar, K. Over-wintering of the Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata Say) in field conditions and factors affecting its population density in Estonia. Agronomy Research. 4 (1), 21-30 (2006).
  7. Yocum, G. D., Rinehart, J. P., Chirumamilla-Chapara, A., Larson, M. L. Characterization of gene expression patterns during the initiation and maintenance phases of diapause in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Journal of Insect Physiology. 55 (1), 32-39 (2009).
  8. Yocum, G. D., Buckner, J. S., Fatland, C. L. A comparison of internal and external lipids of nondiapausing and diapause initiation phase adult Colorado potato beetles, Leptinotarsa decemlineata. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 159 (3), 163-170 (2011).
  9. Nikonorov, Y. M., Syrtlanova, L. A., Kitaev, K. A., Benkovskaya, G. V. Transcription activity of genes involved in diapause regulation in the Colorado Potato beetle and its change under a fipronil impact. Russian Journal of Genetics: Applied Research. 8, 80-86 (2018).
  10. Govaere, L., et al. Transcriptome and proteome analyses to investigate the molecular underpinnings of cold response in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Cryobiology. 88, 54-63 (2019).
  11. Lehmann, P., Westberg, M., Tang, P., Lindström, L., Käkelä, R. The diapause lipidomes of three closely related beetle species reveal mechanisms for tolerating energetic and cold stress in high-latitude seasonal environments. Frontiers in Physiology. 11, 576617 (2020).
  12. Lebenzon, J. E., Torson, A. S., Sinclair, B. J. Diapause differentially modulates the transcriptomes of fat body and flight muscle in the Colorado potato beetle. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 40, 100906 (2021).
  13. Lashomb, J. H., Ng, Y. S., Ghidiu, G., Green, E. Description of spring emergence by the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Say) (Coleoptera: Chrysomelidae), in New Jersey. Environmental entomology. 13 (3), 907-910 (1984).
  14. Cantwell, G. E., Cantelo, W. W., Schroder, R. F. Effect of Beauveria bassiana on underground stages of the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae). The Great Lakes Entomologist. 19 (2), 6 (1986).
  15. Fedorko, A., Bajan, C., Kmitowa, K., Wojciehowska, M. Effectiveness of the use of selected microorganisms to control the Colorado beetle during hibernation. Ecological Studies. 3 (2), 127-134 (1977).
  16. Gaugler, R., Costa, S. D., Lashomb, J. Stability and efficacy of Beauveria bassiana soil inoculations. Environmental Entomology. 18 (3), 412-417 (1989).
  17. Bajan, C., Kmitowa, K. Contribution of entomopathogenic fungi to the natural winter reduction of Colorado beetle adults. Polish Ecological Studies. 3 (2), 107-114 (1977).
  18. Milner, M., Kung, K. S., Wyman, J. A., Feldman, J., Nordheim, E. Enhancing overwintering mortality of Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) by manipulating the temperature of its diapause habitat. Journal of Economic Entomology. 85 (5), 1701-1708 (1992).
  19. Doğan, C., et al. Characterization of calcium signaling proteins from the fat body of the Colorado Potato Beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae): Implications for diapause and lipid metabolism. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 133, 103549 (2021).
  20. Benkovskaya, G. V., Udalov, M. B. Colorado potato beetle investigations in the south Urals. Nova Science Publishers. , (2011).
  21. Short, C. A., Hahn, D. A. Fat enough for the winter? Does nutritional status affect diapause. Journal of Insect Physiology. , 104488 (2023).
  22. McDonald, J. R., Bale, J. S., Walters, K. F. A. Low-temperature mortality and overwintering of the western flower thrips Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae). Bulletin of Entomological Research. 87 (5), 497-505 (1997).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved