JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, ılıman bölgenin doğal koşulları altında Colorado patates böceği hazırda bekletme modunu incelemek için bir yöntem ve kışın böcek toplama tekniği sunuyoruz. Bu yöntem, hazırda bekletme modunun herhangi bir aşamasında çeşitli analizler için istenen sayıda kışlayan bireyin elde edilmesini sağlar.

Özet

Ilıman bölgedeki patates Solanum tuberosum L.'nin en büyük zararlılarından biri, Colorado patates böceği (CPB) böceğidir. CPB'nin bağışıklığı ve hastalıkları ile ilgili çalışmaların çoğu aktif beslenme aşamalarında yapılır. Bununla birlikte, bu böcekler yaşam döngülerinin çoğunu kış diyapozu (kış uykusu) durumunda geçirmelerine rağmen, dinlenme aşamaları hakkında daha az çalışma vardır. Bu çalışmada, doğal koşullar altında CPB hazırda bekletme modunu araştırmak için bir yöntem geliştirildi ve test edildi ve kışın yeterli sayıda birey toplama fırsatı sunuldu. Bu makalede, KPB sağkalımı değerlendirildi ve farklı hiberasyon evrelerindeki enfeksiyöz ajanlar tanımlandı. CPB mortalitesi kış uykusu sırasında artarak Nisan-Mayıs aylarında maksimuma ulaştı. Ölü böceklerden entomopatojenik mantarlar (Beauveria, Isaria ve Lecanicillium) ve bakteriler Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas ve Serratia izole edildi. Böceklerin tüm kış uykusu süresi boyunca hayatta kalma oranı% 61 idi. Sunulan yöntemin başarısını gösteren donmuş veya kurutulmuş böcek bulunamadı.

Giriş

Colorado patates böceği Leptinotarsa decemlineata Say (CPB), ağırlıklı olarak patates Solanum tuberosum L olmak üzere Solanaceae bitkilerinin önemli bir zararlısıdır. Bu türün coğrafi aralığı 16 milyonkm2'den fazladır ve sürekli genişler1. CPB'nin fakültatif kış diyapozu vardır ve ılıman bölgede kış uykusu zorunludur. Diyapoz, kısa günlük bir fotoperiyot ile indüklenir ve sıcaklık1 ile modüle edilir. Bu böcekler yetişkin aşamasında toprağa girerek kışı geçirirler. Artan enlemlerle, hazırda bekletme süresinin süresi uzar. Ilıman bölgede, özellikle menzilinin kuzey bölgelerinde, kışlama 9 aya kadar sürer: Ağustos-Eylül'den Mayıs-Haziran'a kadar (Noskov ve diğerleri, kişisel gözlemler). Bu süre zarfında, CPB - tıpkı ılıman bölgedeki diğer böcekler gibi - elverişsiz kış koşullarına maruz kalır ve soğuğa toleransını arttırmalıdır. Aynı zamanda, böceklerin toprakla teması, çeşitli fırsatçı ve patojenik mikroorganizmalar tarafından enfeksiyon riskini arttırır2. Bu nedenle, bu böceklerin kış uykusu sırasında belirli bir bağışıklık sistemi aktivitesini sürdürmeleri gerekir ve bu da enerjik olarak maliyetlidir. Bununla birlikte, böcek bir enfeksiyondan kurtulsa bile, hastalık soğuğa dayanıklılığını azaltabilir3. Düşük sıcaklığın, CPB'nin kış mortalitesinin tek nedeni olmadığı unutulmamalıdır. Oksijen eksikliği de önemli bir rol oynar ve bazı koşullar altında kış ölümlerinin ana faktörü olabilir 4,5.

CPB'nin doğal kış ölüm oranının çok yüksek olabileceği ve killi tınlı topraklarda% 100'e ulaşabileceğibilinmektedir 6. Bu nedenle, kışlama, CPB yaşam döngüsündeki en önemli dönemlerden biridir. Bununla birlikte, doğal koşullar altında CPB hazırda bekletmenin fizyolojisi, bağışıklık sistemi aktivitesi, sağkalımı ve diğer parametreleri hakkındaki veriler hala sınırlıdır. CPB erişkinlerinde diyapoz sırasında ve soğuk şokuna yanıt olarak diferansiyel gen ekspresyonu ve çeşitli fizyolojik parametreler üzerine çalışmalar vardır 7,8,9,10,11,12; Bununla birlikte, bu analizler esas olarak, sıcaklık, nem ve doğal patojen yükünde doğal dalgalanmalar olmaksızın laboratuvar koşullarında diyapoz veya soğuk stresinin indüklenmesiyle gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, doğal koşullar altında topraktan kazı yoluyla toplanan bu böceklerin fizyolojisi üzerine araştırmalar önemlidir. 1970'ler-1980'lerdedoğal koşullar altında kışlamanın farklı yönleri aktif olarak incelenmiştir 13,14,15,16,17,18. Öte yandan, bu çalışmalarda kışın topraktan CPB kazısı yapılmamıştır. Ek olarak, CPB'nin kontrollü hazırda bekletme modu için bir teknik ve kafeslerin bir açıklaması ayrıntılı olarak sağlanmamıştır. Bu nedenle, doğal ortamlarda kışlayan CPB'lerin fizyolojisinin araştırılmasına ihtiyaç vardır19.

Bu çalışmanın amacı, KPB erginlerinin doğal koşullar altında kontrollü kış uykusuna yatması için bir yöntem geliştirmek ve test etmektir. Önerilen yöntem, karasal iklimin tarla koşulları altında kış uykusu sırasında mikrobiyolojik, immünolojik ve diğer tahliller için istenen sayıda CPB bireyinin elde edilmesine izin verir. Bu yöntem, kar altında toprakta kışı geçiren diğer böcek türlerine uyarlanabilir ve uygulanabilir.

Protokol

1. Hazırda bekletme kafeslerinin tanımı

NOT: Deneyin amaçlarına bağlı olarak kafes sayısı değişmektedir. Numune alma tarihi başına en az üç kafes kullanın. Ortaya çıkacak böcek sayısını tahmin etmek için, ilkbahara kadar topraktan çıkarılmayacak en az üç ek kafes hazırlayın.

  1. 25 × 25 × 40 cm (U × G × Y) boyutlarında sert ahşap çerçeveden yapılmış kafesler kullanın.
  2. Kafes için bir çerçeve oluşturmak için en az 2 cm kalınlığında ve 4 cm genişliğinde ahşap çıtalar kullanın.
  3. Kafesin içini, 5 mm × 3 mm'den büyük olmayan açıklıklara sahip paslanmaz çelik bir ağ ile örtün. Ağı sabitlemek için ahşap zımba kullanın.
  4. Paslanmaz çelik ağı zımba ile tabanın dışına sabitleyin.
  5. Kafesin içini 60 g/m2 yoğunluğa sahip siyah sentetik bir jeotekstil ile hizalayın.
    NOT: Geotekstil, böceklerin kaçmasını önlemek için ek bir bariyer görevi görür. Aktif olarak hareket eden entomopatojenler ve parazitoidlerle ilgili deneylerde kullanmayın.
  6. Kafesin üst kısmına yaklaşık 60 cm yüksekliğinde sentetik yarı saydam nefes alabilen bir kumaş tüpünü sıkıca takın.
  7. Gerektiğinde topraktan çıkarmak için iki güçlü ipi kafesin dibine çaprazlayın ve sabitleyin.

2. Kafeslerin montajı

  1. Toprağa 40 cm derinliğinde bir çukur kazın ve kafesi içine yerleştirin.
  2. Deliğin üzerine kuru ot veya saman koyun.
  3. Kafesi, saman veya kuru ot kafesin duvarları ile toprak arasında olacak şekilde yerleştirin.
  4. Kafesleri, böceklerin toplandığı aynı patates tarlasından toprakla doldurun.
  5. Su geçirmez sıcaklık ve nem dataloggerlarını kafeslere gerekli derinliklerde monte edin.
    NOT: Herhangi bir üreticinin veri kaydedicileri kullanılabilir ve düşük sıcaklıklarda çalışabilmelidir.
  6. Böceklerin girişinden 3-4 hafta önce her kafesin içine patates fideleri dikin ve orta derecede sulayın.
  7. Bir sentetik kumaş tüpünü, kafesin dışına monte edilmiş herhangi bir malzemeden bir çubuğa dikey olarak sabitleyin.

3. Kışlamadan önce böceklerin yetiştirilmesi

  1. Patates bitki örtüsünün sonuna doğru pestisit içermeyen patates tarlalarında yetişkin böcekleri elle toplayın.
    NOT: Yetişkin böcekler larvalardan önemli ölçüde farklıdır ve çizgili elytra ile karakterize edilirken, larvalar kırmızıdır.
  2. Toplanan böcekleri kafeslere yerleştirmeden önce böcekleri beslemek için patates üstleri içeren 15-20 L'lik plastik kovalarda (kova başına en fazla 200 kişi) saklayın.
  3. Kovaları nefes alabilen kumaşla örtün.
    NOT: Böcekleri kovalarda 12 saatten fazla tutmayın. Kovaların dibinde böcek birikmesini önlemek için yeterince büyük patates üstleri kullanın.
  4. Sentetik kumaş ağ ile kaplı patates bitkilerinin üzerine 200'den fazla CPB bireyi yerleştirmeyin.
  5. Patates üstleri tüketildiğinde, su içeren plastik bir kavanoza yerleştirilmiş taze olanları ekleyin ve daha sonra patates üstlerini günlük olarak değiştirin.
    NOT: Sapları bir kavanoza sabitlemek için pamuk yünü ve parafilm kullanın. Böcekleri çıkarırken eski sapları dikkatlice kontrol edin.
  6. Tüm böcekler kışlama için toprağa gömüldükten sonra, sentetik kumaş tüpünü çubuktan çözün ve kumaşı yere koyun.

4. Kış mevsiminde böceklerin toplanması

  1. Kafes yüzeyinin üzerindeki karı temizleyin.
  2. Kafesi her iki taraftan güçlü bir kürekle gevşetin.
  3. Halatları kullanarak kafesi topraktan dışarı çekin.
  4. Kafesi laboratuvara getirin.
    NOT: Deneyin amaçlarına bağlı olarak, kış uykusundaki böceklerin analizden önce inaktif olması gerekebilir. Bu durumda böceklerin topraktan izolasyonu sırasında laboratuvardaki sıcaklık ~2-5 °C olmalıdır.
  5. Toprağı kutudan küçük porsiyonlarda çıkarın, büyük toprak parçalarını dikkatlice parçalayın ve cımbız kullanarak böcekleri izole edin.
  6. Canlı böcekleri kadavralardan ayırın. Canlı sağlıklı böcekler, etraflarında kompakt bir toprak oluşturarak bir hava boşluğu (beşik olarak adlandırılır) oluşturur ve bu nedenle topraktan kolayca ayrılır. Mantarlar tarafından öldürülen böcekler mumyalanır veya yüzeyde görünür miselyum bulunur. Bakteriyel olarak ayrışan böcekler karanlıktır.
  7. Tüm böceklerin izole edildiğinden ve zarar görmediğinden emin olmak için toprağı bir elek ile eleyin.
  8. Mantar enfeksiyonu veya bakteriyel ayrışma semptomları olan kadavraları, ileride tanımlamak için ayrı bir steril 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.
  9. Canlı böcekleri, nemli bir pamuk topu içeren kapalı havalandırılan bir kapta analize kadar 0-2 °C sıcaklıktaki bir buzdolabında saklayın.

5. Organ ve doku örneklerinin hazırlanması

  1. Hemolenf toplamak için, bir insülin iğnesi kullanarak elytra altında karnın lateral kısmında bir delik açın.
    NOT: Kışlama sırasında, hemolenf miktarı önemli ölçüde azalır ve bu da bu sıvının toplanmasını zorlaştırır.
  2. Bağırsakları izole etmek için kafa kapsülünü kesin, tüm içeriği fosfat tamponlu bir Petri kabına sıkın, bağırsağı ayırın ve yağ ve Malpighian damarlarından arındırın.
  3. Ön bağırsak, orta bağırsak veya arka bağırsak gibi bağırsağın istenen bir bölümünü ayırın.
  4. Yağ gövdesini izole etmek için, bağırsağın izolasyonundan sonra diğer dokulardan ayırın.
    NOT: İzole edilen dokular, antioksidan ve detoksifiye edici enzimlerin aktivitesini ölçmek için kullanılabilir (bir örnek: Ek Şekil 1), bağışıklık sinyal yolu genlerinin düzenlenmesinin analizi (bir örnek: Ek Şekil 2) veya böcek bağırsak içeriğinin metabarkodlaması vb.

6. Kadavralardan mikroorganizmaların izolasyonu

  1. Entomopatojenik mantarları kadavralardan izole etmek için mumyalanmış böcekleri steril bir nem odasına koyun.
  2. % 0.4 laktik asit ile Sabouraud dekstroz agar üzerine kaplama için böceklerin iç içeriğinden hava conidia (varsa) veya sklerotia kullanın.
    NOT: Hemen kaplamak için miselyum ve conidia içeren böcekleri kullanın (nem odalarına koymadan).
  3. Bakteriyel ayrışma belirtileri olan kadavralardan bakterileri izole edin.
  4. Bir böceğin kafasını kesin, iç içeriğini sıkın ve daha sonra bakteri (Luria-Bertani agar, endo agar ve safra esculin agar) için ortam üzerine kaplama yapmak üzere tüplere toplayın.
    NOT: Patojenlerin cinslerini ve türlerini tanımlamak için mikroskopi ve moleküler yöntemler kullanın. Gerekirse, diğer parazitlerin varlığı için bir analiz yapılabilir.

Sonuçlar

Kışlayan CPB'lerle ilgili aşağıdaki sonuçlar toprak sıcaklığını, hayatta kalmayı ve enfeksiyonları göstermektedir.

Toprak sıcaklığı dinamiği.
Kasım ayının sonundan Nisan ayının başına kadar 30 cm derinlikteki kafeslerde sıfırın altındaki sıcaklıklar kaydedilmiştir (Şekil 1). Bu dönemde ortalama sıcaklık eksi 3,3 ± 0,1 °C idi (standart hata ±). Kaydedilen en düşük sıcaklık Şubat ortasında eksi 7,9 ?...

Tartışmalar

Bu çalışma, CPB'lerin kışlamasını incelemek için önerilen yöntemin, farklı kış uykusu dönemlerinde yeterli sayıda böcek elde etmemizi sağladığını göstermektedir. Sunulan tekniğin başarısı, en önemlisi hava koşulları olan birkaç bağımsız faktöre bağlıdır. Soğuk ve karsız bir kış aylarında, toprak kafesin tüm derinliğine kadar donabilir. Bu durumda, tüm böceklerin ölüm riski önemli ölçüde artar18. Böceğin hayatta kalması,yılda...

Açıklamalar

Yazarlar, çatışan çıkarların olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Meslektaşlarımız Vladimir Shilo, Vera Morozovа, Ulyana Rotskaya, Olga Polenogova ve Oksana Tomilova'ya saha ve laboratuvar prosedürlerinin düzenlenmesi ve yürütülmesindeki yardımları için teşekkür ederiz.

Araştırma, Rus Bilim Vakfı, proje No. 22-14-00309 tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Agar-agar bacteriological purifieddiaGene1806.5000
Bile Esculin AgarHiMediaM972
Endo Agar HiMediaM029
Glucose monohydrate-DPanReac Applichem143140.1000Φ
Lactic acid PanReac Applichem141034.1211
Luria-Bertani liquid mediumHiMediaG009
15 ml conical centrifuge tubesAxygenSCT-15ML-25-S
PeptoneFBIS SRCAMBMfigure-materials-665030/O61
Phosphate buffered salineMedigenPBS500
Temperatutre and humidity datalogger Ecklerk-M-11RelsibWaterproof datalogger

Referanslar

  1. Alyokhin, A., Benkovskaya, G., Udalov, M. Colorado potato beetle. Insect Pests of Potato. , 29-43 (2022).
  2. Alyokhin, A., Kryukov, V. Ecology of a potato field. Insect Pests of Potato. , 451-462 (2022).
  3. Lee Jr, R. E., Costanzo, J. P., Kaufman, P. E., Lee, M. R., Wyman, J. A. Ice-nucleating active bacteria reduce the cold-hardiness of the freeze-intolerant Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 87 (2), 377-381 (1994).
  4. Ushatinskaja, R. S. Diapause of insects and its modifications. Journal of General Biology. 34, 194-215 (1973).
  5. Zheng, X. L., et al. Effect of soil moisture on overwintering pupae in Spodopteraexigua (Lepidoptera: Noctuidae). Applied Entomology and Zoology. 48, 365-371 (2013).
  6. Hiiesaar, K., Metspalu, L., Jõudu, J., Jõgar, K. Over-wintering of the Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata Say) in field conditions and factors affecting its population density in Estonia. Agronomy Research. 4 (1), 21-30 (2006).
  7. Yocum, G. D., Rinehart, J. P., Chirumamilla-Chapara, A., Larson, M. L. Characterization of gene expression patterns during the initiation and maintenance phases of diapause in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Journal of Insect Physiology. 55 (1), 32-39 (2009).
  8. Yocum, G. D., Buckner, J. S., Fatland, C. L. A comparison of internal and external lipids of nondiapausing and diapause initiation phase adult Colorado potato beetles, Leptinotarsa decemlineata. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 159 (3), 163-170 (2011).
  9. Nikonorov, Y. M., Syrtlanova, L. A., Kitaev, K. A., Benkovskaya, G. V. Transcription activity of genes involved in diapause regulation in the Colorado Potato beetle and its change under a fipronil impact. Russian Journal of Genetics: Applied Research. 8, 80-86 (2018).
  10. Govaere, L., et al. Transcriptome and proteome analyses to investigate the molecular underpinnings of cold response in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Cryobiology. 88, 54-63 (2019).
  11. Lehmann, P., Westberg, M., Tang, P., Lindström, L., Käkelä, R. The diapause lipidomes of three closely related beetle species reveal mechanisms for tolerating energetic and cold stress in high-latitude seasonal environments. Frontiers in Physiology. 11, 576617 (2020).
  12. Lebenzon, J. E., Torson, A. S., Sinclair, B. J. Diapause differentially modulates the transcriptomes of fat body and flight muscle in the Colorado potato beetle. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 40, 100906 (2021).
  13. Lashomb, J. H., Ng, Y. S., Ghidiu, G., Green, E. Description of spring emergence by the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Say) (Coleoptera: Chrysomelidae), in New Jersey. Environmental entomology. 13 (3), 907-910 (1984).
  14. Cantwell, G. E., Cantelo, W. W., Schroder, R. F. Effect of Beauveria bassiana on underground stages of the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae). The Great Lakes Entomologist. 19 (2), 6 (1986).
  15. Fedorko, A., Bajan, C., Kmitowa, K., Wojciehowska, M. Effectiveness of the use of selected microorganisms to control the Colorado beetle during hibernation. Ecological Studies. 3 (2), 127-134 (1977).
  16. Gaugler, R., Costa, S. D., Lashomb, J. Stability and efficacy of Beauveria bassiana soil inoculations. Environmental Entomology. 18 (3), 412-417 (1989).
  17. Bajan, C., Kmitowa, K. Contribution of entomopathogenic fungi to the natural winter reduction of Colorado beetle adults. Polish Ecological Studies. 3 (2), 107-114 (1977).
  18. Milner, M., Kung, K. S., Wyman, J. A., Feldman, J., Nordheim, E. Enhancing overwintering mortality of Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) by manipulating the temperature of its diapause habitat. Journal of Economic Entomology. 85 (5), 1701-1708 (1992).
  19. Doğan, C., et al. Characterization of calcium signaling proteins from the fat body of the Colorado Potato Beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae): Implications for diapause and lipid metabolism. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 133, 103549 (2021).
  20. Benkovskaya, G. V., Udalov, M. B. Colorado potato beetle investigations in the south Urals. Nova Science Publishers. , (2011).
  21. Short, C. A., Hahn, D. A. Fat enough for the winter? Does nutritional status affect diapause. Journal of Insect Physiology. , 104488 (2023).
  22. McDonald, J. R., Bale, J. S., Walters, K. F. A. Low-temperature mortality and overwintering of the western flower thrips Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae). Bulletin of Entomological Research. 87 (5), 497-505 (1997).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır