Un estudio experimental sobre la hibernación del escarabajo de la papa de Colorado en condiciones naturales

Resumen

Aquí presentamos un método para estudiar la hibernación del escarabajo de la papa de Colorado en las condiciones naturales de la zona templada, así como una técnica para recolectar escarabajos en invierno. Este método permite obtener un número deseado de individuos invernantes para diversos análisis en cualquier etapa de la hibernación.

Resumen

Una de las principales plagas de la papa Solanum tuberosum L. en la zona templada es el insecto escarabajo de la papa de Colorado (CPB). La mayoría de los estudios sobre la inmunidad y las enfermedades de la CEC se realizan durante las etapas activas de alimentación. Sin embargo, hay menos estudios sobre las etapas de reposo, aunque estos escarabajos pasan la mayor parte de su ciclo de vida en un estado de diapausa invernal (hibernación). En este trabajo, se desarrolló y probó un método para investigar la hibernación de CPB en condiciones naturales, ofreciendo la oportunidad de recolectar un número suficiente de individuos en invierno. En este artículo se evaluó la supervivencia de la CEC y se identificaron agentes infecciosos en diferentes etapas de hibernación. La mortalidad por CEC aumentó durante la hibernación, alcanzando un máximo en abril-mayo. De los insectos muertos se aislaron hongos entomopatógenos (Beauveria, Isaria y Lecanicillium) y bacterias Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas y Serratia . La tasa de supervivencia de los escarabajos durante todo el período de hibernación fue del 61%. No se encontraron escarabajos congelados o disecados, lo que indica el éxito del método presentado.

Introducción

El escarabajo de la papa de Colorado Leptinotarsa decemlineata Say (CPB) es una plaga importante de las plantas de solanáceas, predominantemente de la papa Solanum tuberosum L. El área de distribución geográfica de esta especie es de más de 16 millones de^km2 y se expande constantemente¹. El CPB tiene diapausa invernal facultativa y la hibernación es obligatoria en la zona templada. La diapausa es inducida por un fotoperiodo de día corto y modulada por la temperatura¹. Estos escarabajos pasan el invierno en la etapa adulta excavando en el suelo. Con el aumento de las latitudes, la duración del período de hibernación se extiende. En la zona templada, especialmente en los territorios septentrionales de su área de distribución, la hibernación dura hasta 9 meses: desde agosto-septiembre hasta mayo-junio (Noskov et al., observaciones personales). Durante este período, el CPB, al igual que cualquier otro insecto en la zona templada, está expuesto a condiciones invernales desfavorables y debe aumentar su tolerancia al frío. Al mismo tiempo, el contacto de los escarabajos con el suelo aumenta el riesgo de infección por diversos microorganismos oportunistas y patógenos². Por lo tanto, estos escarabajos necesitan mantener un cierto nivel de actividad del sistema inmunológico durante la hibernación, lo que también es energéticamente costoso. No obstante, incluso si el insecto sobrevive a una infección, la enfermedad puede reducir su resistencia al^frío. Cabe señalar que la baja temperatura no es la única razón de mortalidad invernal de la CEC. La falta de oxígeno también juega un papel importante y, en algunas condiciones, podría ser el principal factor de mortalidad invernal ^4,5.

Se sabe que la mortalidad natural invernal del CPB puede ser muy alta, llegando al 100% en suelos franco arcillosos⁶. Por lo tanto, la hibernación es uno de los períodos más cruciales en el ciclo de vida del CPB. Sin embargo, los datos sobre la fisiología, la actividad del sistema inmunitario, la supervivencia y otros parámetros de la hibernación de la CEC en condiciones naturales siguen siendo limitados. Existen estudios sobre la expresión génica diferencial y diversos parámetros fisiológicos en adultos con CEC durante la diapausa y en respuesta al choque frío 7,8,9,10,11,12; Sin embargo, estos análisis se han llevado a cabo principalmente mediante la inducción de diapausa o estrés por frío en condiciones de laboratorio sin fluctuaciones naturales de temperatura, humedad y carga patógena nativa. No obstante, la investigación sobre la fisiología de estos escarabajos recolectados por excavación del suelo en condiciones naturales es importante. En las décadas de 1970 y 1980 se estudiaron activamente diferentes aspectos de la hibernación de la CPB en condiciones naturales 13,14,15,16,17,18. Por otro lado, estos estudios no involucraron la excavación de CPB del suelo en invierno. Además, no se proporciona en detalle una técnica para la hibernación controlada del CEC ni una descripción de las jaulas. Por lo tanto, es necesario investigar la fisiología de los CEC que hibernan en entornos naturales¹⁹.

El objetivo de este estudio fue desarrollar y probar un método para la hibernación controlada de adultos de CEC en condiciones naturales. El método propuesto permite obtener un número deseado de individuos de CEC para ensayos microbiológicos, inmunológicos y de otro tipo durante la hibernación en condiciones de campo de un clima continental. Este método se puede adaptar y aplicar a otras especies de insectos que pasan el invierno en suelos bajo la nieve.

Protocolo

1. Descripción de las jaulas para hibernación

NOTA: Dependiendo de los objetivos del experimento, el número de jaulas varía. Utilice al menos tres jaulas por fecha de muestreo. Para estimar la cantidad de escarabajos que emergerán, prepare al menos tres jaulas adicionales, que no se sacarán del suelo hasta la primavera.

1. Utilice jaulas hechas de un marco de madera rígido con un tamaño de 25 × 25 × 40 cm (largo × ancho × alto).
2. Para construir un marco para la jaula, use listones de madera de al menos 2 cm de grosor y 4 cm de ancho.
3. Cubra el interior de la jaula con una malla de acero inoxidable que tenga un tamaño de aberturas no mayor de 5 mm × 3 mm. Usa una grapadora de madera para fijar la malla.
4. Fije la malla de acero inoxidable al exterior de la parte inferior con la grapadora.
5. Forrar el interior de la jaula con un geotextil sintético negro con una densidad de 60 g/m².
   NOTA: El geotextil sirve como una barrera adicional para evitar el escape de los escarabajos. No lo use en experimentos relacionados con entomopatógenos y parasitoides en movimiento activo.
6. Sujete firmemente un tubo de tela sintética translúcida translúcida de aproximadamente 60 cm de altura a la parte superior de la jaula.
7. Cruza y fija dos cuerdas fuertes al fondo de la jaula para sacarla del suelo cuando sea necesario.

2. Instalación de las jaulas

1. Cava un hoyo de 40 cm de profundidad en el suelo y coloca la jaula dentro.
2. Coloque hierba seca o heno en el hoyo.
3. Coloque la jaula adentro de modo que el heno o la hierba seca queden entre las paredes de la jaula y el suelo.
4. Llene las jaulas con tierra del mismo campo de papas donde se recolectan los insectos.
5. Instale registradores de datos de temperatura y humedad a prueba de agua en las jaulas a las profundidades requeridas.
   NOTA: Se pueden utilizar registradores de datos de cualquier fabricante y deben poder funcionar a bajas temperaturas.
6. Plante plántulas de papa dentro de cada jaula 3-4 semanas antes de la introducción de los escarabajos y riéguelas moderadamente.
7. Fija un tubo de tela sintética verticalmente a un palo de cualquier material instalado en el exterior de la jaula.

3. Cría de insectos antes de la hibernación

1. Recoja manualmente los escarabajos adultos en los campos de papa libres de pesticidas hacia el final de la vegetación de papa.
   NOTA: Los escarabajos adultos difieren sustancialmente de las larvas y se caracterizan por élitros rayados, mientras que las larvas son rojas.
2. Mantenga los escarabajos recolectados en cubos de plástico de 15-20 L (200 individuos como máximo por cubo) que contengan puntas de patata para alimentar a los insectos antes de colocarlos en las jaulas.
3. Cubre los cubos con tela transpirable.
   NOTA: No guarde los insectos en cubos durante más de 12 h. Use puntas de papa lo suficientemente grandes para evitar la acumulación de escarabajos en el fondo de los baldes.
4. Coloque no más de 200 individuos de CPB en las plantas de papa cubiertas con la malla de tela sintética.
5. Cuando se consuman las puntas de las papas, agregue las frescas colocadas en un frasco de plástico que contenga agua y luego cambie las puntas de las papas diariamente.
   NOTA: Para fijar los tallos en un frasco, use algodón y parafilm. Revise cuidadosamente los tallos viejos en busca de escarabajos cuando los retire.
6. Una vez que todos los escarabajos estén enterrados en el suelo para pasar el invierno, desate el tubo de tela sintética del palo y coloque la tela en el suelo.

4. Recolección de insectos durante la temporada de invierno

1. Quita la nieve por encima de la superficie de la jaula.
2. Afloja la jaula a cada lado con una pala fuerte.
3. Saca la jaula de la tierra con las cuerdas.
4. Lleva la jaula al laboratorio.
   NOTA: Dependiendo de los objetivos del experimento, es posible que los escarabajos que hibernan tengan que estar inactivos antes del análisis. En este caso, la temperatura en el laboratorio durante el aislamiento de los escarabajos del suelo debe ser de ~2-5 °C.
5. Retire la tierra de la caja en porciones pequeñas, rompa con cuidado los trozos grandes de tierra y aísle a los escarabajos con pinzas.
6. Separe los escarabajos vivos de los cadáveres. Los escarabajos vivos y sanos crean un suelo compacto a su alrededor, formando una cavidad de aire (la llamada cuna) y, por lo tanto, se separan fácilmente del suelo. Los escarabajos muertos por hongos están momificados o tienen micelio visible en la superficie. Los insectos en descomposición bacteriana son oscuros.
7. Tamiza la tierra a través de un colador para asegurarte de que todos los escarabajos estén aislados y no dañados.
8. Coloque los cadáveres con síntomas de infección fúngica o descomposición bacteriana en un tubo de centrífuga estéril individual de 15 ml para su futura identificación.
9. Almacenar los escarabajos vivos en un refrigerador a una temperatura de 0-2 °C hasta su análisis en un recipiente cerrado y ventilado que contenga una bola de algodón húmeda.

5. Preparación de muestras de órganos y tejidos

1. Para recolectar la hemolinfa, haga una punción en la parte lateral del abdomen debajo de los élitros con una aguja de insulina.
   NOTA: Durante la hibernación, la cantidad de hemolinfa se reduce significativamente, lo que dificulta la recolección de este líquido.
2. Para aislar el intestino, corte la cápsula de la cabeza, exprima todo el contenido en una placa de Petri con tampón de fosfato, separe el intestino y límpielo de grasa y vasos de Malpighi.
3. Separe una sección deseada del intestino, como el intestino anterior, el intestino medio o el intestino posterior.
4. Para aislar el cuerpo graso, sepárelo de otros tejidos después del aislamiento del intestino.
   NOTA: Los tejidos aislados se pueden utilizar para medir la actividad de las enzimas antioxidantes y desintoxicantes (un ejemplo: Figura suplementaria 1), el análisis de la regulación de los genes de la vía de señalización inmunitaria (un ejemplo: Figura suplementaria 2) o el metabarcoding del contenido intestinal de los insectos, etc.

6. Aislamiento de microorganismos de los cadáveres

1. Para aislar los hongos entomopatógenos de los cadáveres, coloque los insectos momificados en una cámara de humedad estéril.
2. Utilice conidios aéreos (si están disponibles) o esclerocios del contenido interno de los escarabajos para colocar en agar dextrosa Sabouraud con ácido láctico al 0,4%.
   NOTA: Use escarabajos con micelio y conidios para enchapar inmediatamente (sin colocarlos en cámaras de humedad).
3. Aísle las bacterias de los cadáveres con síntomas de descomposición bacteriana.
4. Cortar la cabeza de un escarabajo, exprimir el contenido interno y recogerlo en tubos para su posterior colocación en medios para bacterias (agar Luria-Bertani, agar endo y agar esculina biliar).
   NOTA: Utilice microscopía y métodos moleculares para identificar géneros y especies de los patógenos. Si es necesario, se puede realizar un análisis para detectar la presencia de otros parásitos.

Resultados

Los siguientes resultados sobre los CPB que hibernan muestran la temperatura del suelo, la supervivencia y las infecciones.

Dinámica de la temperatura del suelo.
Se registraron temperaturas bajo cero en las jaulas a una profundidad de 30 cm desde finales de noviembre hasta principios de abril (Figura 1). La temperatura media durante este período fue de -3,3 ± 0,1 °C (media ± error estándar). La temperatura más baja registrada fue de -7,9...

Discusión

Este estudio muestra que el método propuesto para el estudio de la hibernación de los CPB permite obtener un número suficiente de insectos en diferentes períodos de hibernación. El éxito de la técnica presentada depende de varios factores independientes, el más importante de los cuales son las condiciones climáticas. En un invierno frío y sin nieve, el suelo puede congelarse hasta la profundidad total de la jaula. En este caso, el riesgo de muerte de todos los escarabajos aumenta significativamente

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-agar bacteriological purified	diaGene	1806.5000
Bile Esculin Agar	HiMedia	M972
Endo Agar	HiMedia	M029
Glucose monohydrate-D	PanReac Applichem	143140.1000Φ
Lactic acid	PanReac Applichem	141034.1211
Luria-Bertani liquid medium	HiMedia	G009
15 ml conical centrifuge tubes	Axygen	SCT-15ML-25-S
Peptone	FBIS SRCAMB	M030/O61
Phosphate buffered saline	Medigen	PBS500
Temperatutre and humidity datalogger Ecklerk-M-11	Relsib		Waterproof datalogger