Uno studio sperimentale sull'ibernazione del coleottero della patata del Colorado in condizioni naturali

Riepilogo

Qui presentiamo un metodo per studiare il letargo del coleottero della patata Colorado nelle condizioni naturali della zona temperata, nonché una tecnica per la raccolta dei coleotteri in inverno. Questo metodo consente di ottenere un numero desiderato di individui svernanti per varie analisi in qualsiasi fase del letargo.

Abstract

Uno dei principali parassiti della patata Solanum tuberosum L. nella zona temperata è l'insetto scarabeo della patata del Colorado (CPB). La maggior parte degli studi sull'immunità e sulle malattie del CPB sono condotti durante le fasi di alimentazione attiva. Tuttavia, ci sono meno studi sulle fasi di riposo, anche se questi coleotteri trascorrono la maggior parte del loro ciclo vitale in uno stato di diapausa invernale (letargo). In questo lavoro è stato sviluppato e testato un metodo per studiare l'ibernazione CPB in condizioni naturali, offrendo l'opportunità di raccogliere un numero sufficiente di individui in inverno. In questo articolo è stata valutata la sopravvivenza al CPB e sono stati identificati gli agenti infettivi in diverse fasi di ibernazione. La mortalità per CPB è aumentata durante il letargo, raggiungendo un massimo in aprile-maggio. Funghi entomopatogeni (Beauveria, Isaria e Lecanicillium) e batteri Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas e Serratia sono stati isolati dagli insetti morti. Il tasso di sopravvivenza dei coleotteri per l'intero periodo di ibernazione è stato del 61%. Non sono stati trovati coleotteri congelati o essiccati, il che indica il successo del metodo presentato.

Introduzione

Il coleottero della patata del Colorado Leptinotarsa decemlineata Say (CPB) è un importante parassita delle piante di Solanaceae, prevalentemente Solanum tuberosum L. L'areale geografico di questa specie è di oltre 16 milioni di^km2 e si espande costantemente¹. Il CPB ha una diapausa invernale facoltativa e il letargo è obbligatorio nella zona temperata. La diapausa è indotta da un fotoperiodo a giorno corto e modulata dalla temperatura¹. Questi coleotteri svernano allo stadio adulto scavando nel terreno. Con l'aumentare delle latitudini, la durata del periodo di ibernazione si allunga. Nella zona temperata, soprattutto nei territori settentrionali del suo areale, lo svernamento dura fino a 9 mesi: da agosto-settembre a maggio-giugno (Noskov et al., osservazioni personali). Durante questo periodo, il CPB – proprio come qualsiasi altro insetto della zona temperata – è esposto a condizioni invernali sfavorevoli e deve aumentare la sua tolleranza al freddo. Allo stesso tempo, il contatto dei coleotteri con il suolo aumenta il rischio di infezione da parte di vari microrganismi opportunisti e patogeni². Pertanto, questi coleotteri hanno bisogno di mantenere un certo livello di attività del sistema immunitario durante il letargo, che è anche energeticamente costoso. Tuttavia, anche se l'insetto sopravvive a un'infezione, la malattia può ridurre la sua resistenza al freddo³. Va notato che la bassa temperatura non è l'unica ragione della mortalità invernale del CPB. Un ruolo importante è svolto anche dalla mancanza di ossigeno e, in alcune condizioni, potrebbe essere il principale fattore di mortalità invernale ^4,5.

È noto che la mortalità invernale naturale del CPB può essere molto elevata, raggiungendo il 100% nei terreni franco-argillosi⁶. Pertanto, lo svernamento è uno dei periodi più cruciali nel ciclo di vita del CPB. Tuttavia, i dati sulla fisiologia, l'attività del sistema immunitario, la sopravvivenza e altri parametri dell'ibernazione CPB in condizioni naturali sono ancora limitati. Sono presenti studi sull'espressione genica differenziale e su vari parametri fisiologici negli adulti CPB durante la diapausa e in risposta allo shock da freddo 7,8,9,10,11,12; Tuttavia, queste analisi sono state effettuate principalmente mediante induzione di diapausa o stress da freddo in condizioni di laboratorio senza fluttuazioni naturali di temperatura, umidità e carico patogeno nativo. Ciononostante, la ricerca sulla fisiologia di questi coleotteri raccolti mediante scavo dal suolo in condizioni naturali è importante. Diversi aspetti dello svernamento del CPB in condizioni naturali sono stati attivamente studiati negli anni 1970-1980 ^{13,14,15,16,17,18}. D'altra parte, questi studi non hanno comportato lo scavo di CPB dal suolo in inverno. Inoltre, non vengono fornite in dettaglio una tecnica per l'ibernazione controllata del CPB e una descrizione delle gabbie. Pertanto, è necessaria un'indagine sulla fisiologia dei CPB che svernano in ambienti naturali¹⁹.

Lo scopo di questo studio è stato quello di sviluppare e testare un metodo per l'ibernazione controllata degli adulti CPB in condizioni naturali. Il metodo proposto consente di ottenere un numero desiderato di individui CPB per saggi microbiologici, immunologici e di altro tipo durante l'ibernazione in condizioni di campo di un clima continentale. Questo metodo può essere adattato e applicato ad altre specie di insetti che svernano nel terreno sotto la neve.

Protocollo

1. Descrizione delle gabbie per il letargo

NOTA: A seconda degli obiettivi dell'esperimento, il numero di gabbie varia. Utilizzare almeno tre gabbie per data di campionamento. Per stimare il numero di coleotteri che emergeranno, prepara almeno tre gabbie aggiuntive, che non verranno estratte dal terreno fino alla primavera.

1. Utilizzare gabbie costituite da un telaio rigido in legno con dimensioni di 25 × 25 × 40 cm (L × P × H).
2. Per costruire un telaio per la gabbia, utilizzare doghe di legno di almeno 2 cm di spessore e 4 cm di larghezza.
3. Coprire l'interno della gabbia con una rete in acciaio inossidabile avente una dimensione di aperture non superiore a 5 mm × 3 mm. Usa una cucitrice per legno per fissare la rete.
4. Fissare la rete in acciaio inossidabile all'esterno del fondo con la cucitrice.
5. Rivestire l'interno della gabbia con un geotessile sintetico nero con una densità di 60 g/m².
   NOTA: Il geotessile funge da barriera aggiuntiva per impedire la fuga dei coleotteri. Non utilizzarlo in esperimenti relativi a entomopatogeni e parassitoidi in movimento attivo.
6. Fissare saldamente un tubo di tessuto sintetico traslucido e traspirante alto circa 60 cm alla parte superiore della gabbia.
7. Incrociare e fissare due robuste corde al fondo della gabbia per estrarla dal terreno quando necessario.

2. Installazione delle gabbie

1. Scava una buca profonda 40 cm nel terreno e posiziona la gabbia all'interno.
2. Stendere erba secca o fieno sulla buca.
3. Posiziona la gabbia all'interno in modo che il fieno o l'erba secca si trovino tra le pareti della gabbia e il terreno.
4. Riempi le gabbie con il terreno dello stesso campo di patate in cui vengono raccolti gli insetti.
5. Installare data logger di temperatura e umidità impermeabili nelle gabbie alle profondità richieste.
   NOTA: È possibile utilizzare data logger di qualsiasi produttore e devono essere in grado di funzionare a basse temperature.
6. Piantare piantine di patate all'interno di ogni gabbia 3-4 settimane prima dell'introduzione dei coleotteri e annaffiarle moderatamente.
7. Fissare verticalmente un tubo di tessuto sintetico a un bastoncino di qualsiasi materiale installato all'esterno della gabbia.

3. Allevamento di insetti prima dello svernamento

1. Raccogli manualmente i coleotteri adulti nei campi di patate privi di pesticidi verso la fine della vegetazione delle patate.
   NOTA: I coleotteri adulti differiscono sostanzialmente dalle larve e sono caratterizzati da elitre striate, mentre le larve sono rosse.
2. Conservare i coleotteri raccolti in secchi di plastica da 15-20 L (max 200 individui per secchio) contenenti cime di patate per nutrire gli insetti prima di metterli nelle gabbie.
3. Copri i secchi con tessuto traspirante.
   NOTA: Non tenere gli insetti nei secchi per più di 12 ore. Usa cime di patate abbastanza grandi per evitare l'accumulo di coleotteri sul fondo dei secchi.
4. Posiziona non più di 200 individui CPB sulle piante di patate coperte con la rete di tessuto sintetico.
5. Quando le cime di patate sono consumate, aggiungi quelle fresche messe in un barattolo di plastica contenente acqua e cambia le cime di patate ogni giorno.
   NOTA: Per fissare i gambi in un barattolo, utilizzare un batuffolo di cotone e un parafilm. Controlla attentamente i vecchi steli per i coleotteri quando li rimuovi.
6. Una volta che tutti i coleotteri sono stati scavati nel terreno per lo svernamento, slega il tubo di tessuto sintetico dal bastoncino e stendi il tessuto.

4. Raccolta di insetti durante la stagione invernale

1. Rimuovere la neve sopra la superficie della gabbia.
2. Allentare la gabbia su ciascun lato con una pala robusta.
3. Estrarre la gabbia dal terreno usando le corde.
4. Porta la gabbia in laboratorio.
   NOTA: A seconda degli obiettivi dell'esperimento, potrebbe essere necessario che i coleotteri in letargo siano inattivi prima dell'analisi. In questo caso, la temperatura in laboratorio durante l'isolamento dei coleotteri dal suolo dovrebbe essere di ~2-5 °C.
5. Rimuovi il terreno dalla scatola in piccole porzioni, rompi con cura grandi pezzi di terra e isola i coleotteri usando una pinzetta.
6. Separare i coleotteri vivi dai cadaveri. I coleotteri vivi e sani creano un terreno compatto intorno a loro, formando una cavità d'aria (una cosiddetta culla) e sono, quindi, facilmente separabili dal suolo. I coleotteri uccisi dai funghi sono mummificati o hanno micelio visibile sulla superficie. Gli insetti che si decompongono battericamente sono scuri.
7. Setacciare il terreno attraverso un setaccio per assicurarsi che tutti i coleotteri siano isolati e non danneggiati.
8. Collocare i cadaveri con sintomi di infezione fungina o decomposizione batterica in una provetta da centrifuga sterile individuale da 15 mL per una futura identificazione.
9. Conservare i coleotteri vivi in frigorifero a una temperatura di 0-2 °C fino all'analisi in un contenitore chiuso e ventilato contenente un batuffolo di cotone umido.

5. Preparazione di campioni di organi e tessuti

1. Per raccogliere l'emolinfa, praticare una puntura nella parte laterale dell'addome sotto le elitre utilizzando un ago da insulina.
   NOTA: Durante lo svernamento, la quantità di emolinfa è significativamente ridotta, il che rende difficile la raccolta di questo liquido.
2. Per isolare l'intestino, tagliare la capsula della testa, spremere tutto il contenuto in una capsula di Petri con tampone fosfato, separare l'intestino e pulirlo dal grasso e dai vasi malpighiani.
3. Separa una sezione desiderata dell'intestino, come l'intestino anteriore, l'intestino medio o l'intestino posteriore.
4. Per isolare il corpo adiposo, separarlo dagli altri tessuti dopo l'isolamento dell'intestino.
   NOTA: I tessuti isolati possono essere utilizzati per misurare l'attività degli enzimi antiossidanti e disintossicanti (un esempio: Figura 1 supplementare), l'analisi della regolazione dei geni della via di segnalazione immunitaria (un esempio: Figura 2 supplementare) o il metabarcoding del contenuto intestinale degli insetti, ecc.

6. Isolamento dei microrganismi dai cadaveri

1. Per isolare i funghi entomopatogeni dai cadaveri, mettere gli insetti mummificati in una camera di umidità sterile.
2. Utilizzare i conidi aerei (se disponibili) o gli sclerozi del contenuto interno dei coleotteri per la placcatura su agar destrosio Sabouraud con acido lattico allo 0,4%.
   NOTA: Utilizzare coleotteri con micelio e conidi per la placcatura immediata (senza metterli in camere di umidità).
3. Isolare i batteri dai cadaveri con sintomi di decomposizione batterica.
4. Tagliare la testa di uno scarabeo, spremere il contenuto interno e raccoglierlo in tubi per la successiva placcatura su terreni per batteri (agar Luria-Bertani, agar endo e agar esculina biliare).
   NOTA: Utilizzare la microscopia e i metodi molecolari per identificare i generi e le specie dei patogeni. Se necessario, può essere eseguita un'analisi per la presenza di altri parassiti.

Risultati

I risultati riportati di seguito sui CPB svernanti mostrano la temperatura del suolo, la sopravvivenza e le infezioni.

Dinamica della temperatura del suolo.
Temperature sotto lo zero nelle gabbie a una profondità di 30 cm sono state registrate dalla fine di novembre all'inizio di aprile (Figura 1). La temperatura media durante questo periodo è stata di -3,3 ± 0,1 °C (errore medio ± standard). La temperatura più bassa registrata è stata d...

Discussione

Questo studio dimostra che il metodo proposto per studiare lo svernamento dei CPB ci permette di ottenere un numero sufficiente di insetti in diversi periodi di letargo. Il successo della tecnica presentata dipende da diversi fattori indipendenti, il più importante dei quali sono le condizioni meteorologiche. In un inverno freddo e senza neve, il terreno può congelare fino all'intera profondità della gabbia. In questo caso, il rischio di morte di tutti i coleotteri aumenta significativamente¹⁸....

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-agar bacteriological purified	diaGene	1806.5000
Bile Esculin Agar	HiMedia	M972
Endo Agar	HiMedia	M029
Glucose monohydrate-D	PanReac Applichem	143140.1000Φ
Lactic acid	PanReac Applichem	141034.1211
Luria-Bertani liquid medium	HiMedia	G009
15 ml conical centrifuge tubes	Axygen	SCT-15ML-25-S
Peptone	FBIS SRCAMB	M030/O61
Phosphate buffered saline	Medigen	PBS500
Temperatutre and humidity datalogger Ecklerk-M-11	Relsib		Waterproof datalogger